CN112899345A - 一种核糖体印迹测序文库构建方法 - Google Patents

一种核糖体印迹测序文库构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112899345A
CN112899345A CN201911217929.9A CN201911217929A CN112899345A CN 112899345 A CN112899345 A CN 112899345A CN 201911217929 A CN201911217929 A CN 201911217929A CN 112899345 A CN112899345 A CN 112899345A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
library
rfp
sequencing
constructing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911217929.9A
Other languages
English (en)
Inventor
卢小龙
张弓
陈洋
金静洁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan University
University of Jinan
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN201911217929.9A priority Critical patent/CN112899345A/zh
Publication of CN112899345A publication Critical patent/CN112899345A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种核糖体印迹测序文库构建方法。本发明的文库构建方法包括如下步骤：(1)提取样品的RFP‑RNA；(2)修复RFP‑RNA的两端结构；(3)将正常结构的RNA采用small RNA建库试剂盒进行文库构建。本发明将RFP‑RNA双端修复，使其恢复成正常的RNA结构，能够和市面上的small RNA试剂盒无缝衔接，直接建库，无需去除rRNA，无需采用复杂的RFP‑RNA建库方法，简化了建库实验步骤，降低了物资成本，提高了实验的稳定性；减少了4～5天的实验时间，降低了50％的时间成本。本发明的文库构建方法适用于各类物种；得到的测序数据质量高，和理论水平一致。

Description

一种核糖体印迹测序文库构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种核糖体印迹测序文库构建方法。
背景技术
核糖体印迹测序(Ribosome profiling、Ribo-seq、RFP、RPF)技术由Ingolia等(Ingolia,N.T.,Ghaemmaghami,S.,Newman,J.R.&Weissman,J.S.Genome-wide analysisin vivo of translation with nucleotide resolution using ribosomeprofiling.Science 324,218–223(2009).)于2009年首次发表。该技术使用核酸酶对生物样品裂解产物中的非核糖体保护的RNA进行酶切，经过超速离心纯化后得到单核糖体及其保护的RNA片段，使用Trizol提取RNA，再使用尿素丙烯酰胺凝胶电泳纯化得到18nt-35nt的RFP-RNA，最后通过二代测序手段构建测序文库，对核糖体保护的RNA片段(18-35nt)进行测序，获取在某一生理条件下生物体内所有核糖体在RNA上的具体位置信息。高精度的ribosome profiling数据可以对翻译阅读框进行系统性的重新注释、计算蛋白质合成速率、发现翻译暂停位点、翻译延伸核糖体结构、正在翻译的mRNA定性定量等研究。
由于核糖体印迹测序技术路线复杂、实验难度大、实验成本极高，因此目前做出高精度的核糖体印迹测序数据依然是一项挑战。主要难点在于酶切条件的确定和文库构建，酶切条件的困难点在于生物样品的多样性及复杂性，目前主要依赖经验判断，实验流程上没有太多改善的空间，而建库方法流程目前的改进空间非常大。由于RFP-RNA的结构与正常small RNA不同，无法使用常规Small RNA建库试剂盒进行建库，目前并无方法能够将RFP-RNA建库与常规Small RNA建库试剂盒衔接。Ingolia于2012发表的方法文献(Ingolia NT,Brar GA,Rouskin S,McGeachy AM,Weissman JS(2012)The ribosome profilingstrategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.Nat Protoc 7(8):1534–1550.)中的建库方法需要研究者自己合成大量的带修饰测序引物及接头序列、购买大量试剂用于文库构建中的酶促反应及核酸纯化，其中的rRNA去除步骤所用试剂十分昂贵，需要额外定制探针，无法适用于各种物种，且去除效率非常低。核糖体印迹测序实验时间极长(大约需要7-8天)，过于繁琐的建库流程增加了实验的难度及成本，许多研究者消耗了大量时间和金钱却无法得到合格的数据。因为核糖体印迹测序技术的优化需要极高的成本，绝大部分实验室没有能力对该方法不足之处进行优化。这些因素极大的限制了核糖体印迹测序的技术发展与推广，因此，目前核糖体印迹测序技术急需一个可以标准化、操作简便同时具有高稳健性的建库方案。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种核糖体印迹测序文库构建方法。该方法将RFP-RNA修复成正常的RNA结构，可以使用市面上常见的Small RNA建库试剂盒进行建库，无需自行构建复杂的RFP-RNA建库流程，显著降低核糖体印迹测序的实验成本、难度及时间消耗。
本发明的另一目的在于提供上述方法构建的核糖体印迹测序文库。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种核糖体印迹测序文库构建方法，包括如下步骤：
(1)提取样品的RFP-RNA；
(2)修复步骤(1)得到的RFP-RNA的两端结构，得到正常结构的RNA；
(3)将步骤(2)得到的正常结构的RNA采用small RNA建库试剂盒进行文库构建。
步骤(1)中所述的样品来源于动物、植物或微生物；所述的样品包括但不限于细胞和组织。
步骤(1)中所述的RFP-RNA是由核糖体印迹测序实验得到的长度为18-35nt的RNA。
步骤(2)中所述的修复RFP-RNA的两端结构是先对RFP-RNA进行3’末端脱磷酸，然后再进行5’末端磷酸化。
所述的脱磷酸和所述的磷酸化所采用的酶为T4 PNK多聚核苷酸激酶。
所述的脱磷酸的反应条件为37℃下反应10～180min；优选为37℃下反应60min。
所述的磷酸化的反应条件为37℃下反应10～180min；优选为37℃下反应60min。
所述的脱磷酸和所述的磷酸化所采用的缓冲液为T4 Polynucleotide Kinasebuffer(T4 PNK buffer)。
步骤(3)中所述的small RNA建库试剂盒为使用RNA两端接上接头原理的建库试剂盒，即使用连接酶连接5’和3’接头进行测序文库构建。
步骤(3)中所述的small RNA建库试剂盒优选为华大智造MGIEasy small RNA文库制备试剂盒和NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina中的一种。
一种ribosome profiling测序文库，通过上述构建方法构建得到。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明的文库构建方法为首次将核糖体印迹测序建库与常规Small RNA建库试剂盒高效联合的建库方法。本发明采用了高效的RFP-RNA双端修复流程，使其恢复成正常的RNA结构，能够和市面上的small RNA试剂盒无缝衔接，直接建库，无需去除rRNA，无需采用复杂的RFP-RNA建库方法。本发明的方法极大简化了建库实验步骤，降低了物资成本，提高了实验的稳定性，减少了4～5天的实验时间，降低了50％的时间成本。
2.本发明的文库构建方法适用于各类物种。
3.使用本发明的文库构建方法得到的测序数据质量非常高，和理论水平一致。
附图说明
图1是实施例1建库切胶回收纯化电泳图。
图2是实施例1建库得到的数据reads分布图。
图3是实施例1建库测序得到的数据三碱基重复性检测结果图。
图4是实施例2建库切胶回收纯化电泳图。
图5是实施例2建库得到的数据reads分布图。
图6是实施例2建库测序得到的数据三碱基重复性检测结果图。
图7是实施例3建库切胶回收纯化电泳图。
图8是实施例3建库得到的数据reads分布图。
图9是实施例3建库测序得到的数据三碱基重复性检测结果图。
图10是对比例1建库切胶回收纯化电泳图。
图11是对比例1建库得到的数据reads分布图。
图12是对比例1建库测序得到的数据三碱基重复性检测结果图。
图13是对比例2建库切胶回收纯化电泳图。
具体实施方式
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实施例中使用的酿酒酵母S288C、毕赤酵母GS115、人肺腺癌细胞系A549为常规市售。
实施例1
一种快速稳健高精度的核糖体印迹测序文库构建方法，具体步骤如下：
1.获取酿酒酵母S288C菌株的RFP-RNA(实验步骤见文献：Ingolia NT,Brar GA,Rouskin S,McGeachy AM,Weissman JS(2012)The ribosome profiling strategy formonitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNAfragments.Nat Protoc7(8):1534–1550.)。将获取的20ng RFP-RNA进行RFP-RNA双端修复反应。
2.使用T4 PNK多聚核苷酸激酶进行3’末端脱磷酸处理，37℃反应60min。反应体系见表1。
表1
Figure BDA0002300001770000041
3.在脱磷酸处理后的反应液中进行下一步反应，使用T4 PNK多聚核苷酸激酶进行5’末端磷酸处理，37℃反应60min。反应体系见表2。
表2
Figure BDA0002300001770000042
4.脱磷酸反应完成后70℃灭活T4 PNK 10min。
5.反应液中加入1.5倍体积异丙醇、1/10体积3mol/L醋酸钠、1μL GlycoBlue，-80℃沉降至少1h。
6.沉降完成后4℃、17000g离心30min，使用75％(v/v)乙醇清洗RFP-RNA沉淀两次，待RFP-RNA沉淀晾干后，使用RNase free water重悬RFP-RNA沉淀，即获得双端修复的RFP-RNA。
7.使用上述步骤获取的双端修复RFP-RNA进行Small RNA测序文库构建。使用华大智造生产的MGIeasy Small RNA文库制备试剂盒进行RFP-RNA文库构建，全部建库操作按照说明书进行，不需要任何改动。
图1为步骤7建库切胶回收纯化电泳图，RFP-RNA文库的目标片段理论长度为111bp。如电泳结果显示，在111bp处存在明亮RFP-RNA文库条带，表明两步法末端修复具有较高的修复效率，可以在正常的pcr cycle数目内构建出满足测序需求的文库量。
8.使用BGI SEQ500测序仪进行SE50(单端50)测序，获取RFP-RNA测序数据。对测序数据进行去接头处理，去除质量低的reads。
9.将去接头处理的测序数据使用FANSe算法进行mapping(序列比对)至酿酒酵母S288C参考基因组(NCBI-S288C)。
10.为检验本发明方法得到的数据的reads(测序得到的序列)分布是否符合真核生物RFP-RNA理论长度，使用步骤9中的mapping数据统计CDS编码区的reads长度分布。真核的RFP-RNA理论长度为28nt。由图2可知，使用本发明方法建库测序得到的数据reads分布主峰在28nt，和理论值一致。
11.为检验本发明方法所得数据的mapping rate，使用步骤9中的mapping数据统计mapping至CDS编码区的reads占总reads数的比例，公式如下。进行两个生物学重复。
Figure BDA0002300001770000051
使用本发明方法建库测序所得数据的mapping rate在两个生物学重复中分别为15.5％和13.8％，属于正常mapping rate范围，和参考文献中的数据保持一致，说明使用本方法不做rRNA去除也能获得足够的数据量进行下游分析。
12.为检验本发明方法得到的数据是否具有三碱基重复性以及CDS-UTR分布是否正确，使用步骤9中的mapping数据计算CDS编码区及起始密码子ATG前方30nt的三碱基重复。计算方法参考文献(Hsu,P.Y.et al.Super-resolution ribosome profiling revealsunannotated translation events in Arabidopsis.Proc.Natl Acad.Sci.USA 113,E7126–E7135(2016).)。
由图3可知，使用本发明方法建库测序得到的数据三碱基重复性非常好，每隔三个碱基会存在低-低-高的重复，几乎为理论水平。使用本发明方法建库测序得到的数据在UTR区段(-12至-30区域)只有极少量reads存在，reads主要富集在CDS编码区，因为核糖体在UTR区域会快速通过，但是在CDS编码区会缓慢前行，所以测序得到的片段会主要富集在CDS编码区。以上结果说明本方法测序得到的数据绝大部分是RFP-RNA。
实施例2
一种快速稳健高精度的ribosome profiling测序文库构建方法，具体步骤如下：
1.获取毕赤酵母GS115菌株的RFP-RNA(实验步骤见文献：Ingolia NT,Brar GA,Rouskin S,McGeachy AM,Weissman JS(2012)The ribosome profiling strategy formonitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNAfragments.Nat Protoc7(8):1534–1550.)。将获取的20ng RFP-RNA进行RFP-RNA双端修复反应。
2.使用T4 PNK多聚核苷酸激酶进行3’末端脱磷酸处理，37℃反应60min。反应体系见表3。
表3
Figure BDA0002300001770000052
3.在脱磷酸处理后的反应液中进行下一步反应，使用T4 PNK多聚核苷酸激酶进行5’末端磷酸处理，37℃反应60min。反应体系见表4。
表4
Figure BDA0002300001770000061
4.脱磷酸反应完成后70℃灭活T4 PNK 10min。
5.反应液中加入1.5倍体积异丙醇、1/10体积3mol/L醋酸钠、1μL GlycoBlue，-80℃沉降至少1h。
6.沉降完成后4℃、17000g离心30min，使用75％(v/v)乙醇清洗RFP-RNA沉淀两次，待RFP-RNA沉淀晾干后，使用RNase free water重悬RFP-RNA沉淀，即获得双端修复的RFP-RNA。
7.使用上述步骤获取的双端修复RFP-RNA进行Small RNA测序文库构建。使用华大智造生产的MGIeasy Small RNA文库制备试剂盒进行RFP-RNA文库构建，全部建库操作按照说明书进行，不需要任何改动。
图4为步骤7建库切胶回收纯化电泳图，RFP-RNA文库的目标片段理论长度为111bp。如电泳结果显示，在111bp处存在明亮RFP-RNA文库条带，表明两步法末端修复具有较高的修复效率，可以在正常的pcr cycle数目内构建出满足测序需求的文库量。
8.使用BGI SEQ500测序仪进行SE50(单端50)测序，获取RFP-RNA测序数据。对测序数据进行去接头处理，去除质量低的reads。
9.将去接头处理的测序数据使用FANSe算法进行mapping(序列比对)至毕赤酵母GS115参考基因组(NCBI-GS115)。
10.为检验本发明方法得到的数据的reads(测序得到的序列)分布是否符合真核生物RFP-RNA理论长度，使用步骤9中的mapping数据统计CDS编码区的reads长度分布。真核的RFP-RNA理论长度为28nt。由图5可知，使用本发明方法建库测序得到的数据reads分布主峰在28nt，和理论值一致。
11.为检验本发明方法所得数据的mapping rate，使用步骤9中的mapping数据统计mapping至CDS编码区的reads占总reads数的比例，公式如下。进行两个生物学重复。
Figure BDA0002300001770000071
使用本发明方法建库测序所得数据的mapping rate在两个生物学重复中分别为61.2％和57.5％，mapping rate非常高，接近普通转录组测序的水平，说明使用本方法可以不做rRNA去除，并且获得极高的cds编码区mapping rate。
12.为检验本发明方法得到的数据是否具有三碱基重复性以及CDS-UTR分布是否正确，使用步骤9中的mapping数据计算CDS编码区及起始密码子ATG前方30nt的三碱基重复。计算方法参考文献(Hsu,P.Y.et al.Super-resolution ribosome profiling revealsunannotated translation events in Arabidopsis.Proc.Natl Acad.Sci.USA 113,E7126–E7135(2016).)。
由图6可知，使用本发明方法建库测序得到的数据三碱基重复性非常好，每隔三个碱基会存在低-低-高的重复，几乎为理论水平。使用本发明方法建库测序得到的数据在UTR区段(-12至-30区域)只有极少量reads存在，reads主要富集在CDS编码区，因为核糖体在UTR区域会快速通过，但是在CDS编码区会缓慢前行，所以测序得到的片段会主要富集在CDS编码区。以上结果说明本方法测序得到的数据绝大部分是RFP-RNA。
实施例3
一种快速稳健高精度的ribosome profiling测序文库构建方法，具体步骤如下：
1.获取人肺腺癌细胞系A549的RFP-RNA(实验步骤见文献：Jang,C.,Lahens,N.F.,Hogenesch,J.B.&Sehgal,A.Ribosome profiling reveals an important role fortranslational control in circadian gene expression.Genome Res.25,1836–1847(2015).)。将获取的20ng RFP-RNA进行RFP-RNA双端修复反应。
2.使用T4 PNK多聚核苷酸激酶进行3’末端脱磷酸处理，37℃反应60min。反应体系见表5。
表5
Figure BDA0002300001770000072
3.在脱磷酸处理后的反应液中进行下一步反应，使用T4 PNK多聚核苷酸激酶进行5’末端磷酸处理，37℃反应60min。反应体系见表6。
表6
Figure BDA0002300001770000073
Figure BDA0002300001770000081
4.脱磷酸反应完成后70℃灭活T4 PNK 10min。
5.反应液中加入1.5倍体积异丙醇、1/10体积3mol/L醋酸钠、1μL GlycoBlue，-80℃沉降至少1h。
6.沉降完成后4℃、17000g离心30min，使用75％(v/v)乙醇清洗RFP-RNA沉淀两次，待RFP-RNA沉淀晾干后，使用RNase free water重悬RFP-RNA沉淀，即获得双端修复的RFP-RNA。
7.使用上述步骤获取的双端修复RFP-RNA进行Small RNA测序文库构建。在本发明中，使用华大智造生产的MGIeasy Small RNA文库制备试剂盒进行RFP-RNA文库构建，全部建库操作按照说明书进行，不需要任何改动。
图7为步骤7建库切胶回收纯化电泳图，RFP-RNA文库的目标片段理论长度为111bp。如电泳结果显示，在111bp处存在明亮RFP-RNA文库条带，表明两步法末端修复具有较高的修复效率，可以在正常的pcr cycle数目内构建出满足测序需求的文库量。
8.使用BGI SEQ500测序仪进行SE50(单端50)测序，获取RFP-RNA测序数据。对测序数据进行去接头处理，去除质量低的reads。
9.将去接头处理的测序数据使用FANSe算法进行mapping(序列比对)至人标准转录组参考序列(UCSC-refmRNA)。
10.为检验本发明方法得到的数据的reads(测序得到的序列)分布是否符合人核糖体RFP-RNA理论长度，使用步骤9中的mapping数据统计CDS编码区的reads长度分布。人核糖体RFP-RNA理论长度为28nt-30nt。由图8可知，使用本发明方法建库测序得到的数据reads分布主峰在29nt，和理论值一致。
11.为检验本发明方法所得数据的mapping rate，使用步骤9中的mapping数据统计mapping至CDS编码区的reads占总reads数的比例，公式如下。进行两个生物学重复。
Figure BDA0002300001770000082
使用本发明方法建库测序所得数据的mapping rate在两个生物学重复中分别为7.6％和7.2％，mapping rate属于正常范围，本方法相比于文献(Wu CC,Zinshteyn B,Wehner KA,Green R.2019.High-Resolution ribosome profiling defines discreteribosome elongation states and translational regulation during cellularstress.Molecular Cell.2018.12.009)中使用rRNA去除试剂盒的测序样本，mapping rate更高，稳定性更好，说明使用本方法可以不做rRNA去除就能获得正常的cds编码区mappingrate。
12.为检验本发明方法得到的数据是否具有三碱基重复性以及CDS-UTR分布是否正确，使用步骤9中的mapping数据计算CDS编码区及起始密码子ATG前方30nt的三碱基重复。计算方法参考文献(Hsu,P.Y.et al.Super-resolution ribosome profiling revealsunannotated translation events in Arabidopsis.Proc.Natl Acad.Sci.USA 113,E7126–E7135(2016).)。
由图9可知，使用本发明方法建库测序得到的数据三碱基重复性非常好，每隔三个碱基会存在低-低-高的重复，几乎为理论水平。使用本发明方法建库测序得到的数据在UTR区段(-12至-30区域)只有少量reads存在，reads主要富集在CDS编码区，因为核糖体在UTR区域会快速通过，但是在CDS编码区会缓慢前行，所以测序得到的片段会主要富集在CDS编码区。以上结果说明本方法测序得到的数据绝大部分是RFP-RNA。
表7 实施例1-3的编码区mapping率
Figure BDA0002300001770000091
对比例1不进行RFP-RNA两端修复，直接使用Small RNA建库试剂盒构建测序文库
1.获取酿酒酵母S288C菌株的RFP-RNA(实验步骤见文献：Ingolia NT,Brar GA,Rouskin S,McGeachy AM,Weissman JS(2012)The ribosome profiling strategy formonitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNAfragments.Nat Protoc7(8):1534–1550.)。
2.建库投入20ng RFP-RNA，使用华大智造生产的MGIeasy Small RNA文库制备试剂盒进行RFP-RNA文库构建，全部建库操作按照说明书进行，不需要任何改动。
3.图10为步骤2建库切胶回收纯化电泳图，RFP文库的目标片段理论长度为111bp，如电泳结果显示，在111bp无可见RFP文库条带，表明不进行双端修复直接建库无法获取到RFP文库。
4.使用BGI SEQ500测序仪进行SE50(单端50)测序，获取RFP-RNA测序数据，对测序数据进行去接头处理，去除质量低的reads。
5.将去接头处理的测序数据使用FANSe序列比对算法mapping(序列比对)至酿酒酵母S288C参考基因组(NCBI-S288C)。
6.为检验本发明方法得到的数据的reads分布是否符合真核生物RFP-RNA理论长度，使用步骤5中的mapping数据统计CDS编码区的reads(测序得到的序列)长度分布。真核的RFP-RNA理论长度为28nt。由图11可知，使用该方法建库测序得到的数据reads分布没有主峰，不符合实验的理论设计。
7.为检验本发明方法得到的数据是否具有三碱基重复性以及CDS-UTR分布是否正确，使用步骤5中的mapping数据计算CDS编码区及起始密码子ATG前方30nt的三碱基重复。计算方法参考文献(Hsu,P.Y.et al.Super-resolution ribosome profiling revealsunannotated translation events in Arabidopsis.Proc.Natl Acad.Sci.USA 113,E7126–E7135(2016).)。
由图12可知，使用本发明方法建库测序得到的数据没有三碱基重复性，每隔三个碱基不存在低-低-高的重复现象，不符合RFP-RNA所应有的三框翻译数据特征。使用本发明方法建库测序得到的数据在UTR区段(-12至-30区域)有大量reads存在，和CDS编码区的reads分布并无明显丰度差异，这表明，不进行RFP-RNA双端修复步骤建库测序得到的reads不是RFP-RNA，是不合格的数据，无法用于下游分析。
对比例2使用单步RFP-RNA两端修复法建库
1.获取酿酒酵母S288C菌株的RFP-RNA(实验步骤见文献：Ingolia NT,Brar GA,Rouskin S,McGeachy AM,Weissman JS(2012)The ribosome profiling strategy formonitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNAfragments.Nat Protoc7(8):1534–1550.)。
2.使用上述步骤获取的20ng RFP-RNA进行RFP-RNA双端修复，37℃反应30min。反应体系见表8。
表8
Figure BDA0002300001770000101
3.上步反应完成后，70℃灭活T4 PNK 10min。
4.在反应液中加入1.5倍体积异丙醇、1/10体积3mol/L醋酸钠、1μL GlycoBlue，-80℃沉降至少1h。
5.沉降完成后4℃、17000g离心30min，使用75％(v/v)乙醇清洗RNA沉淀两次，待RNA沉淀晾干后，使用RNase free water重悬RNA沉淀，即获得双端修复的RFP-RNA。
6.使用上述获取的双端修复RFP-RNA进行Small RNA测序文库构建。使用华大智造生产的MGIeasy Small RNA文库制备试剂盒进行RFP-RNA文库构建，全部建库操作按照说明书进行，不需要任何改动。
7.图13为步骤6建库切胶回收纯化电泳图，RFP文库的目标片段理论长度为111bp，如电泳结果显示，在111bp处不存在RFP文库条带，表明单步RFP-RNA两端修复方法效率极低，正常的PCR cycle数量无法扩增出足够的产物，和不进行两端修复没有任何差别。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种核糖体印迹测序文库构建方法，包括如下步骤：
(1)提取样品的RFP-RNA；
(2)修复步骤(1)得到的RFP-RNA的两端结构，得到正常结构的RNA；
(3)将步骤(2)得到的正常结构的RNA采用small RNA建库试剂盒进行文库构建。
2.根据权利要求1所述的核糖体印迹测序文库构建方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的样品来源于动物、植物或微生物；所述的样品包括细胞和组织。
3.根据权利要求1所述的核糖体印迹测序文库构建方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的RFP-RNA是由核糖体印迹测序实验得到的长度为18-35nt的RNA。
4.根据权利要求1所述的核糖体印迹测序文库构建方法，其特征在于：步骤(2)中所述的修复RFP-RNA的两端结构是先对RFP-RNA进行3’末端脱磷酸，然后再进行5’末端磷酸化。
5.根据权利要求4所述的核糖体印迹测序文库构建方法，其特征在于：
所述的脱磷酸和所述的磷酸化所采用的酶为T4 PNK多聚核苷酸激酶；
所述的脱磷酸的反应条件为37℃下反应10～180min；
所述的磷酸化的反应条件为37℃下反应10～180min；
所述的脱磷酸和所述的磷酸化所采用的缓冲液为T4 Polynucleotide Kinasebuffer。
6.根据权利要求5所述的核糖体印迹测序文库构建方法，其特征在于：
所述的脱磷酸的反应条件为37℃下反应60min；
所述的磷酸化的反应条件为37℃下反应60min。
7.根据权利要求1所述的核糖体印迹测序文库构建方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的small RNA建库试剂盒为使用RNA两端接上接头原理的建库试剂盒，即使用连接酶连接5’和3’接头进行测序文库构建。
8.根据权利要求1所述的核糖体印迹测序文库构建方法，其特征在于：步骤(3)中所述的small RNA建库试剂盒为华大智造MGIEasy small RNA文库制备试剂盒和NEBNext SmallRNA Library Prep Set for Illumina中的一种。
9.一种核糖体印迹测序文库，通过权利要求1～8任一项所述的构建方法构建得到。
CN201911217929.9A 2019-12-03 2019-12-03 一种核糖体印迹测序文库构建方法 Pending CN112899345A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911217929.9A CN112899345A (zh) 2019-12-03 2019-12-03 一种核糖体印迹测序文库构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911217929.9A CN112899345A (zh) 2019-12-03 2019-12-03 一种核糖体印迹测序文库构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112899345A true CN112899345A (zh) 2021-06-04

Family

ID=76103881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911217929.9A Pending CN112899345A (zh) 2019-12-03 2019-12-03 一种核糖体印迹测序文库构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112899345A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018089860A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 2D Genomics Inc. Methods for processing nucleic acid samples
CN108624651A (zh) * 2018-05-14 2018-10-09 深圳承启生物科技有限公司 一种构建Ribo-seq测序文库的方法
CN109609597A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 北京优迅医学检验实验室有限公司 一种低起始量PCR-free高通量测序文库的构建方法
CN109929911A (zh) * 2019-03-08 2019-06-25 广州基迪奥生物科技有限公司 一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法
CN110317771A (zh) * 2019-05-07 2019-10-11 深圳大学 一种高质量水稻核糖体印记文库的构建方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018089860A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 2D Genomics Inc. Methods for processing nucleic acid samples
CN108624651A (zh) * 2018-05-14 2018-10-09 深圳承启生物科技有限公司 一种构建Ribo-seq测序文库的方法
CN109609597A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 北京优迅医学检验实验室有限公司 一种低起始量PCR-free高通量测序文库的构建方法
CN109929911A (zh) * 2019-03-08 2019-06-25 广州基迪奥生物科技有限公司 一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法
CN110317771A (zh) * 2019-05-07 2019-10-11 深圳大学 一种高质量水稻核糖体印记文库的构建方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAIA D S DUNCAN ET AL.: "Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe", 《SCI REP》, vol. 7, no. 1, pages 9 *
DAVID W REID ET AL.: "Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation", 《METHODS》, vol. 91, pages 2 *
ROBIN GANESAN ET AL.: "Selective profiling of ribosomes associated with yeast Upf proteins", 《METHODS》, vol. 155, pages 58 - 67 *
史俊鹏: "玉米育种群体重要农艺性状遗传基础解析", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》, no. 8, pages 047 - 48 *
林永权 等: "核糖体谱测序在病毒学研究中的应用", 《病毒学报》, vol. 35, no. 6, pages 984 - 990 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106947827B (zh) 一种获得鳙性别特异分子标记及其筛选方法和应用
CN109593757B (zh) 一种探针及其适用于高通量测序的对目标区域进行富集的方法
CN110114472A (zh) 将线性测序文库转换为环状测序文库的方法
CN107893260B (zh) 高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒
CN106947766B (zh) 一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的dna片段及其应用
CN105734048A (zh) 一种基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法
CN112430586B (zh) 一种VI-B型CRISPR/Cas13基因编辑系统及其应用
US20200131504A1 (en) Plasmid library comprising two random markers and use thereof in high throughput sequencing
CN110878334B (zh) 用于扩增子测序的引物及两步pcr建库方法
CN111607613A (zh) 一种表达细胞免疫疫苗mRNA的质粒载体及其构建方法和应用
EP2360272A1 (en) Method to generate or determine nucleic acid tags corresponding to the terminal ends of DNA molecules using sequence analysis of gene expression (terminal SAGE)
CN104962643B (zh) 白背飞虱不同组织部位稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用
US20080124707A1 (en) Nucleic acid concatenation
CN111292806B (zh) 一种利用纳米孔测序的转录组分析方法
CN110951827B (zh) 一种转录组测序文库快速构建方法及其应用
CN112899345A (zh) 一种核糖体印迹测序文库构建方法
CN106636065B (zh) 一种全基因组高效基因区富集测序方法
AU2021105278A4 (en) Whole Genome High-Efficiency Gene Region Enriching and Sequencing Method
CN113817803B (zh) 一种携带修饰的小rna的建库方法及其应用
CN113025689A (zh) 一种携带修饰的小rna的建库方法及其应用
CN115925969A (zh) 一种可实现dna小片段精准删除的腺嘌呤碱基编辑器及其构建与应用
CN114250241A (zh) 一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法、组装试剂盒及应用
CN113278646A (zh) 一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用
CN111968706A (zh) 获得目标样本的目标测序数据的方法及对目标样本的序列进行组装的方法
CN114574617B (zh) 一种巴斯德毕赤酵母不同碳源下的内参基因及其引物和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination