CN103103180A - 一种从土壤中分离纯化大片段dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及土壤微生物、生物化学及分子生物学领域，特别是从各种土壤中间接分离纯化土壤微生物30kb以上大片段DNA用于构建宏基因组文库，或者分离土壤微生物基因蔟等。本发明针对目前利用间接法从土壤中分离微生物细胞并获得满足于各种分子生物学研究等所需要高纯度的大片段土壤DNA非常困难这样的需要进行的，并提供了一种满足获得高纯度、片段大的提取土壤微生物DNA的高效方法。

Description

一种从土壤中分离纯化大片段DNA的方法

技术领域

本发明涉及土壤微生物、生物化学及分子生物学领域，特别是从各种土壤中间接分离纯化土壤微生物30kb以上大片段DNA用于构建宏基因组文库，或者分离土壤微生物基因簇等。 

技术背景

土壤微生物是最有价值的天然产物来源，它们能提供了许多工业上十分重要的抗生素以及生物催化剂。各种微生物都有惊人的产生多样化次级代谢产物的能力。Hammond估计地球上的微生物物种多达16×10⁹，广泛分布于各种生态系统中，其中，土壤无论从微生物数量和种类上都是首屈一指的生境。有人用科学的方法估计1克土壤中约有大于10000种不同的微生物，因此，土壤是微生物的大本营。但是，运用现有的技术，只有0.2％～2％的土壤微生物是可培养的，因此土壤中孕育着大量未被开发的生物基因资源。 

随着基因组技术的发展，人们开始用分子生物学的方法来研究微生物间的进化关系和遗传信息的功能关系。环境基因组又称多源基因组或宏基因组，是指从环境中提取总的DNA，对其进行遗传学和功能学的研究。优点是不但可以原始地反映环境样品中所有生物的遗传多样性，避开难培养这一技术瓶颈，而且可以把细胞外的DNA一并研究。通过环境基因组的方法可以获得越来越多的DNA序列，且大都是新颖的未被纯培养微生物的序列。运用环境基因组序列不但可以使我们逐渐了解微生物群落功能的复杂性，以及微生物间的相互作用关系，而且可以使我们深入了解未被纯培养微生物的生理和生态特征。研究药物发现相关的新颖基因，自然也要把目标锁定在环境基因组中编码新颖次级代谢产物 的基因上。 

与其他基因工程技术不同，土壤环境基因组技术所需要的DNA片段不是来自已知菌中已熟知的基因片段或基因簇，而是来自完全未知的土壤样品中，对其可能具有的潜在功能也并不知晓。在土壤总DNA中，编码次级代谢产物的基因经常是成簇存在的，与同一个次级代谢产物相关的基因的生物合成区域和调节区域经常是紧密相连的。这些相连的基因使得克隆到载体中整个次级代谢产物途径基因是一个连续的片段。在药物发现中，生物合成基因和抗性基因也是连在一个片段上的，对于有毒的代谢产物，宿主可以通过共表达的抗性基因带来的抗性机制来避免毒性。这一特点不但简化了对外源片段进行剪切和修饰程序，而且使重组子的筛选更加方便，无疑为功能基因的克隆和表达提供了便利。 

因此，从土壤中提取和纯化微生物的总DNA是关键性的第一步，因为DNA的纯度和片段的大小直接决定了后续基因操作能否顺利进行。用限制性内切酶部分降解从土壤中纯化后的环境基因组DNA。典型大小片断的选择是通过脉冲场凝胶电泳完成，待酶切的DNA片段大小需要比插入片段至少长3倍，即如果需要较大的插入片段(＞100kb)，就需要几百kb的DNA，但如此长的DNA极易断裂，所以需要使用新的方法获得能满足研究所需要的土壤大片段DNA。 

从土壤中分离提取DNA需要体现完整的基因多样性，其方法主要有两种：(1)对土壤样品中的原位细胞进行裂解后直接提取核酸物质，然后对DNA进行纯化；(2)从土壤样品中分离细菌细胞，再对细胞进行裂解和纯化。在多数研究中，前一种方法都不能产生长度＞20kb的DNA片段，如果用于构建插入片段较长的环境基因组文库，这种方法显然不足以胜任。但使用第二种方法往往由于土壤性质和结构、含水量、pH、气候变化以及生物活性等各种因素的影响，增加了微生物生存环境的复杂性。微生物分布于土壤颗粒小团聚体内或者大颗粒内部小 团聚体中，并通过静电引力、范德华力、氢键等微生物细胞与土壤颗粒之间的相互作用牢固的结合在土壤颗粒上，使得难以获得完整的土壤微生物细胞。 

本发明就是针对如何使用间接法从土壤中分离微生物细胞并获得能满足于各种分子生物学研究所需要的高纯度的大片段土壤DNA这样的需要进行的。 

发明内容

目前对土壤总DNA的提取方法有很多报道，主要可分为直接法(细胞原位裂解)和间接法(细胞回收)两类。直接法是直接对样品进行裂解后获得DNA并进行纯化；而间接法是先将微生物与土壤颗粒分离，随后提取回收细胞中的DNA。在DNA得率、纯度、代表性等方面，两种方法各有优势。直接法获得的DNA产量比较高，并且偏嗜程度低，可以用于检测环境中较为稀有的微生物。但这种方法对DNA造成剪切使片段变小，而且包含的杂质含量很高，如果再通过纯化的步骤是完全可以满足分子生态研究的一些需要的，但是根本不可能用于构建土壤宏基因组文库。间接提取法，即从土壤中回收细胞的方法最早是Faegrietal提出的，基于①充分分散土壤颗粒；②利用菌体细胞和土壤颗粒的浮力密度、沉降速率不同，离心分离；③细胞裂解；④DNA纯化等几个原则和步骤。间接法可以成功的回收48kb以上的大片段DNA且纯度很高，但在构建土壤宏基因组文库等一些科学实验中，我们提取的大片段DNA往往必须同时满足以下几个要求：①片段要在300kb以上，因为相同的克隆数中片段大所构建的文库包含的信息内容才大，才能够多的涵盖土壤中遗传信息的内容；②纯度高，尤其是不含或者少含抑制后继实验中酶活力的物质(土壤中的这类物质很多)；③回收的DNA中尽可能的包含土壤中所有微生物的遗传信息。目前，间接法也有很多种，比如CsCl-EB密度梯度离心法，Nycodenz、Percoll、Metrizamide等常见的密度 梯度离心介质法等。现在的问题是：各种间接法都存在耗时长，产量比较低，操作很难掌握弊端，基本不能同时满足以上构建土壤宏基因组文库所必须的三个条件。 

针对这个现状，本研究根据实际操作经验总结出一套详细的从土壤中获得能满足构建宏基因组文库大片段DNA的方法，同时指出每个关键步骤操作中的注意事项和原理供大家根据自己的实际需要参考。 

本发明提供了一种详细的间接法获得土壤大片段DNA的操作方法。 

本发明提供了每个关键步骤的注意事项和原理，可以根据土壤种类以及微生物数量适当调整分离方法和分离步骤。 

本发明提供了可根据实际需要更改操作步骤的原理和方法。 

具体地，提供了根据土壤特性适当调整分离土壤微生物的方法，可以获得土壤中大多数微生物，并浓缩到一定的浓度，可用于低熔点琼脂糖包埋等方法原位裂解，经过脉冲电泳回收得到大片段DNA。 

本发明首先将土壤样品过筛并溶解降低微生物与土壤颗粒之间的附着力后，通过差速离心或者密度剃度离心获得土壤中的微生物个体，然后再调整成适当浓度的微生物溶液用低熔点琼脂糖包埋并用溶菌酶和蛋白酶K等将细菌等微生物裂解并降解组蛋白等，使细菌等微生物的基因组DNA裸露出来，最后通过脉冲等电泳方式使各种大小的大片段DNA迁移出来，根据需要回收适合自己下一步工作的大片段DNA分子。 

本发明提供了每个关键环节的详细步骤和原理，并提出了可以调整方案的建议和方法。首先指出了微生物和土壤颗粒的分离是成功分离土壤大片段的第一个关键环节，并提供了可行的几种方法和步骤。其次指出了差速离心或剃度 离心过程中的注意事项，指明了离心速度和土壤溶液浓度之间的关系影响到土壤微生物的回收效率。低熔点琼脂糖包埋和原位裂解也是关键环节，指出了包埋的浓度和原位裂解的注意事项和可行的方法。 

本发明提供了脉冲电泳或者普通电泳获得适当大小DNA片段的方法。脉冲电泳可以获得超大DNA片段，并可以适当酶切后获得具有特定酶切端口的适合连接到载体的大片段DNA。普通电泳步骤相对简单，但获得的片段较小，也可以满足一些后继的工作需要。 

具体地，本发明提供的获得土壤大片段DNA的方法如下： 

1.本发明阐述了从土壤中分离细菌等微生物的方法步骤： 

根据实际的操作并结合已经公开的方法总结出了切实可行的一套高效分离土壤微生物的方法。能得到土壤中大多数微生物菌体，去除大多数会影响后继工作的土壤腐殖质、腐殖酸、重金属离子等。 

2.低熔点琼脂糖包埋、原位裂解： 

调整获得的土壤微生物浓度，用低熔点琼脂糖包埋并制成一定大小的胶条后用溶菌酶和蛋白酶K等将细菌等微生物裂解并降解组蛋白等，使细菌等微生物的基因组DNA裸露出来并不受外力剪切而断裂。 

3.电泳回收大片段DNA： 

将包含有大片段DNA的低熔点琼脂糖的胶条通过脉冲场电泳或者普通场电泳迁移出来，并根据需要回收适当大小的DNA片段。 

依据本发明提供的原理和通过实施本发明的具体方法并结合需要调整操作步骤，可以达到以下预期效果： 

1.提供了一种从各类土壤中间接法获得土壤中微生物大片段DNA的方法， 获得的DNA可以用于构建宏基因组文库和分离各种基因的后继分子生物学等的科学研究工作。 

2.本发明提供的获得土壤大片段DNA的方法与常规方法相比具有详细、可操作性强、操作步骤依据需要可调等特点。 

附图说明

图1：脉冲电泳分离土壤微生物大片段DNA的效果图：A为脉冲电泳分子量对照，B为包埋低熔点琼脂糖胶块，箭头所指为对应的分子量大小。 

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。 

实施例一：土壤微生物的获得 

1.采集新鲜的土壤样品过80目铜筛。 

2.称取100克过筛的土样并加入250毫升冰预冷的蒸馏水，在冰浴下用旋涡搅拌器搅拌3次，每次30秒，间隔停顿30秒。 

3.700-1000转/分钟，4摄氏度离心5分钟，收集上清夜。 

4.沉淀在经两次重悬并离心，合并所有上清夜。 

5.10000转/分钟，4摄氏度离心5分钟，弃上清夜，沉淀用10毫升磷酸缓冲液重悬。 

6.将10毫升Nycodenz(1.3克/毫升)溶液小心加入土壤悬液底部，10000转/分钟，4摄氏度离心30分钟。 

7.小心收集Nycodenz-土壤悬液之间的白色细胞层，加入4倍以上体积的磷酸缓冲液10000转/分钟，4摄氏度离心20分钟去除含有Nycodenz的上清夜。 

注意事项： 

1.必须采集新鲜的土壤样品用于分离土壤微生物。未经与空气充分接触而丧失部分水分和在分离微生物前未破坏土壤微环境的土壤比较适合作为样品。主要原因是微生物与土壤之间的附着力是决定回收效率的关键因素，完全或者部分风干的土壤中微生物与土壤颗粒的附着力大大增加，往往导致在回收微生物的过程中，微生物与土壤颗粒一起因为离心而沉淀下去。其次，土壤在被扰动后土壤中的微生物失去微环境的屏蔽保护作用，进而原生动物大量吞食细菌等微生物导致在微生物在回收之前大量损失。 

2.依据土壤种类的不同，只要是可以降低微生物与土壤颗粒之间黏着力或者提高土壤微生物回收效率，蒸馏水可以被磷酸缓冲液、Tris缓冲液、TENP缓冲液、生理盐水、或者0.1％SDS溶液等代替。不同的土壤其粘性、pH值、有机质的含量、腐殖质的含量等有很大的差异，微生物与土壤之间的黏着力是由土壤的性质和微生物表面分泌的物质决定的。各种缓冲液代替蒸馏水是为了保证微生物不会因为在分离过程中环境的土壤改变而导致细胞破裂死亡，或者直接利用离子之间的作用弱化微生物与土壤颗粒之间的黏附力。 

3.离心转速的选择可以根据土壤颗粒大小调整。粘性较大的土壤颗粒较小，可以选择较低的转速，因为转速高了导致大量土壤颗粒沉积而达不到分离微生物的目的。 

4.Nycodenz溶液的使用。在添加Nycodenz溶液的时候一定不能扰动Nycodenz溶液和土壤溶液之间的分界线，具体操作的时候可以使用移液管等吸取适量的Nycodenz溶液，然后将移液管小心插入土壤溶液的底部后缓慢将Nycodenz溶液释放出来。离心结束不要使用阻力，让转头自己停下来。小心吸去上层溶液后再回收白色细胞层。Nycodenz价格昂贵，如果土壤颗粒较大或者腐殖质等物质较少，也可以只用差速离心的方式直接分离，省去Nycodenz的过 程。 

实施例二：微生物细胞的低熔点琼脂糖包埋 

1.配置1％的低熔点琼脂糖溶液，所用溶液种类与重悬分离获得的微生物种类容易一致，加热溶解后保存在45摄氏度水浴中备用。 

2.用血清计数板等方法将获得的土壤微生物菌液调整浓度，达到2*10⁸个菌体/毫升，将上述1％的低熔点琼脂糖溶液与调整好浓度的菌液等体积混合，并快速灌装入2毫米*1.5毫米*5毫米的胶条模块中，将模块置于4摄氏度冷却后取出保存与含有1微摩尔浓度的EDTA溶液中备用。 

注意事项： 

1.将菌液调整到适合的浓度。浓度太高不利于微生物的原位裂解，浓度太低不能回收到大量的DNA。调整的方法可以使用血清计数板或者细胞流量计等工具。 

2.胶条的制作。厚度和宽度比较重要，长度可以根据操作的方便调整。太厚或者太宽不利于被固定的微生物细胞与溶菌酶的充分接触。 

实施例三：微生物的原位裂解 

1.取出在1微摩尔浓度的EDTA溶液中备用的胶条，放置于4摄氏度预冷的蒸馏水中浸泡，同时缓慢的晃动，当中更换蒸馏水3次，最后一次用裂解液浸泡。 

2.取出胶条后用含有1毫克每毫升溶菌酶的裂解液于37摄氏度反应1小时，同时缓慢的晃动，裂解液的体积至少是胶块的10倍。期间可以补加溶菌酶或者更换含有溶菌酶的裂解液。 

3.被裂解的胶条取出后用4摄氏度预冷的蒸馏水轻轻冲洗几次后再用蛋白 酶溶液浸泡一段时间。然后用至少4倍于胶块体积含有1毫克每毫升蛋白酶的蛋白酶溶液于55摄氏度降解蛋白质16小时以上，同时缓慢的晃动。期间可以补加蛋白酶或者更换含有蛋白酶的蛋白酶溶液。 

4.反应完后取出胶条储存于4摄氏度pH8.0的50毫摩尔EDTA溶液中备用。 

注意事项： 

1.每一步骤中缓慢的晃动是为了提高酶与大分子之间的接触机会，加速反应的过程，但是一般不会超过40转每分钟。转速的高低和反应液的体积成正比，只要不会使转动的胶块因碰撞或者摩擦破裂就可以。 

2.溶菌酶的裂解液配方：10mM Tris(pH 8.0)，50mMNaCl，0.1％Sarkosyl，0.2％sodium deoxycholate。蛋白酶溶液配方：1％Sarkosyl，0.5M EDTA。 

3.溶菌酶的裂解液和蛋白酶溶液的配制可以依据所使用溶菌酶和蛋白酶种类特点调整，只要是能更好的发挥所使用酶的裂解微生物细胞和降解蛋白质的功能就可以。 

实施例四：大片段DNA的电泳回收 

1.以常规的方法制胶，用0.5×TBE制备一块1％的琼脂糖凝胶。 

2.以一干净的解剖刀，切下胶孔之间的琼脂糖凝胶，从而得到一个大的上样孔，必须平整。 

3.向加样孔中加入少量熔化的琼脂糖凝胶以完全密封加样孔的底部，让胶凝固。 

4.将已经消化的胶条块从反应管中转移到加样孔中，压紧胶条。 

5.在大加样孔旁边的泳道中加入PFGEλladder。 

6.以熔化的胶封住所有加样后的孔，使之凝固。 

7.将胶从灌制架上取下，除尽底板上的胶。 

8.将胶放入脉冲电泳槽中，电泳槽内装入已经冷却到12℃的新鲜0.5×TBE。 

9.以下列参数跑胶：6v/cm，included angle120，initial switch time 1秒，final switch time 40秒，ramping线性，18-20hr，通常是跑胶过夜。 

10.将胶块的两边切下。 

11.对两块边胶进行EB染色30min，放于紫外灯箱中打开电源观察。 

12.在两个边条的计划回收大小片段前后处各作一小切口标记。 

13.关闭电源，在工作台上放一干净的塑料垫片，将未染色的中心条带放在两个边胶条之间以便重新拼胶，切下含有需要大小片段的胶块。 

注意事项： 

1.注意不要将中心胶条暴露于紫外灯下以免损伤DNA。 

2.可以根据需要将各种大小不同的DNA片段都回收，不一定只是含有100-350kb的胶块。 

3.在电泳回收前也可以用适量浓度的限制性内切酶切出特定的切口，然后电泳回收后直接连接到载体构建宏基因组文库。 

Claims (4)

1.一种用于从土壤中分离大片段DNA的方法。首先分离获得土壤微生物细胞，然后利用低熔点琼脂糖包埋固定，裂解微生物细胞后脉冲电泳分离各种大小的DNA片段，最后回收所需要大小的DNA片段。

2.一种根据权利要求1的用于分离纯化土壤微生物细胞的方法，其特征在于弱化微生物细胞与土壤颗粒之间的粘连，提高回收土壤微生物细胞的效率，其中各种溶液试剂的选择在于依据土壤特性的不同而随之调整。

3.一种根据权利要求1的用于固定、裂解土壤微生物细胞，降解细胞中蛋白质使微生物核酸裸露出来便于电泳分离的方法，其特征在于去除能抑制溶菌酶和蛋白酶作用的各种抑制物，提高DNA回收效率的方法运用。

4.一种根据权利要求1的用于回收大分子DNA的方法，其特征在于一次电泳可以同时大量回收分子量不同的各种DNA分子。

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