CN111909983A - 一种适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法及应用 - Google Patents
一种适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111909983A CN111909983A CN202010863929.2A CN202010863929A CN111909983A CN 111909983 A CN111909983 A CN 111909983A CN 202010863929 A CN202010863929 A CN 202010863929A CN 111909983 A CN111909983 A CN 111909983A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- library
- sequencing
- throughput sequencing
- microbial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 27
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 23
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 20
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 48
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 32
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 29
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 21
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 11
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 claims description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 6
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 5
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 4
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003287 bathing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000011243 crosslinked material Substances 0.000 claims description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 13
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 9
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N (4R,5S)-dethiobiotin Chemical group C[C@@H]1NC(=O)N[C@@H]1CCCCCC(O)=O AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种适用于微生物宏基因组学Hi‑C高通量测序建库方法及应用,所述测序建库方法包括以下步骤:1)取宏基因组样本进行微生物与杂质分离,甲醛交联;2)细胞染色质经酶切打断获得酶切后物料;3)对所述酶切后物料进行末端补平;4)进行DNA细胞核分子内连接;5)去除未连接的末端生物素,获得纯化的DNA,经片段化、末端修复与加A并与接头连接;6)进行DNA目的片段分选;7)生物素捕获目的片段,并进行文库扩增和测序。本发明通过微生物与环境杂质的分离,富集复杂环境中的微生物,使得宏基因组数据分析不再限制为单一物种,可对复杂环境各种微生物进行聚类分析,实现了微生物宏基因组学的的Hi‑C高通量测序建库,扩大了Hi‑C技术的适用范围。
Description
【技术领域】
本发明涉及分子生物学技术领域,更具体地,涉及一种适用于微生物宏基因组学的Hi-C高通量测序建库方法。
【背景技术】
染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture,3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术,可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息,此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获,并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。近年来,在第二代测序技术的迅速发展下,由3C技术衍生出来的Hi-C则是以整个细胞核为研究对象,研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。在Hi-C技术中,以整个细胞系为研究对象,利用高通量测序技术,结合生物信息学方法,研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系;通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获,获得高分辨率的染色质三维结构信息。Hi-C技术应用十分广泛,贯穿当今生命科学研究的前沿及热点领域。现有的Hi-C技术对构建3C文库的过程进行了稍许修改。具体的,在连接前,使用生物素标记的核苷酸填充酶切产生的粘性末端。平末端连接后,提取DNA并对DNA进行随机打断,最后捕获生物素标记了的DNA片段以确保用以后续分析的数据更多的来自真实的互作。将通过第二代测序得到的DNA序列对比对到参考基因组后,如果一对序列对应于不同的n段酶切片段,那么就认为这两个片段之间有n次相互作用,从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间连接频率的矩阵。
常规的Hi-C高通量测序建库以细胞系作为研究对象,其染色质比较单一,更容易获得比较好的结果,但是限制了其使用范围,距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远。如原核生物相较于真核生物染色质上结合的蛋白要少得多,现有适用于真核生物的Hi-C建库方法无法获得互作片段从而并不适用于原核生物。宏基因组是研究微生物群落的有效工具,但其难以将序列“归类”到物种和菌株水平。与Hi-C技术应用到真核生物染色体水平参考基因组辅助组装原理类似,Hi-C技术可运用到宏基因组的组装结果的聚类上,将宏基因组组装序列聚类物种和菌株水平:与不同细胞(微生物)相比,来源于同一个细胞(微生物)内的DNA分子互作更强,基于此原理可将来自于同一种微生物的序列聚类到同一个族群中,并对族群进行物种鉴定。
中国专利公开文件CN109055491A、CN109056078A分别公开了适用于植物、细菌的Hi-C高通量测序建库方法。通过优化灭活条件的方法,实现了细菌基因组的Hi-C建库;通过分离收集细胞核的方法,优化了植物Hi-C建库的结果。但是对于复杂自然环境内的微生物群体,普通针对单个细胞的建库方案肯定是不行的。首先,环境微生物含有复杂的环境杂质,包括但不限于泥沙、盐、动植物及微生物的残留物,需要分离出较为纯净的微生物才能用于建库;其次,环境微生物是一系列复杂的细菌、真菌的集合,分析单一物种的Hi-C程序是完成不了复杂菌群的Hi-C数据,需要先将物种聚类之后再进行后续分析。
因此有必要开发一种适用于微生物宏基因组学的的Hi-C高通量测序建库方法。
【发明内容】
针对现有技术中存在的问题,本发明提出了一种适用于微生物宏基因组学的Hi-C高通量测序建库方法,实现微生物宏基因组学的Hi-C高通量测序建库,扩大了Hi-C技术的适用范围。
为了实现上述目的,本发明公开了一种适用于微生物宏基因组学的Hi-C高通量测序建库方法,包括以下步骤:
1.取宏基因组样本用PBS缓冲液洗涤,添加LB培养基并自然沉降,并离心对微生物分离;
2.对分离后的微生物进行甲醛交联;
3.用液氮研磨和溶菌酶并行裂解交联后的物料,使裂解细胞释放细胞染色质;细胞染色质经酶切打断获得酶切后物料;
4.用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端补平,获得末端补平后DNA;
5.进行DNA细胞核分子内连接;
6.去除未连接的末端生物素,获得纯化的DNA,建库并获得DNA测序文库;
7.进行DNA目的片段分选;
8.基于生物素捕获,获得目的片段,并进行文库扩增和测序;
其中,所述宏基因组样本取自新鲜土壤、肠道微生物、海洋或河流沉积物中的一种。
进一步地,所述步骤1具体为:取1g宏基因组样本用10mL的1×PBS缓冲液清洗,然后添加1mL的LB培养基,自然沉降30min,吸取上层溶液,500g RT离心5min除杂,再吸取上层溶液,12000g RT离心5min,吸弃上清后获得分离的样本;
进一步地,所述步骤3具体为:
1)准备研钵,纯水洗净,使用锡箔纸包裹,倒入酒精,烧5min,室温放凉,研钵中加入液氮预冷,将保存的细胞倒入盛有液氮的研钵中,迅速研磨至粉末状态;
2)取1管样本加入90μL TE buffer,10μL溶菌酶,充分混匀,37℃温浴20min;
3)2000g,4℃离心5min,去上清,使用500μL 1×CutSmart重悬;
4)2000g,4℃离心5min,去上清,通过添加500μL(含终浓度0.3%SDS)1×CutSmart每管溶解染色质,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫;
5)65℃孵育10min,并立即放置冰上,瞬时离心以移除管盖液体;
6)中和SDS:添加75μL的20%Triton X-100至终浓度3%,重悬细胞碎片并避免形成气泡,37℃950rpm震荡15min;
7)2000g,常温离心5min,去上清,加入500μL 1×CutSmart重悬;
8)每管加入10μL限制性内切酶(Sau3AI,5000units/mL),900rpm 37℃酶切1h。
进一步地,所述步骤4为:2000g离心5min,弃上清;然后按照如下体系补平末端并插入生物素碱基:10×NEBuffer2.1 12μL、10mM dGTP 1.8μL、10mM dTTP 1.8μL、10mM dATP1.8μL、5mM biotin-14-dCTP 3.6μL、5U/μL Klenow polymerase 3μL、纯水96μL;加入120μL补平体系于每个Hi-C反应,混匀后,37℃孵育1h;然后65℃20min灭活Klenow,迅速置于冰上;
进一步地,所述步骤5为:按如下连接缓冲液进行DNA分子内连接处理:10%TritonX-100 100μL、10×T4 ligation buffer 100μL、20mg/mL BSA 5μL、5U/μL T4 DNA ligase10μL、纯水655μL;然后向每个Hi-C反应体系加入连接缓冲液,轻柔颠倒混匀;16℃孵育连接反应4h,每小时颠倒混匀;
进一步地,所述步骤6中去除未连接的末端生物素的去末端体系包括:Hi-C DNA、10×NEBuffer2.1、10mM dATP、10mM dTTP、3U/μL T4 DNA Polymerase和水;
进一步地,所述步骤7中DNA目的片段分选采用Ampure XP beads试剂盒;
进一步地,所述步骤8中生物素捕获采用Streptavidin C1,Thermo Fisher试剂盒。
本发明还一个目的在于提供上述高通量测序建库方法的在分析微生物多样性中的应用。
进一步地,所述应用中,分析微生物多样性方法包括:基于本发明提供的微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法获得的测序数据进行处理,然后进行数据分析获得生物多样性数据;
进一步地,所述应用中,分析微生物多样性方法中数据处理步骤为,对微生物宏基因组文库测序经质控得到的clean data使用ICE3软件对数据进行迭代比对,并进行噪音reads过滤。
相比现有技术,本发明的有益效果为:
1.本发明通过设计合适的微生物与环境杂质分离的方法,富集复杂环境中的微生物,去除了环境杂质对Hi-C实验的影响,建立并获得了合格的高通量测序文库;
2.本发明通过改变软件算法,提升了有效数据率,使得宏基因组测序数据分析不再限制为单一物种,可以对复杂环境各种微生物进行聚类分析,实现了微生物宏基因组学的Hi-C高通量测序建库,扩大了Hi-C技术的适用范围。
【附图说明】
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库总流程图;
图2为微生物宏基因组Hi-C聚类原理图;
图3A为鉴定土壤微生物宏基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶的电泳图谱,图3B为鉴定肠道微生物宏基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶的电泳图谱;
图4A为土壤微生物文库检测大小分布图;
图4B为肠道微生物文库检测大小分布图;
图5为土壤微生物宏基因组聚类结果构建互作图;
图6为土壤微生物宏基因组所得物种分布图;
图7为肠道微生物宏基因组聚类结果构建互作图;
图8为肠道微生物宏基因组所得物种分布图。
【具体实施方式】
以下实例用于说明本发明,但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下,对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
本发明提供的一种适用于微生物宏基因组学的的Hi-C高通量测序建库方法,通过设计合适的微生物与环境杂质分离的方法,富集复杂环境中的微生物,对微生物进行预处理、甲醛交联、裂解细胞释放染色质,再经消化染色质、生物素标记、末端连接、文库构建、捕获目的片段与扩增等步骤,实现微生物宏基因组学的的Hi-C高通量测序建库,具体宏基因组学Hi-C高通量测序建库总流程图如附图1所示;基于聚类原理,对微生物宏基因组学的的Hi-C高通量测序数据分析获得微生物多样性数据,宏基因组Hi-C聚类原理图如附图2所示。
实施例1
本实施例以土壤微生物为研究对象,进行宏基因组学Hi-C高通量测序建库并分析,具体实验过程如下:
1.甲醛固定
1)取新鲜土壤/肠道微生物/海洋或河流沉积物等宏基因组样本1g,加入10mL的1×PBS充分混匀;
2)加入1mL的LB培养基混匀,让细菌有充分的营养保证不死;
3)垂直放置离心管,自然沉降30min,让大块砂石沉在下层,细菌有活力会游走在上层溶液中,吸取上层溶液至一新离心管内;
4)500g RT离心5min,吸取上层溶液至一新离心管内;
5)12000g RT离心5min,吸弃上清;
6)加入5mL 1×PBS,轻微吹打重悬细胞;
7)加入405μL新鲜的37%甲醛(甲醛终浓度3%),颠倒混匀
8)室温摇晃交联30分钟,再4℃摇晃交联30分钟;
9)加入550μL 1×PBS配制的2.0M甘氨酸;
10)4℃摇晃15分钟终止交联;
11)2000g 4℃离心5min,吸弃上清;
12)3mL预冷1×PBS重悬细胞,每1mL样品分装于一个1.5mL离心管中,4℃2000g离心5min,吸弃上清;
13)交联好的组织在液氮中速冻,置于-80℃保存,可干冰运输。
2.裂解酶切
1)准备研钵,纯水洗净,使用锡箔纸包裹,倒入酒精,烧5min,室温放凉,研钵中加入液氮预冷,将保存的细胞倒入盛有液氮的研钵中,迅速研磨至粉末状态;
2)取1管样本加入90μL TE buffer,10μL溶菌酶(50mg/mL,88015U/mg Ready-lysozyme),充分混匀,37℃温浴20min;
3)2000g,4℃离心5min,去上清,使用500μL 1×CutSmart重悬;
4)2000g,4℃离心5min,去上清,通过添加500μL 1×CutSmart(含终浓度0.3%SDS)每管溶解染色质,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫;
5)65℃孵育10min,并立即放置冰上(长时间高温会解交联),瞬时离心以移除管盖液体;
6)中和SDS:添加75μL的20%Triton X-100至终浓度3%,重悬细胞碎片并避免形成气泡,37℃950rpm震荡15min;
7)2000g,常温离心5min,去上清,加入500μL 1×CutSmart重悬;
8)每管加入10μL限制性内切酶(Sau3AI,5000units/mL),900rpm 37℃酶切1h。
3.末端标记
1)2000g离心5min,弃上清;
2)补平末端并插入生物素碱基,生物素补平体系如表1所示;
表1:
3)加入120μL补平体系于每个Hi-C反应,混匀后,37℃孵育1h;
4)65℃20min灭活Klenow,迅速置于冰上;
4.分子内连接
1)DNA分子内连接处理,连接缓冲液如表2所示;
表2:
2)向每个Hi-C反应体系加入连接缓冲液,轻柔颠倒混匀;
3)16℃孵育连接反应4h,每小时颠倒混匀。
5.解交联
参考DNeasy Blood&Tissue Kit操作说明,修改其中部分步骤进行。
1)Hi-C连接产物离心弃上清加入180μL ATL和20μL Proteinase K至样品管中,56℃解交联2h,过程中颠倒离心管2-3次,混合样品;
2)加入200μL缓冲液AL充分混匀,56℃孵育10min,过程中颠倒离心管2-3次,混合样品;
3)加入200μL 96-100%乙醇,充分混匀;
4)移取650μL混合液至过滤柱DNeasy Mini Spin Column中,置于一新的2ml离心收集管上;
5)6000g,离心1min,弃掉离心液体;
6)将过滤柱放置在一新的2ml离心收集管上,加入500μL AW1,6000g,离心1min,弃掉离心液体和收集管;
7)将过滤柱放置在一新的2mL离心收集管上,加入500μL AW2,20000g,离心3min,弃掉离心液体;
8)20000g离心1min,弃掉离心液体和收集管;
9)将过滤柱置于一新的1.5ml或2ml离心收集管上;
10)加入50μL Buffer AE洗脱DNA,室温孵育1min,6000g,离心1min;
11)为增加DNA回收量,再次加入50μL Buffer AE洗脱DNA,室温孵育1min,6000g,离心1min;
12)Qubti测定浓度;
13)通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果。琼脂糖凝胶电泳图谱如附图3A所示,图中宏基因组的解交联电泳条带有降解和拖尾,由于宏基因组含有各个生理时期的菌体,解交联DNA有微弱降解属于正常现象,DNA片段整个下移;连接效果明显,DNA条带上移;说明酶切连接均达到预期效果,可以进行下步实验。
6.末端去生物素
1)取1μg样品用于末端去生物素(若不足1μg则全部取用86.67μL),按表3的体系进行;
表3:
1)关闭热盖,12℃反应4h,2μL 0.5M EDTA终止反应;
2)提前半小时取出VAHTS DNA Clean Beads,平衡至室温;
3)将100μL去末端体系用1×beads回收DNA;
4)吸取100μL VAHTS DNA Clean Beads(1×Beads)至上述100μL产物中,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打10次充分混匀,旋转混匀仪上室温孵育5min;
5)将离心管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约3min),小心移除上清,保留磁珠;
6)保持1.5mL离心管始终置于磁力架中,加入200μl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec,小心移除上清;
7)重复上一步步骤,总计漂洗两次;
8)保持1.5mL离心管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠1min至无乙醇残留;
9)加入15μL水洗脱,充分混匀,旋转混匀仪上室温孵育5min,将1.5mL离心管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3min),小心移取15μL上清至新1.5mL离心管中,切勿触碰磁珠;
10)使用Qubit定量。
7.Illumina试剂盒建库,目的片段的片段化、末端修复与接头连接
1)DNA片段化、末端修复与加A,参照表4中的体系依次加入试剂;
表4:
反应体系37℃孵育10min,65℃孵育30min,4℃保温;
2)接头连接
参照表5中的体系依次加入试剂;
表5:
混匀,20℃孵育15min后,加入3μL USER酶,37℃孵育15min。
8.Ampure XP beads片段分选
1)加入28.5μL 0.1×TE补足体系至100μL;
2)加DNA连接产物的0.25倍体积磁珠溶液(25μL)到上一步100μL DNA连接产物中;振荡数秒混匀,室温孵育5min;
3)瞬时离心,将离心管放在磁力架上静置2min,将上清转移至一新的1.5mL离心管中,丢弃磁珠;
4)加DNA连接产物的0.1倍体积磁珠溶液(10μL)到上一步上清中;振荡数秒混匀,室温孵育5min;
5)瞬时离心,将离心管放在磁力架上静置2min,吸弃上清,保留磁珠;
6)离心管保持在磁力架上,加入1mL的75%乙醇清洗磁珠,弃乙醇;
7)重复上一步乙醇清洗磁珠步骤一次;
8)打开管盖,室温风干30s;加入52μL去离子水,振荡将磁珠重新混悬,室温孵育5min;
9)瞬时离心,将离心管放到磁力架上静置1min,吸取50μL上清转移至新离心管中,若感觉吸到磁珠,可再用磁力架吸附一次,保证磁珠完全去除,文库可进行下步操作或置于-20℃冰箱保存。
9.生物素捕获
1)配置Streptaridin Beads表6中的结合液及表7中的洗涤液;
表6:1×TWB(Tween Washing Buffer)
表7:2×BB(Binding Buffer)
2)涡旋磁珠,取10μL加入1.5mL LoBind离心管中;使用100μL 1×TWB(TweenWashing Buffer)清洗,室温震荡3min;磁力架吸附磁珠,弃上清;
3)再次使用100μL 1×TWB清洗磁珠,室温震荡3min;磁力架吸附磁珠,弃上清;
4)50μL 2×BB(Binding Buffer)和50μL Hi-C DNA重悬磁珠;室温震荡15min;磁力架吸附磁珠2-3min,弃上清;
5)使用100μL 1×TWB清洗磁珠并转移至一新LoBind离心管中;磁力架吸附磁珠,弃上清;
6)重复2次1×TWB清洗磁珠;
7)加入25μL水,70℃温浴5min洗脱DNA,磁力架吸附,回收上清;
8)加入20μL水,70℃温浴5min洗脱DNA,磁力架吸附,回收上清;
9)总体积45μL,4μL用于跑圈,20μL用于PCR扩增,剩余21μL文库可于-20℃长期保存。
10.Illumina试剂盒扩增嵌合片段
1)将PCR仪设置如表8中的参数,并预热PCR仪;
表8:
2)参照如表9中的体系依次加入试剂;
表9:
3)将各个循环数分别取2.5μL电泳检测确定最佳循环数(推荐6,8,10,12个循环),使用最佳循环数重新PCR 50μL体系;
4)回收产物使用Agilent 2100对文库大小分布进行检测,文库大小合适分布均匀,可以进行高通量测序。
从图4A中可以看出,文库大小集中在400-600bp之间,与预期范围一致。
11.经高通量测序,对质控得到的clean data,使用ICE3软件对数据进行迭代比对,并进行噪音reads过滤,得到的如表10所示的结果。
表10:土壤宏基因组Hi-C数据分析结果
注:﹡为SE(Single End)数据,其它均为PE(Paired End)数据。Hi-C测序数据中主要reads类型包括,valid pair,single side,self circles,dangling ends及unmapped等类型。其中:valid pair是指符合Hi-C实验预期,由补平并携带生物素标记的酶切位点将基因组上不同位点DNA连接在一起形成的嵌合体DNA片段;single side是指,仅有一端序列可以唯一匹配到基因组上的DNA片段;self circles是指同一位点DNA环化连接形成的DNA,它主要由单一酶切片段两端相连接,经打断,捕获并测序产生;dangling ends是指双端均在同一位点的DNA片段,它源自未经过连接反应,最终却被捕获测序产生的数据;unmapped是指双端均无法唯一匹配到基因组上的DNA片段。在Hi-C分析中,仅valid pair可以反映基因组上位点与位点间的互作信息。因此,非重复的valid pair所占的比例是评估Hi-C文库质量的重要指标,一般我们认为30%以上合格,即以上得到的Hi-C文库质量合格。
对上述宏基因组聚类结果构建互作图谱(展示完整度不小于50%,污染度不大于10%的clusters中Size TOP10的clusters),结果如图5所示,符合互作规律,表明宏基因组Hi-C聚类结果良好。
土壤宏基因组的物种分布图如图6,我们图示了前30种菌种分布的情况,占菌种丰度比例的40%,剩余60%为丰度较低的菌种,前30种菌种代表了土壤微生物样本物种多样性和物种丰富度情况。
实施例2
本实施例以动物排泄物作为肠道微生物的研究对象,进行宏基因组学Hi-C高通量测序建库并分析,对肠道微生物样本进行同实施例1中预处理、甲醛交联、裂解细胞释放染色质,再经消化染色质、生物素标记、末端连接、文库构建、捕获目的片段与扩增等步骤,实现肠道微生物宏基因组学的的Hi-C高通量测序建库。
其中,通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果,琼脂糖凝胶电泳图谱如图3B所示,图中宏基因组的解交联电泳条带有降解和拖尾,由于宏基因组含有各个生理时期的菌体,解交联DNA有微弱降解属于正常现象,DNA片段整个下移;连接效果明显,DNA条带上移;说明酶切连接均达到预期效果。
图4B为本实施例对回收产物使用Agilent 2100对文库大小分布进行检测获得的分布图,文库大小合适分布均匀,可以进行高通量测序。
从图4B中可以看出,文库主峰在450bp,片段大小集中在350-550bp之间,与预期范围一致。
对上述文库进行高通量测序,对质控得到的clean data,使用DNA分析软件ICE软件(https://bitbucket.org/mirnylab/hiclib.)对数据进行迭代比对,并进行噪音reads过滤,得到的如表10所示的结果。对肠道宏基因组Hi-C数据测序分析结果如表11所示。
表11:肠道宏基因组Hi-C数据分析结果
注:﹡为SE(Single End)数据,其它均为PE(Paired End)数据。
以上获得的valid pair所占的比例大于50%,代表Hi-C文库质量非常高。
对上述宏基因组聚类结果构建互作图谱(展示完整度不小于50%,污染度不大于10%的clusters中Size TOP10的clusters),结果如图7所示,符合互作规律,表明宏基因组Hi-C聚类结果良好。
肠道宏基因组的物种分布图如图8所示,我们图示了前30种菌种分布的情况,占菌种丰度比例的40%,剩余60%为丰度较低的菌种,前30种菌种代表了肠道微生物物种多样性和物种丰富度情况。
因此,本发明提出的适用于微生物宏基因组学的Hi-C高通量测序建库方法,上述实施例实验结果说明,本发明通过设计合适的微生物与环境杂质分离的方法,富集复杂环境中的微生物,去除了环境杂质对Hi-C实验的影响,提升了有效数据率,对于复杂环境微生物的宏基因组Hi-C建库,有效数据率可达30%,甚至达78%,由于微生物基因组较小,测序数据20G左右即可满足环境微生物聚类分析需要。另外通过改变软件算法,使得宏基因组数据分析不再限制为单一物种,可以对复杂环境各种微生物进行聚类分析,从图5中可以看出,Top10聚类的方框清晰可见,表明聚类结果很好,此方法实现了微生物宏基因组学的的Hi-C高通量建库测序及数据分析,不在局限于单一物种,还可以用于复杂环境宏基因组,扩大了Hi-C技术的应用适用范围。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述,因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进,故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下,本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和这里示出与描述的图示示例。
Claims (10)
1.一种适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.取宏基因组样本用PBS缓冲液洗涤,添加LB培养基并进行自然沉降,然后离心对微生物进行分离;
S2.对分离后的微生物进行甲醛交联;
S3.用液氮研磨和溶菌酶并行裂解交联后的物料,使裂解细胞释放细胞染色质;细胞染色质经酶切打断获得酶切后物料;
S4.用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端补平,获得末端补平后DNA;
S5.进行DNA细胞核分子内连接;
S6.去除未连接的末端生物素,获得纯化的DNA,经片段化、末端修复与加A并与接头连接;
S7.进行DNA目的片段分选;
S8.基于生物素捕获,获得目的片段,并进行文库扩增和测序。
2.根据权利要求1所述的适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述步骤S1为:取1g宏基因组样本用10mL的1×PBS缓冲液清洗,然后添加1mL的LB培养基,自然沉降30min,吸取上层溶液,500g RT离心5min除杂,再吸取上层溶液,12000g RT离心5min,吸弃上清后获得分离的样本。
3.根据权利要求1或2所述的适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述步骤S1中宏基因组样本取自新鲜土壤、肠道微生物、海洋或河流沉积物。
4.根据权利要求1所述的适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述步骤S3为:
1)准备研钵,纯水洗净,使用锡箔纸包裹,倒入酒精,烧5min,室温放凉,研钵中加入液氮预冷,将保存的细胞倒入盛有液氮的研钵中,迅速研磨至粉末状态;
2)取1管样本加入90μL TE buffer,10μL溶菌酶,充分混匀,37℃温浴20min;
3)2000g,4℃离心5min,去上清,使用500μL 1×CutSmart重悬;
4)2000g,4℃离心5min,去上清,通过添加500μL 1×CutSmart每管溶解染色质,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫;所述Buffer含终浓度0.3%的SDS。
5)65℃孵育10min,并立即放置冰上,瞬时离心以移除管盖液体;
6)中和SDS:添加75μL的20%TritonX-100至终浓度3%,重悬细胞碎片并避免形成气泡,37℃950rpm震荡15min;
7)2000g,常温离心5min,去上清,加入500μL 1×CutSmart重悬;
8)每管加入10μL限制性内切酶,900rpm 37℃酶切1h;所述内切酶为Sau3AI,用量为5000units/mL。
5.根据权利要求1所述的适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述步骤S4为:2000g离心5min,弃上清;然后按照如下体系补平末端并插入生物素碱基:10×NEBuffer2.1 12μL、10mM dGTP 1.8μL、10mM dTTP 1.8μL、10mM dATP 1.8μL、5mMbiotin-14-dCTP 3.6μL、5U/μL Klenow polymerase 3μL、纯水96μL;加入120μL补平体系于每个Hi-C反应,混匀后,37℃孵育1h;然后65℃20min灭活Klenow,迅速置于冰上。
6.根据权利要求1所述的适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述步骤S5为:按如下连接缓冲液进行DNA分子内连接处理:10%Triton X-100 100μL、10×T4 ligation buffer 100μL、20mg/mL BSA 5μL、5U/μL T4 DNA ligase 10μL、纯水655μL;然后向每个Hi-C反应体系加入连接缓冲液,轻柔颠倒混匀;16℃孵育连接反应4h,每小时颠倒混匀。
7.根据权利要求1所述的适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述步骤S6中去除未连接的末端生物素的去末端体系包括:Hi-C DNA、10×NEBuffer2.1、10mM dATP、10mM dTTP、3U/μL T4 DNA Polymerase和水。
8.根据权利要求1所述的适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述步骤S7中DNA目的片段分选采用Ampure XP beads试剂盒;所述步骤S8中生物素捕获采用Streptavidin C1,Thermo Fisher试剂盒。
9.一种微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法在分析微生物多样性中的应用,其特征在于,所述分析微生物多样性包括采用如权利要求1-8任意一项所述微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法建立文库后,对所获得的文库进行测序,然后根据测序结果进行多样性分析。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述多样性分析包括对测序结果数据处理步骤:对微生物宏基因组文库测序质控得到的clean data使用ICE3软件对数据进行迭代比对,并进行噪音reads过滤,然后进行数据分析。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010863929.2A CN111909983A (zh) | 2020-08-25 | 2020-08-25 | 一种适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010863929.2A CN111909983A (zh) | 2020-08-25 | 2020-08-25 | 一种适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法及应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111909983A true CN111909983A (zh) | 2020-11-10 |
Family
ID=73278723
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010863929.2A Pending CN111909983A (zh) | 2020-08-25 | 2020-08-25 | 一种适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111909983A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113215141A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-08-06 | 华南农业大学 | 细菌hi-c基因组及质粒构象捕获方法 |
CN113528612A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-10-22 | 中国科学技术大学 | 用于检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C技术 |
CN116606910A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-08-18 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种适用于微生物群体的宏基因组GutHi-C建库方法及应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103103180A (zh) * | 2011-11-11 | 2013-05-15 | 新疆师范大学 | 一种从土壤中分离纯化大片段dna的方法 |
CN106471509A (zh) * | 2014-06-24 | 2017-03-01 | 巴斯德研究所 | 用于组装来自一个或多个生物体的染色体段的方法、设备和计算机程序 |
WO2017066907A1 (zh) * | 2015-10-19 | 2017-04-27 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 一种构建高可利用数据率的Hi-C文库的方法 |
CN107653243A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-02-02 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组dna的方法 |
CN109056078A (zh) * | 2018-09-18 | 2018-12-21 | 武汉菲沙基因信息有限公司 | 一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法 |
-
2020
- 2020-08-25 CN CN202010863929.2A patent/CN111909983A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103103180A (zh) * | 2011-11-11 | 2013-05-15 | 新疆师范大学 | 一种从土壤中分离纯化大片段dna的方法 |
CN106471509A (zh) * | 2014-06-24 | 2017-03-01 | 巴斯德研究所 | 用于组装来自一个或多个生物体的染色体段的方法、设备和计算机程序 |
WO2017066907A1 (zh) * | 2015-10-19 | 2017-04-27 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 一种构建高可利用数据率的Hi-C文库的方法 |
CN107653243A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-02-02 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组dna的方法 |
CN109056078A (zh) * | 2018-09-18 | 2018-12-21 | 武汉菲沙基因信息有限公司 | 一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
李君剑: "《矿区土壤微生物生态》", 31 May 2019, 中国矿业大学出版社, pages: 42 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113215141A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-08-06 | 华南农业大学 | 细菌hi-c基因组及质粒构象捕获方法 |
CN113528612A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-10-22 | 中国科学技术大学 | 用于检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C技术 |
CN113528612B (zh) * | 2021-07-08 | 2023-03-14 | 中国科学技术大学 | 用于检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C技术 |
CN116606910A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-08-18 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种适用于微生物群体的宏基因组GutHi-C建库方法及应用 |
CN116606910B (zh) * | 2023-07-21 | 2023-10-13 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种适用于微生物群体的宏基因组GutHi-C建库方法及应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111909983A (zh) | 一种适用于微生物宏基因组学Hi-C高通量测序建库方法及应用 | |
JP6324962B2 (ja) | 標的rna枯渇化組成物を調製するための方法およびキット | |
CN108624651B (zh) | 一种构建Ribo-seq测序文库的方法 | |
US8076070B2 (en) | Genome-wide chromosome conformation capture | |
CN113061648B (zh) | 一种采用Tn5转座酶辅助构建微量样品m6A修饰检测文库的方法及其应用 | |
CN102533956B (zh) | 一种提高原核生物转录组高通量测序效率的方法 | |
WO2017066907A1 (zh) | 一种构建高可利用数据率的Hi-C文库的方法 | |
CN106591285B (zh) | 一种构建高可利用数据率的Hi-C文库的方法 | |
CN111778563A (zh) | 细胞Hi-C测序文库的构建方法 | |
CN112481254B (zh) | 一步法去宿主dna并富集微生物的方法及试剂盒 | |
KR101913735B1 (ko) | 차세대 염기서열 분석을 위한 시료 간 교차 오염 탐색용 내부 검정 물질 | |
CN103695419B (zh) | 一种病毒核酸提取试剂 | |
CN117363750A (zh) | 一种可用于民猪选育的15k液相芯片制备方法及基因分型方法 | |
CN111500571A (zh) | 一种适用于Hi-C技术的真核生物DNA提取方法、漂洗液与应用 | |
CN111440843A (zh) | 一种利用微量临床穿刺样本进行染色质免疫共沉淀文库制备的方法及其应用 | |
CN113039283A (zh) | 分离和/或富集宿主源核酸和病原核酸的方法和试剂及其制备方法 | |
CN113215141A (zh) | 细菌hi-c基因组及质粒构象捕获方法 | |
CN113564227A (zh) | 基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法 | |
CN109881257A (zh) | 一种单条秀丽隐杆线虫转录组测序文库的构建方法及测序方法 | |
CN114410813B (zh) | 一种在全基因组水平鉴定植物基因组dna胞嘧啶四联体位点的方法 | |
CN111455021B (zh) | 去除宏基因组中宿主dna的方法及试剂盒 | |
CN118048436B (zh) | 用于微量细胞的靶向染色质互作捕获ULI-eHiChIP建库方法及应用 | |
CN111979226B (zh) | 一种可批量进行体外脱靶检测及sgRNA筛选的方法 | |
CN114231526B (zh) | 一种高丰度粪便微生物基因组dna提取的方法 | |
US20240052412A1 (en) | Method for detecting rna structure at whole transcriptome level and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201110 |