CN114276931A - 噬菌体内溶素在提取细菌胞内物质中的用途及其试剂盒和提取方法 - Google Patents
噬菌体内溶素在提取细菌胞内物质中的用途及其试剂盒和提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114276931A CN114276931A CN202111340978.9A CN202111340978A CN114276931A CN 114276931 A CN114276931 A CN 114276931A CN 202111340978 A CN202111340978 A CN 202111340978A CN 114276931 A CN114276931 A CN 114276931A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- optionally
- bacterial
- dna
- kit
- extracting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 63
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 24
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 69
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 56
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 50
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 33
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 29
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 12
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 6
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 35
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 33
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 13
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 7
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 6
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 5
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 101150100619 nuc gene Proteins 0.000 description 3
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 101000773083 Homo sapiens 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 208000003100 Pseudomembranous Enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100461456 Staphylococcus aureus nuc gene Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000001909 effect on DNA Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000012487 rinsing solution Substances 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种噬菌体内溶素在提取细菌胞内物质中的用途及其试剂盒和提取方法。该噬菌体内溶素可用于提取细菌胞内物质；试剂盒包含上述噬菌体内溶素；提取方法包含：采用上述试剂盒对细菌胞内物质进行提取。本发明通过噬菌体内溶素的添加，能够提高细菌胞内物质的提取量；该方法具有操作简单、特异性强、提取率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种噬菌体内溶素在提取细菌胞内物质中的用途及其试剂盒和提取方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是常见的致病菌，可产生多种毒素和酶等毒力因子，能引起感染者食物中毒、假膜性肠炎、化脓性炎症和败血症等疾病，给人类造成极大威胁与损害。因此，快速、准确、简便地检测金黄色葡萄球菌，对食品安全质量控制及临床检测具有重要作用。
目前，分子生物学检测技术因其高灵敏度、高特异性及操作简单、迅速等特点，被广泛的应用于食源性致病菌检测以及临床样品致病菌检测等研究，而PCR等分子生物学实验的结果的灵敏性、特异性、检测限则与金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取质量直接相关。
因此，亟需一种高效提取金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种噬菌体内溶素在提取细菌胞内物质中的用途及其试剂盒和提取方法，本发明通过噬菌体内溶素的添加，能够提升细菌胞内物质的提取量。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
金黄色葡萄球菌为革兰阳性细菌，其具有较厚的细胞壁，而且90％的金黄色葡萄球菌细胞表面都含有蛋白A，蛋白A与细胞壁中的肽聚糖结合成致密的共价交联结构，增加了提取基因组DNA的难度。如今普遍采用化学方法提取DNA，主要依赖溶菌酶并结合其它裂解脂类和蛋白质的酶，但是，金黄色葡萄球菌对溶菌酶具有抗性。传统的提取方法，如直接水煮法、SDS-NaCl法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法都存在破壁不彻底的不足，从而导致金黄色葡萄球菌基因组DNA提取率低、提取量少，不利于后续PCR检测，无法很好满足金黄色葡萄球菌快速检测的需求。
噬菌体内溶素(endolysin)能特异性裂解细菌细胞壁，由于噬菌体内溶素被认为是一种有前途的抗生素替代品，本领域技术人员大多对噬菌体内溶素是如何裂解细菌以及怎样优化噬菌体内溶素以达到高效清除细菌等方面进行研究，而对于噬菌体内溶素用于提取细菌DNA方面的研究鲜有报道。
发明人发现，金黄色葡萄球菌噬菌体内溶素能特异性裂解金黄色葡萄球菌细胞壁，导致金黄色葡萄球菌胞内物质释放，可极大提升金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取量。并且，发明人还发现，通过进一步加入NaCl能够抑制金黄色葡萄球菌自身的核酸酶，防止基因组DNA被降解，可进一步提升金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取量，利于后续PCR检测，实现金黄色葡萄球菌快速检测。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种噬菌体内溶素在提取细菌胞内物质中的用途。根据本发明的实施例，将噬菌体内溶素加入到菌液中，噬菌体内溶素能特异性裂解细菌细胞壁，导致细菌胞内物质释放，可极大提升细菌胞内物质的提取量，尤其是金黄色葡萄球菌。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包含如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述细菌为革兰氏阳性菌，所述噬菌体内溶素来源于所述细菌对应的噬菌体。发明人通过大量试验发现，在提取细菌胞内物质的过程中，通过添加来源于该细菌的噬菌体内溶素，能够特异性裂解该细菌细胞壁，使该细菌胞内物质释放，提升细菌胞内物质的提取量。
根据本发明的实施例，所述细菌选自金黄色葡萄球菌。根据本发明的实施例，通过将金黄色葡萄球菌噬菌体内溶素加入到金黄色葡萄球菌菌液中，极大提升了金黄色葡萄球菌胞内物质的提取量，尤其是对金黄色葡萄球菌基因组DNA进行提取，可大大提升了金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取量，具有特异性强、DNA提取率高等优点。
根据本发明的实施例，所述胞内物质包括选自蛋白、RNA或DNA中的至少之一。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于提取细菌胞内物质的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含噬菌体内溶素。根据本发明的实施例，在提取细菌胞内物质的过程中，通过添加噬菌体内溶素，能够裂解细菌细胞壁，使细菌胞内物质释放，提升细菌胞内物质的提取量。
根据本发明的实施例，所述胞内物质包括选自蛋白、RNA或DNA中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述试剂盒用于提取所述细菌的DNA时，所述试剂盒进一步包含NaCl。发明人发现，噬菌体内溶素在裂解细胞壁时，也会一定程度上使DNA发生降解，从而影响收率。进而，发明人经过大量实验发现，通过添加NaCl，能够抑制DNA的降解，同时不影响噬菌体内溶素对细胞壁的裂解作用，可进一步提升细菌基因组DNA的提取量。因此，该试剂盒具有DNA提取率高、提取效果好等优点。
根据本发明的实施例，所述细菌为革兰氏阳性菌，所述噬菌体内溶素来源于所述细菌对应的噬菌体。发明人通过大量试验发现，在提取细菌DNA过程中，通过添加来源于该细菌的噬菌体内溶素，能够特异性裂解该细菌细胞壁，使该细菌胞内物质释放，提升细菌基因组DNA的提取量，具有特异性强、DNA提取率高等优点。
根据本发明的实施例，所述细菌选自金黄色葡萄球菌。根据本发明的实施例，通过将金黄色葡萄球菌噬菌体内溶素加入到金黄色葡萄球菌菌液中，极大提升了金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取量。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种提取细菌胞内物质的方法。根据本发明的实施例，所述方法采用上述试剂盒对所述细菌的胞内物质进行提取。由此，采用上述方法，能够提升细菌胞内物质的提取量，并且，具有操作简单、特异性强、提取率高等优点。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种采用上述试剂盒提取细菌DNA的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：S1、提供菌悬液；S2、将所述菌悬液与噬菌体内溶素以及任选的NaCl混合后进行裂解反应，得到混合液；S3、去除所述混合液中的蛋白，然后收集DNA。由此，采用上述方法，能够提升细菌基因组DNA的提取量，并且，具有操作简单、特异性强、DNA提取率高等优点。
根据本发明的实施例，制备所述菌悬液的方法包括：将菌液离心，取沉淀，然后加入缓冲液复溶，制得菌悬液。由此，通过离心弃上清，去除原菌液中的杂质，然后通过缓冲液制得菌悬液，方便后期加入噬菌体内溶素对细菌细胞壁进行裂解。
根据本发明的实施例，所述缓冲液包含Tris-HCl缓冲液。由此，实现对细菌沉淀的复溶，得到菌悬液。
根据本发明的实施例，NaCl可与Tris-HCl缓冲液配制成缓冲液，于噬菌体内溶素加入前加入，也可单独于噬菌体内溶素加入后加入，具体加入方式不受限制。
根据本发明的实施例，所述缓冲液由NaCl和Tris-HCl缓冲液组成。发明人通过大量试验发现，NaCl对DNA降解的抑制作用更强，同时不影响噬菌体内溶素对细胞壁的裂解作用，可进一步提升细菌基因组DNA的提取量。
根据本发明的实施例，所述NaCl于所述混合液中的终浓度为100-300mM(例如，100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、220mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM、300mM中的任意值或两者之间的范围值)，优选为100-200mM，进一步优选为140-160mM。发明人通过大量试验发现，当NaCl采用上述浓度时，对DNA降解的抑制作用更好，同时不影响噬菌体内溶素对细胞壁的裂解作用，整体提升DNA提取率。
根据本发明的实施例，所述菌液与所述缓冲液的体积比为(1-3)：(0.08-0.12)(例如，菌液与缓冲液的体积比为1:0.08、1:0.09、1:0.10、1:0.11、1:0.12、1.5:0.08、1.5:0.09、1.5:0.10、1.5:0.11、1.5:0.12、2:0.08、2:0.09、2:0.10、2:0.11、2:0.12、2.5:0.08、2.5:0.09、2.5:0.10、2.5:0.11、2.5:0.12、3:0.08、3:0.09、3:0.10、3:0.11、3:0.12中的任意值或两者之间的范围值)。发明人通过大量试验发现，采用上述配比对细菌沉淀的复溶效果较佳。
根据本发明的实施例，所述噬菌体内溶素的终浓度为150-250μg/mL(例如，150μg/mL、160μg/mL、170μg/mL、180μg/mL、190μg/mL、200μg/mL、210μg/mL、220μg/mL、230μg/mL、240μg/mL、250μg/mL中的任意值或两者之间的范围值)。发明人通过大量试验发现，噬菌体内溶素采用上述浓度时，保证细菌细胞壁的完全裂解，可提高细菌基因组DNA的提取量。
根据本发明的实施例，所述菌液与所述噬菌体内溶素的体积比为(1-3)：(0.08-0.12)(例如菌液与缓冲液的体积比为1:0.08、1:0.09、1:0.10、1:0.11、1:0.12、1.5：0.08、1.5:0.09、1.5:0.10、1.5:0.11、1.5:0.12、2:0.08、2:0.09、2:0.10、2:0.11、2:0.12、2.5：0.08、2.5:0.09、2.5:0.10、2.5:0.11、2.5:0.12、3:0.08、3:0.09、3:0.10、3:0.11、3:0.12中的任意值或两者之间的范围值)。发明人通过大量试验发现，采用上述配比，对细菌细胞壁的裂解效果较好，可进一步提高后期细菌基因组DNA的提取量。
根据本发明的实施例，所述裂解反应的时间为50-100min。发明人通过试验发现，细菌细胞壁的裂解效果较好。
根据本发明的实施例，在步骤S3之前，加入SDS于50-70℃水浴20-40min。由此，通过加入SDS，可进一步裂解细菌的细胞壁，提高后期细菌基因组DNA的提取量。
根据本发明的实施例，所述SDS与所述噬菌体内溶素的体积比为1：(3-4)(例如，SDS与噬菌体内溶素的体积比为1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4中的任意值或两者之间的范围值)，所述SDS的质量百分比浓度为5-15％(例如，5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％中的任意值或两者之间的范围值)。由此，对细菌的细胞壁的裂解效果较好。
根据本发明的实施例，步骤S3中，采用苯酚/氯仿去除所述混合液中的蛋白。由此，可去除混合液中的蛋白杂质，提高后期对DNA收集的纯度。
根据本发明的实施例，步骤S3中，采用乙醇收集所述DNA。由此，通过乙醇可使基因组DNA沉淀，从而方便对基因组DNA的收集。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1中试验组1-2所得金黄色葡萄球菌基因组DNA电泳图；
图2为本发明实施例2中试验组3-4所得金黄色葡萄球菌基因组DNA电泳图；
图3为本发明实施例3中试验组5-10所得金黄色葡萄球菌基因组DNA电泳图，其中，泳道从左向分别为试验组8、5、9、6、10、7；
图4为本发明实施例4中试验组11和对比例1-5所得金黄色葡萄球菌基因组DNA电泳图，其中，泳道M为DNA标准参照物，1为水煮法，2为SDS-NaCl法，3为改良SDS-NaCl法，4为CATB法，5为试剂盒法，6为endolysin法；
图5为本发明实施例5中试验组11和对比例1-5所得金黄色葡萄球菌基因组DNA用于金黄色葡萄球菌nuc基因PCR扩增效果图，其中，泳道M为DNA标准参照物，1为水煮法，2为SDS-NaCl法，3为改良SDS-NaCl法，4为CATB法，5为试剂盒法，6为endolysin法。
具体实施方式
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
菌种来源：本发明实施例及对比例选用金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 29213)，来自成都大学四川抗菌素工业研究所(简称川抗所)微生物菌种保藏中心。
菌种培养：(1)LB液体培养基的配制：称取2g NaCl，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物，加入去离子水定溶于200ml，121℃高温灭菌20min。(2)挑取金黄色葡萄球菌菌落接种于5mlLB液体培养基中，37℃震荡培养12h后加入LB液体培养基将OD600调至0.8。
实施例1：金黄色葡萄球菌噬菌体内溶素(以下称为endolysin)对金黄色葡萄球菌DNA提取效果的影响
试验组1：取37℃，摇5h的菌液2.5ml，离心，弃上清，加入100μL浓度为10mM的Tris-HCl悬浮细胞，加100μL浓度为400μg/mL的endolysin，制得混合液，室温静置60min。加入30μL10％SDS，于55℃水浴30min；加入等体积的苯酚/氯仿(25：25)混匀，离心取上清，然后重复一次抽滤；加入2倍体积的冰的无水乙醇混匀，-20℃静置30min，离心去上清，沉淀用70％的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于30μ无菌ddH2O，于-20℃保存。
试验组2：取37℃，摇5h的菌液2.5ml，离心，弃上清，加入200μL浓度为10mM的Tris-HCl悬浮细胞，制得混合液，室温静置60min。加入30μL 10％的SDS，于55℃水浴30min；加入等体积的苯酚/氯仿(25：25)混匀，离心取上清，然后重复一次抽滤；加入2倍体积的冰的无水乙醇混匀，-20℃静置30min，离心去上清，沉淀用70％的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于30μL无菌ddH2O，于-20℃保存。
将试验组1-2所得金黄色葡萄球菌基因组DNA电泳结果如图1所示，泳道由左至右分别为：DNA标准参照物、试验组1、试验组2。
实验结果表明，试验组1中加入endolysin，DNA提取产量增加，但是有拖尾和降解现象。
实施例2
试验组3：取过夜的菌液2ml，离心，弃上清，加入100μL缓冲液(见表1)悬浮细胞，加100μL浓度为400μg/mL的endolysin，制得混合液，室温静置60min。反应完后，加入30μL10％SDS，于55℃水浴30min；加入等体积的苯酚/氯仿(25：25)混匀，离心取上清，然后重复一次抽滤；加入2倍体积的冰的无水乙醇混匀，-20℃静置30min，离心去上清，沉淀用70％的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于30μL无菌ddH2O，于-20℃保存。
试验组4：取过夜的菌液2ml，离心，弃上清，加入100μL缓冲液(见表1)悬浮细胞，再加入100μL浓度为10mM的Tris-HCl，制得混合液，室温静置60min。加入30μL 10％SDS，于55℃水浴30min；加入等体积的苯酚/氯仿(25：25)混匀，离心取上清，然后重复一次抽滤；加入2倍体积的冰的无水乙醇混匀，-20℃静置30min，离心去上清，沉淀用70％的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于30μL无菌ddH2O，于-20℃保存。
表1：试验组3-4中缓冲液的配方
注：上表中各成分的终浓度为混合液中的终浓度。
将试验组3-4所得金黄色葡萄球菌基因组DNA电泳结果如图2所示，泳道由左至右分别为：试验组4、试验组3、DNA标准参照物。
实验结果表明，试验组3中加入0.1％的SDS、5mM巯基乙醇、150mMNaCl后，DNA降解问题得以解决，但是endolysin活性被抑制，DNA提取产量明显下降。
实施例3
试验组5-7：金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法同试验组3，其区别特征仅在于，缓冲液不同，其中，缓冲液的具体成分参见表2。
试验组8：金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法同试验组5，其区别特征仅在于，不添加endolysin，并采用10mM的Tris-HCl代替endolysin。
试验组9：金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法同试验组6，其区别特征仅在于，不添加endolysin，并采用10mM的Tris-HCl代替endolysin。
试验组10：金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法同试验组7，其区别特征仅在于，不添加endolysin，并采用10mM的Tris-HCl代替endolysin。
表2：试验组5-7缓冲液的配方:
注：上表中各成分的终浓度为混合液中的终浓度。
将试验组5-10所得金黄色葡萄球菌基因组DNA电泳结果如图3所示。发明人发现，SDS会抑制endolysin的活性；并且，发明人惊喜地发现，endolysin和NaCl盐联合使用，既能有效抑制DNA降解，又不影响endolysin活性，DNA提取产量明显增加。
实施例4
对比例1：直接水煮法提取黄色葡萄球菌基因组DNA的步骤如下：
(1)取OD600＝0.8的菌液1mL于离心管中，离心，弃上清。
(2)加入40μL的Tirs-EDTA缓冲液将细胞悬浮起来。
(3)于100℃水浴2min，冷却2min后，加入10μL RNA酶，静置10min后，10000rpm，离心3min，取上清作为DNA模板，-20℃保存备用。
对比例2：SDS-NaCl法提取黄色葡萄球菌基因组DNA的步骤如下：
(1)取OD600＝0.8的菌液1mL于离心管中，离心，弃上清。
(2)加800μL裂解缓冲液(40mM Tris-醋酸，pH 7.8的20mM醋酸钠，1mM EDTA，10％SDS)，吹打混匀。
(3)加400μL 5M NaCl混匀后，离心12min。
(4)将上清液移至另一离心管中，加入10μL RNA酶(10mg/mL)37℃温浴30min。
(5)加入等体积酚/氯仿(25︰25)，充分混匀抽提。
(6)10000rpm，离心8min收集上清，用酚/氯仿(25︰25)再抽提一次，10000rpm，离心8min后，吸取上清至新的离心管内。
(7)加2倍体积冰的无水乙醇，-20℃沉淀DNA 10min，10000rpm，离心8min，用70％乙醇洗涤沉淀2次。
(8)干燥后，溶于50μL的Tirs-EDTA缓冲液+RNA酶(50:1)中于-20℃保存备用。
对比例3：改良的SDS-NaCl法提取黄色葡萄球菌基因组DNA的步骤如下：
(1)取OD600＝0.8的菌液1mL于离心管中，离心，弃上清。
(2)加入200μL浓度为20mg/ml的溶菌酶，悬浮菌体；加入10μL RNA酶轻轻混匀；加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)，室温静置1min。
(3)加入500μL的裂解液(100mmol/L pH 7.0Tris-HCl，500mmol/L pH 8.0EDTA，20mmol/L NaCl，10％SDS)，50℃温浴20min。
(4)加入600μL的苯酚氯仿(25︰25)；10000rpm，离心3min，转移上清液至新离心管；
(5)重复一次抽滤，10000rpm，离心3min，转移上清液到新离心管；
(6)加入1mL无水乙醇，在－20℃中沉淀10min；10000rpm，离心15min，弃上清液。
(7)加入1mL 70％的乙醇洗涤，10000rpm，离心3min，弃上清液；
(8)在室温下干燥15min；然后加入50μL的Tirs-EDTA缓冲液+RNA酶(50:1)，置于-20℃保存。
对比例4：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取黄色葡萄球菌基因组DNA的步骤如下：
(1)取OD600＝0.8的菌液1mL于离心管中，离心，弃上清。
(2)在菌体沉淀中加入500μLCTAB缓冲液(Tris-HCl,pH8.0,50mmol/L；EDTA,10mmol/L；NaCl 0.7mol/L；CTAB 1.5％)，加10μLRNA酶，于65℃温育10min。
(3)加入等体积的酚/氯仿(25∶25)剧烈振荡混匀，于10000r/min离心3min；将上清液加等体积的氯仿/异戊醇混匀，10000r/min离心3min。
(4)将上清液移至新管中，加0.6倍体积异丙醇，混合静至10min后，于10000r/min离心5min。
(5)弃上清液，加入70％乙醇洗涤，于12000r/min离心3min，弃上清液；重复洗涤后取50μL Tirs-EDTA缓冲液+RNA酶(50:1)，溶解DNA，于-20℃保存。
对比例5：细菌基因组DNA提取试剂盒法提取黄色葡萄球菌基因组DNA的步骤如下：
本对比例细菌基因组DNA试剂盒外购自北京天根，批号DP160512。
(1)取OD600＝0.8的菌液1mL于离心管中，离心，弃上清。
(2)在菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
(3)向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
(4)加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。
(5)加入220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁水珠。
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12 000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12 000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
(9)重复上述操作1次。
(10)将吸附柱CB放回收集管中，12 000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-200μL洗脱缓冲液Tirs-EDTA缓冲液，室温放置2-5min，12 000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
(12)提取产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析结果，各孔上样量为3μL，在Tirs乙酸盐EDTA缓冲液(1×)电泳缓冲液中，120V恒压电泳30min。电泳完毕后，经溴化乙锭(EB)染色，通过凝胶成像分析系统观察电泳检验结果。
试验组11：Endolysin法提取黄色葡萄球菌基因组DNA的步骤如下：
(1)取OD600＝0.8的菌液1mL于离心管中，离心，弃上清。
(2)加入100μL缓冲液(6μL5M NaCl+94μL 10mM Tris-HCl)悬浮细胞。
(3)加100μL 400μg/mL endolysin，室温静置60min。
(4)待反应完全后，加入30μL 10％SDS，55℃水浴30min。
(5)加入等体积的苯酚/氯仿(25：25)混匀，离心取上清；
(6)重复一次抽提；加入2倍体积的冰无水乙醇混匀，-20℃静置30min。
(7)离心去上清，沉淀用70％的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于50μL Tris-EDTA缓冲液+RNA酶(50:1)，于-20℃保存。
试验组11、对比例1～5方法所得金黄色葡萄球菌基因组DNA电泳结果如图4所示，本发明公开方法提取效率显著高于传统基因组DNA提取方法或其改良方法。从图4可以看出，直接水煮法由于DNA提取量少，导致电泳后无明显条带，而SDS-NaCl法、改良SDS-NaCl法以及CTAB法经电泳后条带虽整齐清楚，没有RNA残留，但提取量偏少，商品试剂盒法则条带不清晰，有拖尾现象，DNA有少量降解。而本发明试验组11的endolysin法提取得到的条带较粗，无RNA残留，无拖尾现象。以上实验结果表明，本发明公开的endolysin法DNA提取量多，完整性较好，DNA质量较好。
实施例5：
进一步将试验组11、对比例1～5方法所得DNA进行PCR扩增，以验证本发明公开方法对后续PCR扩增的影响。
PCR引物合成由北京六合华大基因有限公司完成，RNA酶、SDS、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠、苯酚、氯仿和无水乙醇等均为国产试剂。
引物：选取金黄色葡萄球菌特异性基因nuc片段，使用PCR法从所提取的基因组DNA中扩增金黄色葡萄球菌nuc基因。
针对金黄色葡萄球菌nuc基因引物序列为:
nuc-F:5’-CATCACAAACAGGTAACGGCGTAAATAGAAGT-3’；
nuc-R:5’-TCTCTACACCTTTTTTAGGATGCTTTGTTTCA-3’；
其中，反应体系为：25μL Prime STAR Max Premix(2×)(TaKaRa公司)、nuc基因引物上下游各2μL、基因组DNA 1μL、灭菌双蒸水补充体系至50μL，进行PCR反应扩增。
反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸10s，共30个循环；72℃终延伸5min；4℃终止。
PCR反应结束后，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统观察。
试验组11、对比例1～5方法所得金黄色葡萄球菌基因组DNA进一步PCR扩增结果如图5所示，试验组11的方法所扩增片段约为216bp，符合目的条带大小，且条带明亮，单一，没有出现杂带和拖带的现象。
以上实验结果表明，试验组11公开方法得到的基因组DNA可以进一步用于下游PCR扩增。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种噬菌体内溶素在提取细菌胞内物质中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述细菌为革兰氏阳性菌，所述噬菌体内溶素来源于所述细菌对应的噬菌体；
任选地，所述细菌选自金黄色葡萄球菌；
任选地，所述胞内物质包括选自蛋白、RNA或DNA中的至少之一。
3.一种用于提取细菌胞内物质的试剂盒，其特征在于，包含噬菌体内溶素；
任选地，所述胞内物质包括选自蛋白、RNA或DNA中的至少之一。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于提取所述细菌的DNA时，所述试剂盒进一步包含NaCl；
任选地，所述细菌为革兰氏阳性菌，所述噬菌体内溶素来源于所述细菌对应的噬菌体；
任选地，所述细菌选自金黄色葡萄球菌。
5.一种提取细菌胞内物质的方法，其特征在于，包含：
采用权利要求3或4所述的试剂盒对所述细菌的胞内物质进行提取。
6.一种采用权利要求3或4所述的试剂盒提取细菌DNA的方法，其特征在于，包含：
S1、提供菌悬液；
S2、将所述菌悬液与噬菌体内溶素以及任选的NaCl混合后进行裂解反应，得到混合液；
S3、去除所述混合液中的蛋白，然后收集DNA。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，制备所述菌悬液的方法包括：
将菌液离心，取沉淀，然后加入缓冲液复溶，制得菌悬液；
任选地，所述缓冲液包含Tris-HCl缓冲液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缓冲液由NaCl和Tris-HCl缓冲液组成；
任选地，所述NaCl于所述混合液中的终浓度为100-300mM；
任选地，所述菌液与所述缓冲液的体积比为(1-3)：(0.08-0.12)；
任选地，所述噬菌体内溶素的终浓度为150-250μg/mL；
任选地，所述菌液与所述噬菌体内溶素的体积比为(1-3)：(0.08-0.12)。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解反应的时间为50-100min；
任选地，在步骤S3之前，加入SDS于50-70℃水浴20-40min；
任选地，所述SDS与所述噬菌体内溶素的体积比为1：(3-4)，所述SDS的质量百分比浓度为5-15％。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3中，采用苯酚/氯仿去除所述混合液中的蛋白；
任选地，步骤S3中，采用乙醇收集所述DNA。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2021112577611 | 2021-10-27 | ||
| CN202111257761 | 2021-10-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114276931A true CN114276931A (zh) | 2022-04-05 |
Family
ID=80869222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111340978.9A Pending CN114276931A (zh) | 2021-10-27 | 2021-11-12 | 噬菌体内溶素在提取细菌胞内物质中的用途及其试剂盒和提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114276931A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100184157A1 (en) * | 2007-05-23 | 2010-07-22 | Nature Technology Corporation | E. coli plasmid dna production |
| CN105969765A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-09-28 | 江苏大学 | 金黄色葡萄球菌基因组dna快速提取试剂盒及提取方法 |
| CN110551717A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-12-10 | 山东大学 | 一种快速提取细菌基因组dna的方法 |
| CN111197044A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-05-26 | 山东省农业科学院农产品研究所 | 适用于金黄色葡萄球菌基因组的试剂盒提取方法 |
-
2021
- 2021-11-12 CN CN202111340978.9A patent/CN114276931A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100184157A1 (en) * | 2007-05-23 | 2010-07-22 | Nature Technology Corporation | E. coli plasmid dna production |
| CN105969765A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-09-28 | 江苏大学 | 金黄色葡萄球菌基因组dna快速提取试剂盒及提取方法 |
| CN110551717A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-12-10 | 山东大学 | 一种快速提取细菌基因组dna的方法 |
| CN111197044A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-05-26 | 山东省农业科学院农产品研究所 | 适用于金黄色葡萄球菌基因组的试剂盒提取方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MARTIN J. LOESSNER等: "A New Procedure for Efficient Recovery of DNA, RNA, and Proteins from Listeria Cells by Rapid Lysis with a Recombinant Bacteriophage Endolysin", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| MATHIAS SCHMELCHER等: "Evolutionarily distinct bacteriophage endolysins featuring conserved peptidoglycan cleavage sites protect mice from MRSA infection", 《J ANTIMICROB CHEMOTHER》 * |
| TONY KWAN等: "The complete genomes and proteomes of 27 Staphylococcus aureus bacteriophages", 《PNAS》 * |
| 吕晓倩等: "金黄色葡萄球菌噬菌体qdsa001内溶素的特性预测及克隆表达", 《食品科学》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3347491B1 (en) | Purification of nucleic acid from environmental or biological samples | |
| CN108624651B (zh) | 一种构建Ribo-seq测序文库的方法 | |
| JPH0713077B2 (ja) | 長鎖核酸を分離する方法 | |
| CN107058295B (zh) | 一种全血dna快速提取方法 | |
| Alimolaei et al. | An efficient DNA extraction method for Lactobacillus casei, a difficult-to-lyse bacterium | |
| CN114075607B (zh) | 一种基于sherlock检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用 | |
| KR20120053792A (ko) | 잔토모나스 속 미생물 검출용 ｐｃｒ 프라이머 쌍 및 이를 이용한 잔토모나스 속 미생물 검출 방법 | |
| CN114107289A (zh) | 粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法 | |
| JP3803935B2 (ja) | 真菌細胞ｄｎａの抽出、増幅および逐次ハイブリッド形成、並びに臨床物質中における真菌細胞の検出法 | |
| WO2019243536A1 (en) | Mitochondrial nucleic acid depletion and detection | |
| KR20220024141A (ko) | 배설물 시료 내 헬리코박터 파일로리 수준의 검출 방법 | |
| CN114276931A (zh) | 噬菌体内溶素在提取细菌胞内物质中的用途及其试剂盒和提取方法 | |
| US9676817B2 (en) | Method for the removal of virus from a protein solution | |
| AU2020103778A4 (en) | Primer Set for Detection of Streptococcus agalactiae, Detection Kit and Multiplex PCR Detection Method | |
| CN114703173A (zh) | 一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法 | |
| CN116262918A (zh) | 探针组及其试剂盒和用途以及去除样本中核糖体rna的方法和提取生物样本中核酸的方法 | |
| JPWO2018061877A1 (ja) | 核酸を抽出する方法及びそれに用いるキット | |
| GB2282138A (en) | Method of extracting nucleic acids and detecting specified nucleic acid sequences | |
| CN112359133A (zh) | 用于检测耳念珠菌的rpa引物组、试剂盒及快速检测方法 | |
| CN109943652B (zh) | 一种多重pcr试剂盒及用其快速检测乳酸片球菌的方法 | |
| CN109652409A (zh) | 一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法 | |
| CN111197044A (zh) | 适用于金黄色葡萄球菌基因组的试剂盒提取方法 | |
| US4831125A (en) | DNA probe for corynebacterium kutscheri | |
| CN110819624A (zh) | 一种用于粪便中细菌dna快速提取的裂解液及方法 | |
| CN109971870B (zh) | 一种多重pcr试剂盒及用其快速检测藤黄微球菌的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220405 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |