CN108624651B - 一种构建Ribo-seq测序文库的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种构建Ribo‑seq测序文库的方法。所述方法包首先分离核糖体‑新生肽链复合物(Ribosome‑nascent chain Complex,RNC)，再对RNC进行酶切，不进行rRNA去除而直接建库，通过选择RPF条带而对RPF进行测序。由于无需去除rRNA，也就无需昂贵的rRNA去除试剂盒，同时也可以应对任何物种，适用范围广，RPF reads比例高于传统方法，降低了通量需求，从而降低了测序成本。

Description

一种构建Ribo-seq测序文库的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种构建Ribo-seq测序文库的方法及其构建的测序文库。

背景技术

Ribosome profiling(又称Ribo-seq，“核糖体谱”或“核糖体分布谱”)技术是通过二代测序方法分析每个核糖体在mRNA上位置的方法。该方法使用核酸酶降解未被核糖体覆盖的mRNA片段，再将核糖体除去，用二代测序测定被核糖体覆盖的片段(Ribosomeprotected fragments，RPF)。由于每个RPF对应一个核糖体，因此将这些RPF比对到参考序列后即可得知翻译中每个核糖体的位置，从而从全局上研究翻译。

虽然这项技术可以使人们从全局上研究翻译，但此项技术存在可控性差、成本极为高昂等问题。目前，所有的Ribosome profiling分析基本按照PMID:22836135的方法进行，裂解细胞，在细胞裂解液中进行酶切，再通过蔗糖密度梯度离心分离单核糖体组分，提取RNA，去除核糖体RNA(rRNA)，再将剩余的RPF进行建库测序分析。这一流程存在的主要问题在于：(1)细胞裂解液中核糖核酸酶(RNase)不受控制，酶切难以控制，常有酶切过度或不足问题，不同条件下的酶切条件难以统一，从而造成结果的不可比；(2)去除rRNA的试剂盒十分昂贵，并且存在种属限制，尤其是对于大量非模式物种，专门进行定制更是昂贵；(3)由于去除rRNA的探针是针对完整的rRNA设计的，而酶切也会切断rRNA，因此往往导致去除rRNA效果不佳，测序结果中85％以上的reads是rRNA，这对翻译研究毫无作用，造成了巨大的通量浪费，也使得测序成本极为高昂。

为解决以上问题，本发明首先分离核糖体-新生肽链复合物(Ribosome-nascentchain Complex,RNC)，再对RNC进行酶切，不进行rRNA去除而直接建库，通过选择RPF条带而对RPF进行测序。由于首先提取了RNC，脱离了细胞裂解液中难以控制的RNase，条件单一，因此所有物种几乎都可以用同样的方法进行酶切。而RNC的提取可从动物细胞(如Wang etal.,Nucleic Acids Research 2013、专利文献CN104186460A中所述)、动物组织(如专利文献CN104262478A中所述)、细菌(如Chen et al.,Journal of Biotechnology 2014,189(10),104-113)、植物组织(如专利文献CN104961813A中所述)中提取，因此适用面非常广泛。由于无需去除rRNA，也就无需昂贵的rRNA去除试剂盒，同时也可以应对任何物种。RPFreads比例高于传统方法，降低了通量需求，从而降低了测序成本。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种构建Ribo-seq测序文库的方法。利用该方法可以无需去除rRNA直接建库，同时避免细胞内small RNA以及非翻译RNA的污染，简化操作流程，适用性大，无需根据不同物种合成rRNA捕获试剂，大幅降低构建Ribo-seq文库的成本，同时能得到质量好的RPF测序数据，可以有效克服当前方法测序成本过高、操作复杂以及适用性局限于几个物种等技术缺陷。

本发明还提供一种上述方法构建的Ribo-seq测序文库。

具体地，所述构建Ribo-seq测序文库的方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品的核糖体新生肽链复合物(RNC)；

(2)对步骤(1)中得到的RNC进行处理，得到核糖体包裹的mRNA(RPF-RNA)片段；

(3)对步骤(2)得到的RPF-RNA片段进行文库构建。

优选地，所述样品来源于植物、动物(如哺乳动物，具体如人类)或微生物(如原核微生物、真核微生物等，具体如细菌、病毒、真菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体等)。

在本发明的一个实施例中，所述样品来源于人类。

在本发明的另一个实施例中，所述样品来源于细菌，具体如大肠杆菌等。

优选地，所述样品可为组织、细胞、组织裂解物、细胞裂解物等形式。

在本发明的一个实施例中，所述样品为细胞；优选地，所述步骤(1)中在提取RNC的步骤之前还包括裂解细胞得到细胞裂解物的步骤。

所述裂解细胞的步骤可采用市售产品(如市售细胞裂解液)和/或现有技术公开的常用细胞裂解方法，如化学方法(具体如CATB裂解法、SDS裂解法等)、酶解法(具体如蛋白酶K裂解法、溶菌酶裂解法等)、物理法(具体如研磨破碎法、液氮冻融破碎法等)或其组合方法，本领域技术人员可根据实际情况选择适当的方法和条件，本发明对此不作具体限定。

在本发明的另一个实施例中，所述样品为细胞裂解物。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中所述RNC的提取方法为蔗糖密度梯度离心法。

优选地，步骤(1)中所述RNC的提取在低温(如0-5℃(具体如0、1、2、3、4、5℃))下进行。

优选地，步骤(1)中所述RNC的提取方法包括将待测样品加入含蔗糖的缓冲液中和离心的步骤；所述蔗糖的浓度为30-40％(m/v，具体如32％、34％、35％、36％、38％)；在本发明的一个实施例中，所述蔗糖的浓度为35％。

在本发明的一个实施例中，所述含蔗糖的缓冲液为含蔗糖的HEPE(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液。所述HEPE缓冲液可采用市售产品，也可根据现有技术公开方法进行配制。

优选地，所述RNC的提取中，所述离心温度为0-5℃(具体如0、1、2、3、4、5℃)；在本发明的一个实施例中，所述离心温度为4℃。

优选地，所述RNC的提取中，所述离心速度为40000-50000rpm(具体如40000、42000、44000、46000、48000、50000rpm)；在本发明的一个实施例中，所述离心速度为42500rpm。

优选地，所述RNC的提取中，所述离心时间为1-10h(具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h)；在本发明的一个实施例中，所述离心时间为5h。

优选地，步骤(2)中所述的处理包括酶解处理。

优选地，所述酶解处理采用的酶包括核酸酶；更优选地，所述核酸酶为Micrococcal Nuclease(微球菌核酸酶)。

优选地，所述酶解温度为20-30℃(具体如20、22、24、25、26、28、30℃)；在本发明的一个实施例中，所述酶解温度为25℃。

优选地，所述酶解时间为10-60min(具体如10、20、30、40、50、60min)；在本发明的一个实施例中，所述酶解时间为30min。

优选地，所述酶解处理中使用酶解缓冲液，所述酶解缓冲液中包括选自：pH缓冲液、钙盐、镁盐、蛋白质合成抑制剂和酶稳定剂中的一种或多种的成分。

优选地，所述pH缓冲液的pH为7.5-8.0(具体如7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0)；更优选为7.8-8.0；在本发明的一个实施例中，所述pH缓冲液的pH为7.9。

在本发明的一个实施例中，所述pH缓冲液为Tris-HCl缓冲液。

优选地，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为40-100mM(具体如40、60、80、100mM)；在本发明的一个实施例中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM。

在本发明的一个实施例中，所述镁盐为MgCl₂。

优选地，所述镁盐在酶解缓冲液中的浓度为1-10mM(具体如1、2、4、6、8、10mM)；在本发明的一个实施例中，所述镁盐在酶解缓冲液中的浓度为6mM。

在本发明的一个实施例中，所述钙盐为CaCl₂。

优选地，所述钙盐在酶解缓冲液中的浓度为1-10mM(具体如1、2、4、6、8、10mM)；在本发明的一个实施例中，所述钙盐在酶解缓冲液中的浓度为5mM。

优选地，所述蛋白质合成抑制剂选自：氯霉素、卡那霉素、新霉素、放线菌酮、四环素、土霉素、嘌呤霉素、白喉霉素等中的一种或多种；在本发明的一个实施例中，所述蛋白质合成抑制剂为氯霉素或放线菌酮。

优选地，所述蛋白质合成抑制剂在酶解缓冲液中的浓度为50-200μg/ml(具体如50、60、80、100、120、140、150、200μg/ml)；在本发明的一个实施例中，所述蛋白质合成抑制剂在酶解缓冲液中的浓度为100μg/ml。

优选地，所述酶稳定剂在酶解缓冲液中的浓度为50-200μg/ml(具体如50、60、80、100、120、140、150、200μg/ml)；在本发明的一个实施例中，所述酶稳定剂在酶解缓冲液中的浓度为100μg/ml。

优选地，所述的酶稳定剂为牛血清白蛋白(BSA)。

在本发明的一个实施方式中，所述酶解缓冲液包括：Tris-HCl、CaCl₂、MgCl₂、氯霉素、BSA。

在本发明的一个具体实施方式中，所述酶解缓冲液包括：50mM Tris-HCl、5mMCaCl₂、6mM MgCl₂、100μg/ml氯霉素、100μg/mlBSA。

在本发明的另一个实施方式中，所述酶解缓冲液包括：Tris-HCl、CaCl₂、MgCl₂、放线菌酮、BSA。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述酶解缓冲液包括：50mM Tris-HCl、5mMCaCl₂、6mM MgCl₂、100μg/ml放线菌酮、100μg/ml BSA。

优选地，所述酶解处理中酶的使用量可根据如下公式计算：

其中，V为酶的使用量(ml)，A260_RNC为RNC重悬液在260nm的吸光度，A260_buffer为酶解缓冲液在260nm处的吸光度，V_E为RNC重悬液的体积(ml)，C_E为酶的浓度(gel U/ml)，R为比例，其选自1.0-2.0的任何数值(具体如1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0)。

在本发明的一个实施例中，所述R＝1.0。

所述RNC重悬液是指本发明上述酶解缓冲液重悬RNC形成的混悬液。

优选地，步骤(2)中所述处理在酶解处理前还包括使用酶解缓冲液重悬RNC、检测所得RNC重悬液和酶解缓冲液在260nm处的吸光度的步骤。

优选地，步骤(2)所述的处理还包括终止酶解反应的步骤。

在本发明的一个实施例中，所述终止酶解反应的步骤包括加入EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)的步骤；优选地，所述EGTA的加入量为其终浓度为20-100mM(具体如20、40、60、80、100mM)；在本发明的一个实施例中，所述EGTA的加入量为其终浓度为50mM。

优选地，步骤(2)中所述的处理还包括从酶解产物中提取RFP-RNA的步骤。

在本发明的一个实施例中，所述提取RFP-RNA的步骤包括使用RNA提取产品从酶解产物中抽提总RNA的步骤。所述的RNA提取产品可采用相应市售产品如试剂(如Trizol等)、试剂盒等。

在本发明的一个实施方式中，所述步骤(2)具体包括如下步骤：

(2-1)使用酶解缓冲液重悬步骤(1)中得到的RNC，检测所得RNC重悬液和酶解缓冲液在260nm处的吸光度，计算酶的使用量；

(2-2)根据步骤(2-1)计算的酶的使用量，对步骤(2-1)中得到的RNC重悬液进行酶解处理；

(2-3)终止酶解反应；

(2-4)对步骤(2-3)所得酶解产物抽提总RNA。

优选地，步骤(3)中所述的文库构建可采用市售产品，如Small RNA建库试剂盒进行，也可根据现有技术公开的方法进行，例如，包括以下步骤：

(3-1)对步骤(2)得到的RPF-RNA片段进行打断，得到片段化的RNA；

(3-2)根据所述片段化RNA，合成双链cDNA；

(3-3)对所述双链cDNA依次进行末端修复，加“A”、加接头；

(3-4)对所述带接头的cDNA进行片段选择；

(3-5)对所选片段进行PCR扩增，得到所述文库。

优选地，步骤(3)中所述的文库构建中，选择片段为120-160bp大小的片段。

优选地，所述构建Ribo-seq测序文库的方法还包括：

(4)将步骤(3)所得文库测序得到数据。

优选地，所述测序方法为第二代测序方法。

进一步地，所述构建Ribo-seq测序文库的方法还包括：

(5)对步骤(4)测序所得数据进行clean处理，截取在15与50bp之间长度的read。

步骤(5)中所述的clean处理包括：去除测序数据中的接头、去除测序数据中的低质量read。

本发明所述构建Ribo-seq测序文库的方法中使用的全部试剂(除酶类)，都需要严格保证不含RNase。

本发明相对于现有技术至少具有如下的优点及有益效果：

(1)现有技术是先对细胞裂解液进行酶解，然后再分离核糖体，由于细胞内自带RNase，导致酶解不可控，并且会引入非翻译的RNA以及small RNA；而本发明所述方法先分离核糖体新生肽链复合物，去掉了细胞内自带的RNase以及非翻译的RNA，使得酶解过程可控；

(2)现有技术是先去除rRNA后再进行建库，去除rRNA需要合成rRNA探针，导致Ribo-seq成本高昂，实验操作繁琐，只能局限于几个物种；而本发明所述方法直接建库，通过分子大小来区分rRNA条带以及RFP条带，可以简化操作步骤、降低成本，且适用于全部物种，适用范围广。

附图说明

通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：

图1所示为实施例1步骤(16)得到的相关性检测结果；

图2所示为实施例1步骤(18)得到的三碱基重复性检测结果；

图3所示为实施例2步骤(13)得到的三碱基重复性检测结果；

图4所示为对比实施例2步骤(12)得到的三碱基重复性检测结果。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义，如

本发明中所述“read”、“reads”是指高通量测序时，测序仪器每读取一次所能读取到的待测序列的长度，把每次读取得到的一个短片段的序列成为一个read。

本发明中所述“组织裂解物”、“细胞裂解物”是指组织、细胞被裂解后，其中内容物释放后得到的物质。

以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。

实施例1

(1)将大肠杆菌BW25113甘油种划线LB平板，培养过夜；

(2)挑平板上单菌落，接种于3mlLB中，37℃、200rpm活化过夜；

(3)按1％的接种量接种活化后的种子液，接种于50ml的LB中，37℃、200rpm培养至培养液OD₆₀₀＝0.6；

(4)向上步所得培养液中加入终浓度为100μg/ml的氯霉素，冰水中摇动5min速冷至4℃，4℃、5000g离心5min，去上清；

(5)向上步所得沉淀加入预冷50ml PBS(100μg/ml氯霉素)，重悬沉淀，4℃、5000g离心5min收集菌，弃上清；

(6)重复步骤(5)；

(7)向上步所得沉淀加入预冷5.4ml lysozyme(溶菌酶)缓冲液，重悬细胞沉淀，加入0.6ml lysozyme酶液(12.5mg/ml)，轻轻吹打混匀，置于冰上静置5min，每隔1min轻轻摇匀，加入0.15ml MgCl₂(1M)，轻轻摇匀，4℃、5000g离心5min收菌，弃上清；

(8)向上步所得沉淀加入0.6ml预冷裂解液，吹打重悬沉淀，冰上静置5min，4℃、16800rpm离心15min；

(9)将上步离心所得上清缓慢转移到预冷的35％蔗糖浓度的HEPE缓冲液上，置于贝克曼超速离心机，选用70ti转头，4℃、42500rpm离心5h；

(10)用移液枪慢慢吸走上清，加入0.2ml的预冷M buffer Mix(50mM Tris-HCl(pH＝7.9)、5mM CaCl₂、6mM MgCl₂、100μg/ml氯霉素、1X BSA)洗透明沉淀以外的管壁，弃掉，再加入0.25ml的预冷M buffer Mix轻轻吹打重悬透明沉淀，转移到EP管中，得到RNC重悬液；

(11)用Nanodrop分光光度计检测RNC重悬液的A260，根据以下公式确定加入酶的量，选用酶为NEB的Micrococcal Nuclease，酶解条件为25℃，30min；

上述公式中，V为加酶量的体积(ml)，A260_RNC为RNC重悬液在260nm的吸光度，A260_buffer为缓冲液在260nm处的吸光度，V_E为RNC重悬液的体积(ml)，C_E为MicrococcalNuclease的浓度(gel U/ml)。

(12)向上步所得体系中加入终浓度为50mM的EGTA终止反应；

(13)使用RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司)，按其说明手册，从步骤(12)的溶液中抽提RFP-RNA；

(14)使用NEB small RNA建库试剂盒建库测序，切取120-160bp大小的条带进行二代测序；

(15)对全部reads进行接头去除，去掉质量低的reads以及截取在15与50bp长度的reads；

(16)为了检验本发明方法是否在样品间稳定，将本实施例步骤(15)处理得到的两个大肠杆菌Ribo-seq测序结果，用FANSe3映射(mapping)到大肠杆菌CDS参考序列中，进行比较获得相关性，结果如图1所示；

(17)为了检验本发明方法得到的数据的reads种类分布，将本实施例步骤(15)得到的数据用FANSe3分别映射到大肠杆菌基因组参考序列、operon参考序列、rRNA参考序列以及CDS参考序列上，以read count大于10的基因为鉴定到的基因，结果如表1和表2所示；

(18)为了检验统计测序数据是否符合三碱基重复性，将本实施例步骤(16)的数据的rpkm，用FANSe3映射到大肠杆菌CDS参考序列中，对于multi-mapping只取一个基因，统计所有reads映射到基因名以及映射到的位置，新建一个空的列表，根据以下公式：

上述公式中，List为空的列表，readsmapsite_i为第i号reads映射到CDS的位置，readsnum为总reads数目，rpkm_i为第i号reads映射到的基因的rpkm；

结果如图2所示。

由图1可知，样品间的重复的R平方为0.9777，这说明本发明的方法在不同样品间较为稳定。

由表1可知，绝大部分reads能够映射到基因组中，其中大部分reads都能够映射细菌的operon中，而rRNA的reads只占17.1％，CDS区的reads占28.7％，一共鉴定到4211个基因。由表2可知，tRNA、ncRNA、以及mRNA的reads占了有效reads的70％。

由图2标红的区域可知，测序数据的每隔三个碱基都具有低-高-高的重复，这说明了测序数据具有三碱基重复性，而三碱基重复性是RFP的特征性，这结果可以说明得到的测序数据是原核细胞的RFP。

对比实施例1

步骤(1)-(13)分别依次同实施例1的步骤(1)-(13)；

(14)使用钟嘉泳探针法去除步骤(13)中的rRNA(如专利文献CN106399533A中所述方法)；

步骤(15)-(16)分别依次同实施例1的步骤(15)-(16)。

(17)为了检验本发明方法得到的数据的reads种类分布，将对比实施例1步骤(16)得到的数据用FANSe3分别映射到大肠杆菌基因组参考序列、operon参考序列、rRNA参考序列以及CDS参考序列上，以read count大于10的基因为鉴定到的基因，结果如表1和表2所示。

由表1可知，绝大部分reads能够映射到基因组以及operon上，但reads基本都映射到细菌的rRNA上，rRNA的reads占全部reads的88.5％，CDS区的reads只占全部reads的0.2％，一共只鉴定到73个基因。由表2可知，rRNA的reads占了有效reads的99.5％。mRNA的reads过少，因此无法进行三碱基重复性的验证。

表1实施例1和对比实施例1的检测结果对比

表2实施例1和对比实施例1检测的reads种类分布对比

文库名	CDS	ncRNA	rRNA	tRNA
					实施例1	49.24132	0.054752	0.300175	0.15266
对比实施例1	0.001817	8.98E-05	0.99514	0.002953

实施例2

(1)取-80℃冻存的人肺癌细胞A549 细胞(1 million)置于冰水解冻30min；

(2)加入预冷的PBS重悬上步所得A549细胞，4℃、 4000g离心5min；

(3)向上步所得细胞沉淀中加入2ml lysis Buffer，冰上静置30min，4℃、16800rpm离心15min；

(4)同实施例1步骤(9)；

(5)用移液枪慢慢吸走上清，加入0.2ml的预冷M buffer Mix(50mM Tris-HCl(pH＝7.9)、5mM CaCl₂、6mM MgCl₂、100μg/ml放线菌酮、1X BSA)洗透明沉淀以外的管壁，弃掉，再加入0.25ml的预冷M buffer Mix轻轻吹打重悬透明沉淀，转移到EP管中，得到RNC重悬液；；

步骤(6)-(10)分别依次同实施例1步骤(11)-(15)；

(11)为了检验本发明方法得到的数据的reads种类分布，将本实施例步骤(11)得到的数据用FANSe3分别映射到Homo sapiens mRNA参考序列、rRNA参考序列、tRNA参考序列以及ncRNA参考序列上，结果如表3所示；

(12)为了检验本发明方法鉴定到的基因量，将本实施例步骤(11)得到的数据用FANSe3 映射到Homo sapiens CDS参考序列中，reads count大于10的为鉴定到的基因；

(13)参考实施例1步骤(18)，检验统计测序数据是否符合三碱基重复性，结果如图3所示。

由表3可知，映射到rRNA的reads占了有效reads的58％，映射到tRNA的reads占了有效reads的12％，映射到ncRNA的reads占了有效reads的21％，映射到mRNA的reads占了有效reads的7.3％。

步骤(12)所得结果显示，一共有16081个基因是被鉴定到的。

由图3标红的区域可知，测序数据的每隔三个碱基都具有低-高-高的重复，这说明了测序数据具有三碱基重复性，而三碱基重复性是RFP的特征性，该结果可以说明得到的测序数据是真核细胞的RFP。

对比实施例2

按照文献“Lian X et al.,2016(Lian X,Guo J,Gu W,Cui Y,Zhong J,JinJ,etal.(2016)Genome-Wide and ExperimentalResolution of Relative TranslationElongation Speedat Individual Gene Level in Human Cells.PLoS Genet12(2):e1005901.doi:10.1371/journal.pgen.1005901)”中的所述方法：

(1)取-80℃冻存的人肺癌细胞A549细胞(1million)置于冰水解冻30min；

(2)加入预冷的PBS重悬上步所得A549细胞，4℃、4000g离心5min；

(3)向上步所得细胞沉淀中加入2ml lysis Buffer，裂解细胞，在细胞裂解液中加入2μl的Ribolock RNase Inhibitor，再加入2U的RNase I(Fermentas)，37℃孵育15分钟，孵育完后立刻放置于冰上，并向其中加入100μl的1％SDS(裂解液的十分之一体积)终止酶切反应；

(4)同实施例1步骤(9)；

(5)离心完成后，用移液枪小心吸出上清(应从上往下，随着液面往下吸出)；

(6)100μl RB Buffer小心吹打重悬沉淀，加入Trizol提取RNA；

(7)按照Ribo-Zero^TMMagnetic Kit(Human/Mouse/Rat)(Epicentre)试剂盒的说明书来进行rRNA去除实验，得到去除rRNA之后的RFP样品；

(8)同实施例1步骤(14)；

(9)同实施例1步骤(15)；

(10)为了检验本发明方法得到的数据的reads种类分布，将本实施例步骤(9)得到的数据用FANSe3分别映射到Homo sapiens mRNA参考序列、rRNA参考序列、tRNA参考序列以及ncRNA参考序列上，结果如表3所示；

(11)参考实施例2步骤(12)检验本实施例鉴定到的基因量；

(12)参考实施例1步骤(18)，检验统计测序数据是否符合三碱基重复性，结果如图4所示。

由表3可知，映射到rRNA的reads占了有效reads的86％，映射到tRNA的reads占了有效reads的2％，映射到ncRNA的reads占了有效reads的10％，映射到mRNA的reads只占了有效reads的0.8％。

步骤(12)所得结果显示，鉴定到的只有4974个基因。

由图4可知，测序数据并没有出现低-高-高的三碱基重复现象，这可能是由于只有太少的reads映射到mRNA上导致。

表3实施例2与对比实施例2检测的reads种类分布对比

文库名	rRNA	tRNA	ncRNA	mRNA
					实施例2	0.588486	0.121727	0.216341	0.073445
对比实施例2	0.864341	0.020925	0.106661	0.008073

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种构建Ribo-seq测序文库的方法，其包括以下步骤：

(1)提取待测样品的核糖体新生肽链复合物；

(2)对步骤(1)中得到的核糖体新生肽链复合物进行处理，得到核糖体包裹的mRNA片段；

(3)对步骤(2)得到的核糖体包裹的mRNA片段进行文库构建；

其中，步骤(2)中所述的处理包括酶解处理和从酶解产物中提取RFP-RNA的步骤；所述酶解处理采用的酶包括核酸酶，所述核酸酶为微球菌核酸酶；所述酶解处理中使用酶解缓冲液，所述酶解缓冲液中包括选自：pH缓冲液、钙盐、镁盐、蛋白质合成抑制剂和酶稳定剂中的一种或多种的成分；其中，所述酶解处理前还包括使用酶解缓冲液重悬RNC、检测所得RNC重悬液和酶解缓冲液在260nm处的吸光度的步骤；

所述酶解处理中酶的使用量根据如下公式计算：

其中，V为酶的使用量，ml；A260_RNC为RNC重悬液在260nm的吸光度；A260_buffer为酶解缓冲液在260nm处的吸光度；V_E为RNC重悬液的体积，ml；C_E为酶的浓度，gel U/ml；R为比例，其选自1.0-2.0的任何数值；

所述酶解温度为20-30℃，所述酶解时间为10-60min；

所述pH缓冲液的pH为7.5-8.0；

所述蛋白质合成抑制剂选自：氯霉素、卡那霉素、新霉素、放线菌酮、四环素、土霉素、嘌呤霉素和白喉霉素中的一种或多种；

所述的酶稳定剂为牛血清白蛋白；

其中，步骤(1)中所述RNC的提取方法为蔗糖密度梯度离心法；

步骤(3)中所述的文库构建中，选择片段为120-160bp大小的片段。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为组织、细胞、组织裂解物或细胞裂解物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品为细胞，所述步骤(1)中在提取RNC的步骤之前还包括裂解细胞得到细胞裂解物的步骤。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(4)将步骤(3)所得文库测序得到数据；

所述方法还包括：(5)对步骤(4)测序所得数据进行clean处理，截取在15与50bp之间长度的read。

Images