CN109929911A - 一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型翻译组Ribosome‑seq建库方法，包括如下步骤：步骤S1，利用分子排阻色谱法对待测样品进行RPF的分离和提取，获得RNA样品；步骤S2，对RNA样品去除RNA样品中的rRNA；步骤S3，对去除rRNA后的RNA样品进行5’磷酸化反应；步骤S4，利用磷酸化后的RNA样品构建RNA测序文库，通过本发明，能够准确检测出与核糖体结合的mRNA信息，研究精度更加精细。

Description

一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法

技术领域

本发明涉及生命科学技术领域，特别是涉及一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的主要承担者。中心法则指出基因组上编码的基因信息是通过转录形成信使RNA(mRNA)，mRNA翻译形成蛋白质来行使机体的各项生理功能的。翻译过程主要包括核糖体聚集于mRNA(翻译起始)、核糖体在mRNA上移动形成肽链(翻译延伸)和肽链合成终止(翻译终止)三个步骤。研究表明，在翻译过程中存在翻译调控，翻译延伸中的调控将会对蛋白质合成的质量产生影响，而mRNA的丰度和蛋白质的丰度并不一致且相关性较低。因此，很有必要对细胞的翻译过程进行研究。

目前，翻译组测序的相关技术主要有以下两种：一种是核糖体新生肽链复合物结合的mRNA测序(ribosome nascent-chain complex-bound mRNAssequencing)，简称RNC-seq，该方法通常是直接通过蔗糖密度梯度超速离心的方法，将与多个核糖体结合的全长mRNA进行富集并进行测序；另一种是核糖体印记测序(Ribosome footprints profiling)，简称Ribo-seq。

虽然这两种技术都是对正在翻译的mRNA进行测序，但是两者也存在一定的差别，RNC-seq主要是对串联在核糖体上的全长mRNA进行测序分析，而Ribo-seq则是对核糖体内含的mRNA段进行测序分析。虽然RNC-seq测序技术能够推算出蛋白质的含量，并且能够能够推算出新的蛋白质，但是美中不足的是，由于RNC-seq是针对mRNA全长进行测序，对于mRNA内部的翻译信息，我们是无法获取的；而Ribo-seq则能够弥补这个不足，Ribo-seq是对核糖体结合的mRNA片段进行测序，这样不仅能够获得整个基因翻译量的信息，而且还能从中进一步获得基因内部翻译变化的丰富的信息，包括获取核糖体位置、密度、阅读框位置、翻译暂停区、uORFs、IncRNA small ORFs、起始密码子检测等。

公开号为CN106434625A的中国专利申请公布了一种翻译组RNC-mRNAs文库构建方法，其提供了一种对细胞翻译组RNC-mRNAs文库构建方法，采用的是蔗糖密度梯度离心法来提取得到核糖体新生肽链复合物RNC；暨南大学2017年连新磊的博士论文“翻译延伸速率的全局测定及其生物学意义”中阐述了用三种RNA测序技术，即mRNA测序技术(mRNA-Seq)、全长RNC-mRNA测序技术(RNC-Seq)和核糖体印记技术(Ribo-Seq)来研究测定人细胞生理条件下全基因范围内单基因水平的相对翻译延伸速率，其中从核糖体复合物中分离核糖体，从而解离出正在翻译的mRNA都是采用的蔗糖密度梯度离心法。然而，这种蔗糖密度梯度离心法存在一定的缺陷，对仪器设备具有依赖性，需要有专门的超速离心平台或者超速离心机，这样就增加了实验成本，另外，该方法具有步骤繁琐耗时、RNA易降解、回收率不稳定等缺点，阻碍该技术大规模地高效应用。

发明内容

为克服上述现有技术存在的不足，本发明之一目的在于提供一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，以能够准确检测出与核糖体结合的mRNA信息，研究精度更加精细。

本发明之另一目的在于提供一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，以能够弥补RNC-Seq测序技术存在的不足，而且能够从中获得整个基因翻译量的信息，同时还能进一步从中获得基因内部翻译变化的丰富信息，如获取核糖体的位置、密度、阅读框位置等等。

本发明之再一目的在于提供一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，以利用分子排阻色谱法取代经典的蔗糖密度梯度离心法，具有无仪器依赖性、省时、节约成本的特点。

本发明之又一目的在于提供一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，其能降低RNA发生降解和污染的风险，增加实验的成功率和准确率，从而更加适合快速、高效地对大量样本进行检测。

为达上述目的，本发明提出一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，包括如下步骤：

步骤S1，利用分子排阻色谱法对待测样品进行RPF的分离和提取，获得RNA样品；

步骤S2，对RNA样品去除RNA样品中的rRNA；

步骤S3，对去除rRNA后的RNA样品进行5’磷酸化反应；

步骤S4，利用磷酸化后的RNA样品构建RNA测序文库。

优选地，所述待测样品来源于植物、动物或微生物；和/或，所述待测样品为组织、细胞、组织裂解物或细胞裂解物。

优选地，于步骤S1之前，还包括对检测样本经细胞固定、细胞清洗、细胞收集以及细胞裂解得到细胞裂解物的步骤，所述待测样品为细胞裂解物。

优选地，于步骤S1中，于待测样品加入核糖核酸酶I和脱氧核糖核酸酶I，室温混匀孵育，然后加入SUPERase*In RNase inhibitor，终止消化反应；接着进行分离纯化RPF；最后提取RNA，并进行质检。

优选地，所述分离纯化RPF的步骤采用MicroSpin S-400Column层析柱进行分离纯化RPF。

优选地，所述提取RNA，并进行质检的步骤利用microRNA提取试剂盒，提取RNA，并利用核酸定量仪器检测RNA的浓度和质量，琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。

优选地，RPF的浓度应≥20ng/μl，总量应≥200ng，满足建库条件；若浓度在10-20ng/μl，总量在100-200ng，可尝试风险建库；若浓度低于10ng/μl，总量低于100ng，不建议往下建库。

优选地，步骤S2进一步包括：

S2.1，于Nuclease free微量离心管中，利用nuclease-free水将RNA样品稀释，冰上放置备用，并将RNA样品与探针杂交，用移液器轻轻吹打混匀，并转瞬离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中进行反应，瞬时离心将样品收集至管底，并置于冰上；

S2.2，取一支干净的PCR管，往里加入上一步产物，RNase H Reactionbuffer、RNase H以及DEPC处理水，轻轻吹打混匀，将其置于PCR仪中，37℃作用30分钟，转瞬离心将样品收集至管底，并置于冰上，接着加入DNase I消化探针，37℃作用30分钟，接着用RNAClean Beads纯化RNA。

优选地，步骤S3进一步包括：

S3.1，配置反应体系；

S3.2，将上述配制好的反应体系放置在PCR仪中，37℃作用30分钟；

S3.3，利用RNA Clean Beads纯化RNA。

优选地，于步骤S4中，依次进行3’SR Adapter连接反应，并对过量的3’SRAdapter进行封闭处理，然后5’SR Adapter连接反应，反转录，PCR扩增，磁珠法纯化扩增产物，6％PAGE切胶回收进行片段筛选与回收，文库定量及进行质检。

与现有技术相比，本发明一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法以人或哺乳动物细胞为样本，利用cycloheximide进行细胞固定，然后采用分子排阻色谱法进行RPF(核糖体包裹的mRNA)的分离、提取、去rRNA、5’磷酸化反应、文库构建及质控，实验设计严谨、流程清晰，在获取RPF进行核糖体分离时采用的是分子排阻色谱法而不是常用的蔗糖密度梯度离心法，无需依赖超速离心机或平台，节约成本，节省时间，同时也降低了RNA降解或被污染的几率，能够快速、高效地进行大规模样本检测，另外，本发明之Ribosome-seq测序技术能够弥补RNC-seq测序技术存在的缺陷，测序精度更加精细，而且能够提供基因内部翻译变化的丰富信息，更加有助于对翻译组学进行深刻彻底地研究。

附图说明

图1为本发明一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法的步骤流程图；

图2为本发明具体实施例提取的RNA 2100质检图；

图3为本发明具体实施例构建的RNA文库2100质检图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例并结合附图说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明亦可通过其它不同的具体实例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不背离本发明的精神下进行各种修饰与变更。

图1为本发明一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法的步骤流程图。如图1所示，本发明一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，包括如下步骤：

步骤S1，以人或哺乳动物细胞为样本，利用cycloheximide(放线菌酮)进行细胞固定，并进行细胞清洗、收集、裂解，这里需说明的是，样本可来源于植物、动物或微生物的细胞、组织(若样本为微生物，则使用其它固定剂)，本发明仅以人或哺乳动物细胞样本为例，并不以此为限。

具体的，步骤S1进一步包括：

S1.1，细胞固定：

首先往细胞培养液中迅速加入终浓度为100μg/mL的cycloheximide(放线菌酮)，放入培养箱37℃孵育1分钟；

S1.2，细胞清洗：倒掉培养液，将含有细胞的培养板转移到冰上，加入适当体积的冰预冷的PBS(加入cycloheximide，终浓度0.1mg/ml)轻轻清洗细胞；

S1.3，细胞收集：将其转移到预冷的EP管中，离心收集细胞，液氮速冻，—80℃暂存。具体地，将培养皿中的细胞用刮棒刮下，用枪头吸净置于预冷的1.5mL EP管中，放入4℃离心机中离心收集细胞，500g离心5分钟，吸弃上清，收集细胞，并液氮速冻，—80℃暂存。

S1.4，细胞裂解：往细胞样本中加入冰上预冷的cell Lysis buffer(细胞裂解液)，冰上融化，并涡旋混匀，冰上孵育10分钟，即整个操作在冰上进行，吹吸细胞数次(具体地，可用1mL无菌注射器吹吸细胞10次)，4℃17000g离心10分钟，弃沉淀回收上清液；

步骤S2，利用分子排阻色谱法进行RPF(核糖体包裹的mRNA)的分离和提取。

具体地，步骤S2进一步包括：

S2.1，DNA和RNA消化反应：加入核糖核酸酶I(RNase I)(100U/μl)和脱氧核糖核酸酶I(DNase I)(2U/μl)，室温混匀孵育，然后加入SUPERase*In RNase inhibitor，终止消化反应。具体地，取400μl细胞上清液，加入8μl RNaseI(100U/μl)和5μl DNase I(2U/μl)，室温轻柔混匀孵育45分钟，可在垂直混匀仪上轻柔混匀(转速缓慢)，接着加入10μlSUPERase*In RNase inhibitor，上下轻轻颠倒混匀，停止消化反应；

S2.2，核糖体分离：采用MicroSpin S-400Column(层析柱)进行分离纯化RPF，具体操作如下：

(1)轻轻颠倒混匀层析柱的树脂，轻弹管壁除去气泡；

(2)打开柱子的两端，让树脂中液体自然流出，如果不流出，用带有干净手套的手指去按压柱子的顶部使其流出；

(3)往柱子中加入3ml 1×Mammalian Polysome Buffer(哺乳动物多聚体缓冲液)让其在重力的作用下自然流出，需要大约1个小时；避免在树脂内部产生气泡；不要让柱子干掉，不要干扰排水。

(4)当buffer缓冲液流干后，套上1.5ml离心管；

(5)600g离心4分钟室温；

(6)弃流出液；

(7)将柱子置于1.5ml离心管中；

(8)根据以下步骤纯化RPF：

(1)往柱子中加入100μl消化后的RPF；

(2)600g离心2分钟；

(3)收集流出液。

S2.3，RPF提取：利用miRNeasy mini Kit(QIAGEN#217004)，即microRNA提取试剂盒，提取RNA(RPF)，并用核酸定量仪器NanoDrop和2100进行质检。具体操作如下：

(1)加入700μl Lysis Reagent(组织溶解试剂)充分溶解样品，可适当涡旋振荡，室温孵育8分钟；

(2)加入140μl氯仿，盖上盖子，大力充分摇匀15sec；

(3)室温孵育2-3分钟；

(4)4℃12,000g离心15分钟；

(5)转移上清(通常约350μl)至新的EP管中，避免吸取沉淀，加1.5倍体积(通常约525μl)的无水乙醇，混匀；

(6)吸取700μl的样品，包括上一步可能形成的沉淀到RNeasy minispin column(小型旋转柱)中，室温≥8000x g(≥10,000rpm)离心15秒，弃掉流出液；

(7)如果上一步的样品多于700μl，重复上一步(6)，否则不重复；

(8)加入700μl Buffer RWT室温≥8000x g(≥10,000rpm)离心15s，弃掉流出液；

(9)加入500μl Buffer RPE室温≥8000x g(≥10,000rpm)离心15s，弃掉流出液；

(10)重复第(9)步操作(重复一次)；

(11)空转2分钟室温≥8000x g(≥10,000rpm)；

(12)转移RNeasy分钟i spin column到新的1.5ml EP管，加入30–50μlRNase-freewater，洗脱RNA；

(13)利用核酸定量仪器NanoDrop和2100检测RNA的浓度和质量，琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带，如图2所示。在本发明具体实施例中，RPF的浓度应≥20ng/μl，总量应≥200ng，此时满足建库条件；若浓度在10-20ng/μl，总量在100-200ng，可尝试风险建库；若浓度低于10ng/μl，总量低于100ng，不建议往下建库。

步骤S3，rRNA去除，在本发明具体实施例中，采用RNase H(核糖核酸酶H)来去除rRNA。

具体地，步骤S3进一步包括：

(1)在一个Nuclease free微量离心管中，用nuclease-free(不含核酸酶的水)水将200ng RNA稀释至12.5μl，冰上放置备用。接着将RNA样品与探针杂交，具体反应液组成如下：

用移液器轻轻吹打混匀，并转瞬离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，按以下程序进行反应

瞬时离心将样品收集至管底，并置于冰上。

(2)接着取一支干净的PCR管，往里加入15μl上一步产物(即(1)中的三个试剂混合的产物)，2μl 10×RNase H Reaction buffer、1μl RNase H(10U/μl)和2μl DEPC处理水，轻轻吹打混匀，将其置于PCR仪中，37℃作用30分钟。转瞬离心将样品收集至管底，并置于冰上，接着加入DNase I消化探针，37℃作用30分钟。接着用RNA Clean Beads(RNA纯化珠)纯化RNA，具体操作如下：

a.涡旋振荡混匀RNA Clean Beads，吸取100μl(2×)和100μl异丙醇至上步RNA样品中，使用移液器吹打10次以彻底混匀；

b.冰上静置15分钟，使RNA结合到磁珠上；

c.将样品置于磁力架5分钟，待溶液澄清后(约5分钟)，小心移除上清。

d.保持样品始终处于磁力架中，加入200μl Nuclease-free H₂O新鲜配置的80％乙醇漂洗磁珠。

e.重复步骤d一次。

f.保持样品始终处于磁力架中，在室温下开盖干燥磁珠5-10分钟。

需注意的是，加入80％乙醇时不要吹散磁珠，最后移除上清时需要使用10μl移液器将残留液体吸干净，并应避免磁珠过分干燥(龟裂)而降低回收效率。

g.将样品从磁力架上取出，加入12.5μl Nuclease-free H₂O，用移液器吹打6次以充分混匀，室温静置2分钟，在磁力架上静置5分钟，待溶液澄清后(约5分钟)，小心吸取11μl上清至一个新的Nuclease-free离心管中，准备下一步反应。

步骤S4，将去除rRNA的RNA进行5’磷酸化反应。

具体地，步骤S4过程如下：

(1)按下表来配制反应体系：

(2)将上述配制好的反应体系放置在PCR仪中，37℃作用30分钟。

(3)接着用RNA Clean Beads(RNA纯化珠)纯化RNA，具体操作同上述纯化步骤。

步骤S5，构建RNA测序文库：依次进行3’SR Adapter连接反应，并对过量的3’SRAdapter进行封闭处理，然后5’SR Adapter连接反应，反转录，PCR扩增，磁珠法纯化扩增产物，6％PAGE切胶回收进行片段筛选与回收，文库定量及NanoDrop和2100进行质检。

具体地，步骤S5进一步包括：

S5.1，3’SR Adapter连接反应：取干净的200μl PCR管，往里加入上述磷酸化的RNA4.5μl，3ADT 0.5μl，混匀，放置PCR仪中70℃作用2分钟，取出PCR管放置冰上，继续往里加入1.8μl RNA Ligase Buffer 1，2.2μl LigationEnhancer Mix，0.5μl RNaseinhibitor(40U/μl)，0.5μl RNA ligase 1，充分混匀，放置PCR仪中37℃作用1h，取出PCR管放置冰上。

S5.2，过量3’SR Adapter的封闭：向上述PCR管中加入0.5μl RT primer，充分混匀，放置PCR仪中，按如下程序进行反应：

反应结束后，立即取出PCR管置于冰上。

S5.3，5’SR Adapter连接反应：往上一步反应产物中依次加入1.4μl RNAligationbuffer 2、0.5μl 5ADT(-80冻存)、0.5ul RNAse inhibitor(40U/μl)和1μl RNA ligase 2，充分混匀，置于PCR仪中37℃作用1h，反应结束后，立即取出置于冰上。

S5.4，反转录反应。具体地，配制如下反应体系：

充分混匀，放置PCR仪中按照50℃作用1h，70℃作用15分钟。

S5.5，PCR扩增反应：取上一步反应产物配制反应体系，充分混匀，放入PCR仪中按照设置的反应程序进行反应。

反应体系如下：

反应程序如下：

S5.6，DNA进行纯化：采用磁珠法纯化扩增产物，具体过程如下

(1)涡旋振荡混匀DNA Clean Beads，吸取100μl(2×)和100μl异丙醇至上步DNA样品中，使用移液器吹打10次以彻底混匀；

(2)冰上静置15分钟，使DNA结合到磁珠上；

(3)将样品置于磁力架5分钟，待溶液澄清后(约5分钟)，小心移除上清；

(4)保持样品始终处于磁力架中，加入200μl Nuclease-free H₂O新鲜配置的80％乙醇漂洗磁珠；

(5)重复步骤4)一次；

(6)保持样品始终处于磁力架中，在室温下开盖干燥磁珠5-10分钟；

(7)将样品从磁力架上取出，加入18μl Nuclease-free H₂O，用移液器吹打6次以充分混匀，室温静置2分钟，在磁力架上静置5分钟，待溶液澄清后(约5分钟)，小心吸取16μl上清至一个新的Nuclease-free离心管中，准备下一步反应；

S5.7，PAGE胶电泳回收目的片段：配制好6％PAGE胶，在其中一个孔中加入3μlMarker(NEB-pBR322)，在另外孔中每个孔加6μl的DNA样品(16μl样品+1μl 10×LoadingBuffer+1μl 50％甘油)，每个样品重复上样3个孔。上样结束后，200V电泳30分钟。将胶拆下用SYBR-Gold染色10分钟，蒸馏水清洗一次，切下大小为143-152bp的片段，将其放入扎孔的500ul离心管中套入1.5ml离心管，12000rpm离心1分钟，收集碎胶。往装有碎胶的1.5ml离心管中加入以下试剂：

混匀后放入温浴震荡仪，45℃，2000rpm，震荡60分钟。孵育完成后，将所有液体转移到尼龙膜柱上，8000rpm离心1分钟，丢弃流出液。接着加入80％乙醇，10000rpm离心1分钟，重复洗涤1次，丢弃流出液，12000rpm，离心2分钟。然后将含胶的柱子转移到新的1.5ml离心管中，加入适量的水，孵育10分钟，10000rpm离心1分钟，收集流出液。将流出液重新加到含磁珠的碎胶中孵育10分钟，10000rpm离心1分钟，收集流出液。

S5.8，文库构建，质检：DNA片段和浓度检测均合格，即目的片段大小为143-152bp，浓度≥1ng，体积≥15μl，无接头污染后方可上机检测，如图3所示。

综上所述，本发明一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法以人或哺乳动物细胞为样本，利用cycloheximide进行细胞固定，然后采用分子排阻色谱法进行RPF(核糖体包裹的mRNA)的分离、提取、去rRNA、5’磷酸化反应、文库构建及质控，实验设计严谨、流程清晰，在获取RPF进行核糖体分离时采用的是分子排阻色谱法而不是常用的蔗糖密度梯度离心法，无需依赖超速离心机或平台，节约成本，节省时间，同时也降低了RNA降解或被污染的几率，能够快速、高效地进行大规模样本检测，另外，本发明之Ribosome-seq测序技术能够弥补RNC-seq测序技术存在的缺陷，测序精度更加精细，而且能够提供基因内部翻译变化的丰富信息，更加有助于对翻译组学进行深刻彻底地研究。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围，应如权利要求书所列。

Claims (10)

1.一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，包括如下步骤：

步骤S1，利用分子排阻色谱法对待测样品进行RPF的分离和提取，获得RNA样品；

步骤S2，对RNA样品去除RNA样品中的rRNA；

步骤S3，对去除rRNA后的RNA样品进行5’磷酸化反应；

步骤S4，利用磷酸化后的RNA样品构建RNA测序文库。

2.如权利要求1所述的一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于：于：所述待测样品来源于植物、动物或微生物；和/或，所述待测样品为组织、细胞、组织裂解物或细胞裂解物。

3.如权利要求2所述的一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于：于：于步骤S1之前，还包括对检测样本经细胞固定、细胞清洗、细胞收集以及细胞裂解得到细胞裂解物的步骤，所述待测样品为细胞裂解物。

4.如权利要求3所述的一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于：于：于步骤S1中，于待测样品加入核糖核酸酶I和脱氧核糖核酸酶I，室温混匀孵育，然后加入SUPERase*In RNase inhibitor，终止消化反应；接着进行分离纯化RPF；最后提取RNA，并进行质检。

5.如权利要求4所述的一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，所述分离纯化RPF的步骤采用MicroSpin S-400Column层析柱进行分离纯化RPF。

6.如权利要求4所述的一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于：所述提取RNA，并进行质检的步骤利用microRNA提取试剂盒，提取RNA，并利用核酸定量仪器检测RNA的浓度和质量，琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。

7.如权利要求6所述的一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于：RPF的浓度应≥20ng/μl，总量应≥200ng，满足建库条件；若浓度在10-20ng/μl，总量在100-200ng，可尝试风险建库；若浓度低于10ng/μl，总量低于100ng，不建议往下建库。

8.如权利要求4所述的一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，步骤S2进一步包括：

S2.1，于Nuclease free微量离心管中，利用nuclease-free水将RNA样品稀释，冰上放置备用，并将RNA样品与探针杂交，用移液器轻轻吹打混匀，并转瞬离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中进行反应，瞬时离心将样品收集至管底，并置于冰上；

S2.2，取一支干净的PCR管，往里加入上一步产物，RNase H Reaction buffer、RNase H以及DEPC处理水，轻轻吹打混匀，将其置于PCR仪中，37℃作用30分钟，转瞬离心将样品收集至管底，并置于冰上，接着加入DNase I消化探针，37℃作用30分钟，接着用RNA CleanBeads纯化RNA。

9.如权利要求8所述的一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于，步骤S3进一步包括：

S3.1，配置反应体系；

S3.2，将上述配制好的反应体系放置在PCR仪中，37℃作用30分钟；

S3.3，利用RNA Clean Beads纯化RNA。

10.如权利要求9所述的一种新型翻译组Ribosome-seq建库方法，其特征在于：于步骤S4中，依次进行3’SR Adapter连接反应，并对过量的3’SR Adapter进行封闭处理，然后5’SRAdapter连接反应，反转录，PCR扩增，磁珠法纯化扩增产物，6％PAGE切胶回收进行片段筛选与回收，文库定量及进行质检。