CN110551717A - 一种快速提取细菌基因组dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速提取细菌基因组DNA的方法，步骤只有破壁、沉淀、干燥与溶解三步，大大简化了细菌基因组提取步骤，且提取时间仅需15‑30min即可完成细菌基因组DNA的提取。本发明方法明显降低了对实验设备的要求及提取成本，减少了劳动力的投入，具有省时、省力、省钱、简单、安全的优点，应用前景广阔。

Description

一种快速提取细菌基因组DNA的方法
技术领域
本发明涉及一种提取基因组DNA的方法，尤其涉及一种快速提取细菌基因组DNA的方法，属于生物技术领域。
背景技术
伴随着生物化学及分子生物学如分子克隆技术、PCR技术、基因工程以及全基因DNA测序技术等的发展，对生物DNA的研究也越来越广泛与深入。而基因组DNA的提取往往是对生物DNA研究的第一步，也是研究的基础，DNA的提取质量直接决定着下游实验的成败。
细菌属于原核生物，其细胞结构比较简单，具有肽聚糖构成的坚韧细胞壁。对细菌DNA提取的第一步需要破坏这层细胞壁，而释放细胞内的核酸等内容物，目前对细菌基因组DNA提取的方法主要有：机械破碎法、酶法和化学法等进行细胞破碎以及DNA提取。其中机械法主要是利用机械作用力如超声破碎、反复冻融、微珠震荡等方法对细菌细胞壁进行破碎；酶法主要通过生物酶如溶菌酶等对细菌细胞壁进行溶解破碎；化学法通过化学试剂如强碱NaOH、表面活性剂SDS(十二烷基磺酸钠)、CTAB等化学试剂对细菌进行破裂、蛋白变性等结合有机溶剂抽提蛋白杂质，从而获得较高纯度的DNA。
目前对细菌基因组提取最常用的方法即CTAB-酚氯仿抽提法，由于其操作所用的试剂方便易得，无需用到复杂的实验仪器，价格相对低廉，因而成为细菌基因组DNA主要的提取方法。其主要提取步骤包括：收集菌体、破壁、抽提、沉淀、洗涤、干燥、溶解等多步，其主要方法包括(以提取大肠杆菌基因组DNA为例进行介绍)：收集菌体1、划线菌种至LB固体培养基，置于37℃培养箱倒置培养过夜待长出菌落后，挑取菌落至LB液体培养基，37℃摇培约12小时至稳定生长期，取1.5mL菌液至2mL离心管，12000rpm，离心5min，弃上清，收集菌体；破壁2、加入600μL 1X TE溶液重悬菌体，12000rpm，离心5min，弃上清；3、加入450μL1 X TE溶液、50μL 10mg/mL溶菌酶和10μL 100mg/mL的蜗牛消化酶与菌体混匀，37℃孵育1h；4、加入600μL TENS裂解液，以及与沉淀等体积的玻璃珠，混匀，涡旋震荡10min后，加入30μL20mg/mL蛋白酶K，混匀，55℃孵育1h，5、4℃12000rpm，离心5min，转移上清至新的1.5mL离心管；抽提6、加入等体积的有机溶剂酚、氯仿、异戊醇(25：24：1)充分混匀，静置2min后，4℃，12000rpm，离心5min；沉淀7、转移上清至新的1.5mL离心管，加入0.8倍体积的异丙醇，-20℃沉淀2h，4℃，12000rpm，离心5min，弃上清。洗涤8、加入600μL预冷的70％的乙醇，颠倒混匀，洗涤DNA沉淀，12000rpm，离心5min，弃上清，并重复洗涤1次。干燥及溶解9、吸干离心管中的液体，晾干，加入30μL无菌水及0.5μL 10mg/mL的RNaseA，混匀保存至-20℃冰箱。其中TENS裂解液成分：100mM Tris-HCl(pH8.0),50mM EDTA，200mM NaCl，2％(w/v)SDS(十二烷基磺酸钠)，0.5％(v/v)TritonX-100。然而此方法比较费时费力，所用试剂较多，一些试剂如酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂有毒，且有刺激性气味，需在通风橱中操作，一些酶的价格较贵，花费较多，投入成本较大，且整个过程步骤较繁琐，花费时间较长，整个提取过程需要花费4、5个小时才能完成，影响实验进程。基于此，亟待对提取DNA方法进行优化，使其能简易、方便、快捷，缩时、低成本，并且保证DNA的产量、质量，能够使提取的DNA进行下游的PCR、菌种鉴定等实验。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明对之前的细菌DNA提取方法进行了优化，提供一种快速提取细菌基因组DNA的方法。
本发明所述的快速提取细菌基因组DNA的方法，步骤是：
1)破壁：刮取待提取的生长于培养基上的细菌菌落或离心收集处于生长对数期的菌体，以湿菌0.5～10mg:500μL提取液的比例将收取的细菌浸于DNA提取液中，60-80℃条件下放置5-30min，破碎细胞；其中所述DNA提取液的配方是：150±20mM Tris，30±5mM EDTA，1％(w/v)SDS，用盐酸调pH值为7.7～8.0；
2)沉淀：将步骤1)处理的菌液以12000±2000rpm离心5～10min或静置，吸取上清液移至新的离心管，其过程中避免吸到破碎的菌体，然后再加入吸取液等体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃，12000±2000rpm离心5～10min，弃上清；
3)干燥与溶解：将弃上清后的离心管中残留的液体充分吸净，放置离心管使其自然晾干或在超净台中将离心管吹干，然后加入灭菌的ddH2O溶解DNA，获得含有细菌基因组DNA的溶液。
上述快速提取细菌基因组DNA的方法中：所述湿菌与DNA提取液的比例优选是湿菌2-8mg:500μL提取液。进一步优选的实施方式是所述湿菌与DNA提取液的比例是湿菌5mg:500μL提取液。
上述快速提取细菌基因组DNA的方法中：所述将收取的细菌浸于DNA提取液中，优选在75～80℃条件下放置10±3min，破碎细胞。最优选在80℃条件下放置10min，破碎细胞。
上述快速提取细菌基因组DNA的方法中：所述所述DNA提取液的配方优选是：150mMTris，30mM EDTA，1％(w/v)SDS，用盐酸调pH值为7.8。
本发明提供的快速提取细菌基因组DNA的方法仅有三步，大大节省了人力、物力及时间，与传统方法相比有以下优点和显著效果：
1、菌体准备直接划线挑菌即可，省却摇菌的麻烦。
2、省时，以往的提取方法需要4、5个小时，本发明仅需20分钟即可完成DNA提取。
3、省力，以往的提取方法步骤较多，且需要多次离心，本发明这一步仅需3步。
4、省钱，以往的提取方法需要多种价格较贵的酶及化学药品及试剂，本发明仅需3种药品2种试剂。
5、相对较安全，以前的提取方法需要酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂，这些有机溶剂有毒，挥发性较大，且有刺激性气味，对实验者以及周围环境存在威胁，本发明无需这些有机溶剂，相对较安全。
进一步对本发明所提细菌基因组DNA的产量、质量及效果进行检测，结果显示所提DNA的产量较高、质量较好，完全可用于下游的PCR反应以及菌种鉴定，应用前景广阔。
附图说明
图1.利用本发明所述方法提取的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。
其中：M是Marker，1是大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α。
图2.利用本发明所述方法提取的4种不同的细菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，检测所提细菌基因组DNA的产量及质量。
其中：1、2、3、4是分别提取革兰氏阳性菌萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeous)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)以及革兰氏阴性细菌霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)的DNA琼脂糖DNA电泳图。
图3.利用本发明所述方法提取的4种不同的细菌基因组的16S rDNA PCR扩增产物电泳图。
其中：1、2、3、4分别是对提取的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeous)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)的16S rDNA PCR产物电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
本发明使用的菌株和试剂均为市售产品。
实施例1利用本发明所述方法提取大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α基因组DNA
1)破壁：刮取生长于培养基上的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α菌落，以湿菌5mg:500μL提取液的比例将收取的细菌浸于DNA提取液中，80℃条件下放置10min，破碎细胞；其中所述DNA提取液的配方是：150mM Tris，30mM EDTA，1％(w/v)SDS，用盐酸调pH值为7.8；
2)沉淀：将步骤1)处理的菌液以12000rpm离心5min或静置，吸取上清液移至新的离心管，其过程中避免吸到破碎的菌体，然后再加入吸取液等体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心5min，弃上清；
3)干燥与溶解：将弃上清后的离心管中残留的液体充分吸净，在超净台中将离心管吹干，然后加入30μL灭菌的ddH2O溶解DNA，获得含有细菌基因组DNA的溶液。
提取的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
实施例2利用本发明所述方法提取大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α基因组DNA
1)破壁：刮取生长于培养基上的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α菌落，以湿菌2mg:500μL提取液的比例将收取的细菌浸于DNA提取液中，75℃条件下放置15min，破碎细胞；其中所述DNA提取液的配方是：160mM Tris，35mM EDTA，1％(w/v)SDS，用盐酸调pH值为8.0；
2)沉淀：将步骤1)处理的菌液以11000rpm离心5min，吸取上清液移至新的离心管，其过程中避免吸到破碎的菌体，然后再加入吸取液等体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃，11000rpm离心5min，弃上清；
3)干燥与溶解：将弃上清后的离心管中残留的液体充分吸净，放置离心管使其自然晾干，然后加入30μL灭菌的ddH2O溶解DNA，获得含有细菌基因组DNA的溶液。
实施例3 4株细菌基因组DNA提取及验证
1)准备菌体，在LB培养基上分别划线革兰氏阳性菌萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeous)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)以及革兰氏阴性细菌霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)四株细菌，28℃培养过夜。
2)细菌基因组DNA的提取，用10μL的小枪头分别刮取四株细菌约绿豆大小的菌落(湿菌重约5mg)，将粘有菌落的小枪头浸于500μL DNA提取液中，80℃，10min。然后弃小枪头，吸取500μL经DNA提取液处理的菌液上清液至新的1.5mL离心管中，然后再加入吸取液等体积的异丙醇沉淀，4℃，12000rpm离心10min，弃上清。将离心管中残留的液体充分吸干，并置于超净台中吹干，分别加入30μL灭菌的ddH2O充分溶解，即得到四株含有细菌的基因组DNA的溶液。其中所述DNA提取液的配方是：150mM Tris，30mM EDTA，1％(w/v)SDS，用盐酸调pH值为7.8。
3)取5μL DNA样品在1％的琼脂糖凝胶上，电泳检测，电泳所用的DNA marker为北京睿博兴科生物技术有限公司RB-MK8，本实施实例所述方法提取的4种不同的细菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，发现所提DNA条带清晰，单一，无拖尾状弥散，提示所提DNA完整性较好。
4)用上述所提取的D NA1μL为模板，分别扩增四株细菌的16S rDNA序列并进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，以进一步确证所提DNA能够用于下游PCR以及菌种鉴定。
以细菌16S rDNA通用引物27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT进行16S rDNA扩增。其中所用的高保真的DNA聚合酶为vayme公司Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase。
PCR体系为50μL：ddH2O:20μL；2X Phanta Max buffer:25μL；dNTP Mix(10mM):1μL；27F(10μM/mL):1μL；1492R(10μM/mL):1μL；Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase:1μL；8C-3基因组DNA:1μL。
PCR条件为：95℃预变性2分钟，95℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分钟，重复变性到延伸共35个循环，72℃彻底延伸5分钟。
5)取PCR产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图3所示，所扩增片段约为1.4K，符合目的条带大小，且很亮，条带单一，表明使用实施实例提取DNA的方法所提取的DNA可以进行下游PCR及菌种鉴定实验。

Claims (6)

1.一种快速提取细菌基因组DNA的方法，步骤是：
1)破壁：刮取待提取的生长于培养基上的细菌菌落或离心收集处于生长对数期的菌体，以湿菌0.5～10mg:500μL提取液的比例将收取的细菌浸于DNA提取液中，60-80℃条件下放置5-30min，破碎细胞；其中所述DNA提取液的配方是：150±20mM Tris，30±5mM EDTA，1％(w/v)SDS，用盐酸调pH值为7.7～8.0；
2)沉淀：将步骤1)处理的菌液以12000±2000rpm离心5～10min或静置，吸取上清液移至新的离心管，其过程中避免吸到破碎的菌体，然后再加入吸取液等体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃，12000±2000rpm离心5～10min，弃上清；
3)干燥与溶解：将弃上清后的离心管中残留的液体充分吸净，放置离心管使其自然晾干或在超净台中将离心管吹干，然后加入灭菌的ddH2O溶解DNA，获得含有细菌基因组DNA的溶液。
2.根据权利要求1所述快速提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于：所述湿菌与DNA提取液的比例是湿菌2～8mg:500μL提取液。
3.根据权利要求2所述快速提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于：所述湿菌与DNA提取液的比例是湿菌5mg:500μL提取液。
4.根据权利要求1所述快速提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于：所述将收取的细菌浸于DNA提取液中，75～80℃条件下放置10±3min，破碎细胞。
5.根据权利要求4所述快速提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于：所述将收取的细菌浸于DNA提取液中，80℃条件下放置10min，破碎细胞。
6.根据权利要求1所述快速提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于：所述所述DNA提取液的配方是：150mM Tris，30mM EDTA，1％(w/v)SDS，用盐酸调pH值为7.8。
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