CN111676214A

CN111676214A - 一种磁珠法提取细菌基因组dna的试剂盒及提取方法

Info

Publication number: CN111676214A
Application number: CN202010536462.0A
Authority: CN
Inventors: 李贝贝; 张芃芃; 管希云; 李华中; 秦萍
Original assignee: Henan Jintai Biotechnology Share Co ltd
Current assignee: Henan Jintai Biotechnology Share Co ltd
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2020-09-18

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒及提取方法。该试剂盒内盛有裂解液和缓冲液C，所述裂解液的组成包括TE缓冲液、SDS、NaCl和蛋白酶K溶液，所述SDS溶液的浓度为8‑12wt％，所述NaCl溶液的浓度为1.5‑2.5mol/L；所述缓冲液C用于在磁珠与细菌的裂解液结合后对磁珠上吸附的DNA进行处理使DNA脱水、沉淀，所述缓冲液C为浓度2.3‑3.0mol/L NaCl。采用该试剂盒按照对细菌基因组DNA提取，提取效率和提取得到的DNA的纯度高。

Description

一种磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒及提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒及提取方法。

背景技术

核酸提取和纯化技术是目前分子生物学技术在临床、食品以及环境监测过程中推广应用的关键技术。建立快速、简便的核酸纯化技术具有非常重要的现实意义。目前常用的微生物基因组纯化方法主要有碱裂解法、酚-氯仿法等。这些方法普遍存在产物不纯、操作繁琐等问题，且无法摆脱对高速离心机的依赖。

磁性DNA纯化方法依据高盐离子浓度下多聚核苷酸与羧基修饰的磁珠表面非特异吸附，而蛋白分子、细胞碎片、多糖等细胞成分不被吸附的原理，可在短时间内完成基因组DNA的高效富集与纯化。

磁珠法操作简单、耗时短、安全、快速、成本低、步骤少，同时减少有毒试剂的危害，相比传统的提取方法，具备无法比拟的优势，是未来核酸提取发展的重要方向，在临床、食品、环境病原体快速检测领域具有巨大的推广价值。

中国专利文献CN101824450A公开了一种基于磁珠提取细菌基因组DNA的试剂盒，该试剂盒包括溶菌酶工作液、细菌重悬裂解液、RNA酶工作液、菌体蛋白沉淀液、磁珠、异丙醇、漂洗液和DNA洗脱液，其中细菌重悬裂解液为：10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐、pH值7.0-8.0、1.4mmol/L螯合剂、50-100mmol/L Na盐、质量浓度2-4％的十二烷基硫酸钠和终浓度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K；溶菌酶工作液为：10-20mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐，pH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合剂、体积分数0.8-1.2％Trition-X-100，溶菌酶的终浓度为20-30mg/mL。当采用该试剂盒对革兰氏阳性菌的基因组DNA进行提取时，先用高效的溶菌酶工作液在37℃条件下对革兰氏阳性菌处理10-30min，之后再加入细菌重悬裂解液在65-70℃条件下处理10-20min；之后再加入RNA酶、菌体蛋白沉淀液、磁珠、异丙醇、漂洗液等进行纯化，可制备得到细菌基因组DNA溶液。采用该试剂盒对革兰氏阳性菌的基因组DNA进行提取时，虽然裂解所需的时间较短，但后续的步骤需要的时间较长且需要与特定的溶菌酶工作液配合使用，对革兰氏阴性菌的基因组DNA提取的适用性较差。

中国专利文献CN104975007A公开了一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，该方法包括下述步骤：向菌体沉淀中加入0.5-1mL溶菌酶溶液(0.1-0.3mol/L氯化钠，0.1-0.2mol/LEDTA，10-20mg/ml溶菌酶，pH＝7-9)悬浮沉淀，37℃温浴2-4h；加入0.5-1mL十二烷基硫酸钠溶液(0.1-0.2mol/L氯化钠，0.1-1mol/L三羟甲基氨基甲烷，5-20％质量体积比的十二烷基硫酸钠，pH＝7-9)，反复颠倒混匀10-20min；之后再加入酚、氯仿和异戊醇混合液抽提；再采用磁珠法对基因组DNA进行提取。该磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法的提取时间长。

中国专利文献CN105132410B公开了一种微生物基因组DNA的提取方法，包括下述步骤：(1)向菌体中加入STES缓冲液(0.2M Tris-HCl、0.5M NaCl、0.01M EDTA和0.1wt％SDS)重悬，得到菌悬液；向菌悬液中加入玻璃珠，然后以TE缓冲液溶解，得到待提取菌液；(2)加入酚/氯仿溶液，震荡、离心，收集水相；(3)向收集得到的水相中加入氯仿/异戊醇溶液，震荡、离心，收集水相；(4)加入异丙醇或无水乙醇，室温下沉淀，离心，收集沉淀；(5)使用乙醇溶液洗涤，加入无菌水溶解DNA沉淀，磁珠纯化即得微生物基因组DNA。该方法虽可用于微生物基因组DNA的提取，但提取方法复杂，提取效率低。

中国专利文献CN110551717A公开了一种快速提取细菌基因组DNA的方法，包括下述步骤：(1)破壁：将菌体浸于DNA提取液(150±20mM Tris、30±5mM EDTA、1％SDS，用盐酸调pH值为7.7-8.0)中，60-80℃条件下放置5-30min，破碎细胞；(2)沉淀：将步骤(1)处理的菌液离心或静置，转移上清液，并向上清液中加入异丙醇，离心，弃上清；(3)晾干，加入ddH₂O溶解DNA即得含有细菌基因组DNA的溶液。该方法虽可提取得到细菌DNA，但提取得到的DNA的纯度较低。此外，当该方法用于提取大肠杆菌的基因组DNA时，需要采用DNA提取液对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的菌体处理10min以上，处理的时间较长。

发明内容

本发明提供一种磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒，该试剂盒用于提取细菌基因组DNA时所需的裂解时间/提取总时间较短，可广泛推广应用。

本发明还提供了一种基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法。

本发明的磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒采用如下技术方案：一种磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内盛有裂解液和缓冲液C，所述裂解液的组成包括TE缓冲液、SDS、NaCl和蛋白酶K溶液，所述SDS溶液的浓度为0.08-0.12g/mL，所述NaCl溶液的浓度为1.5-2.5mol/L；所述缓冲液C用于在磁珠与细菌的裂解液结合后对磁珠上吸附的DNA进行处理使DNA脱水、沉淀，所述缓冲液C为浓度2.3-3.0mol/L NaCl。

作为进一步优选的技术方案，所述裂解液中TE缓冲液、SDS、NaCl和蛋白酶K溶液的体积比为10:10:5:2。

作为进一步优选的技术方案，所述试剂盒还包括下述中的任意一种或多种试剂：磁珠悬浮液、溶菌酶溶液、缓冲液B、漂洗液D和洗脱液E；所述磁珠悬浮液的浓度为20-30mg/mL，所述溶菌酶溶液的浓度为40-60mg/mL，所述缓冲液B为体积分数50-70％的异丙醇，所述漂洗液D包括终浓度为20-30mmol/L的Tris-Acetate、80-120mmol/L的KOAc、8-12mmol/L的Mg(OAc)₂、0.8-1.2mmol/L DTT，所述Tris-Acetate的pH＝7.8，所述洗脱液E为TE缓冲液。

作为进一步优选的技术方案，所述磁珠悬浮液的浓度为25mg/mL，所述溶菌酶溶液的浓度为50mg/mL，所述缓冲液B为体积分数60％的异丙醇，所述漂洗液D包括终浓度为25mmol/L的Tris-Acetate、100mmol/L的KOAc、10mmol/L的Mg(OAc)₂、1mmol/L DTT，所述溶菌酶溶液通过向溶菌酶中加入Enzymatic lysis buffer配制得到；所述SDS溶液的浓度为0.1g/mL，所述NaCl溶液的浓度为2mol/L，所述缓冲液C的浓度为2.5mol/L。

本发明的基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法采用如下技术方案：一种基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法，采用如上述任意一项所述的试剂盒对细菌基因组DNA进行提取。

作为进一步优选的技术方案，包括下述步骤：(1)向细菌菌体中加入裂解液，震荡混匀，50-60℃保温至细胞裂解完全；(2)加入缓冲液B与磁珠悬浮液，震荡混匀后瞬时离心，静置1min后再次瞬时离心后放置于磁力架上静置30s后弃液；(3)向步骤(2)所得样品中加入缓冲液C，震荡混匀后瞬时离心，静置1min后再次瞬时离心后放置于磁力架上静置30s后弃液；(4)向步骤(3)所得样品中加入漂洗液D，震荡混匀后瞬时离心，静置1min，之后置于磁力架上静置30s弃液；(5)向步骤(4)所得样品中加入洗脱液E，震荡混匀，静置1min后瞬时离心，放置磁力架上静置30s，收集上清即得细菌基因组DNA提取液。

作为进一步优选的技术方案，采用该方法提取革兰氏阳性菌的DNA时，在加入所述裂解液之前还包括向菌体中加入TE缓冲液和溶菌酶溶液重悬菌体、37℃水浴10-15min的步骤。

作为进一步优选的技术方案，所述TE缓冲液、溶菌酶溶液和缓冲液B的体积比为1:1:2。

作为进一步优选的技术方案，提取革兰氏阴性细菌的基因组DNA时，所述步骤(1)的保温时间为5-8min；提取革兰氏阳性细菌的基因组DNA时，所述步骤(1)的保温时间为30-60min。

作为进一步优选的技术方案，所述裂解液、缓冲液B、磁珠悬浮液、缓冲液C、漂洗液D和洗脱液E的体积比为27:20:3:50:50:5。

本发明的有益效果是：本发明的试剂盒中的裂解液与革兰氏阴性菌在50-60℃条件下作用5min即可实现菌体的裂解。

本发明的缓冲液C可使DNA发生脱水，分子构相由线状被压缩成卷曲状，继而可快速实现DNA的聚集沉淀。且离心分离出上清液后即可立即进行后续漂洗的步骤，处理时间短，可加快DNA提取的进程。

本发明的试剂盒中的漂洗液的组分包括Tris-Acetate(pH7.8)、KOAc、Mg(OAc)₂和DTT，KOAc可与DNA中残留的SDS相互作用，钾离子可置换SDS中的钠离子，将SDS转变成不溶性的PDS(十二烷基硫酸钾)；由于SDS专门和蛋白质结合，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就可将绝大部分蛋白质沉淀；高浓度的盐可使沉淀更完全；DTT是强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。此外，DTT的刺激性气味小，毒性低，在用量很小时即可起到很好的效果。

本发明的试剂盒用于革兰氏阴性菌基因组DNA的提取时，15min内即可完成革兰氏阴性菌基因组DNA的提取；此外，采用本发明的试剂盒提取得到的DNA的OD260/280在1.8左右，纯度高；从1mL菌液中可提取得到15-20μg DNA，提取效率高，重复性好。

本发明的试剂盒中各组分均采用常规试剂，成本低，适用于高通量实验。

本发明的基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法操作简单、高效，且提取得到的DNA的质量好。

采用本发明的基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法对革兰氏阴性菌的基因组DNA进行提取时，裂解5min即可实现菌体的裂解；且后续洗脱可在6min内完成，可实现细菌基因组DNA的快速提取。

本发明的基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法避免了复杂的液体处理过程，缩短了整体操作时间，无需高速离子能，使提取过程更为快捷。

本发明的基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法使得可在同一个反应管内实现细菌DNA的提取，没有样品损失，洗脱效率和DNA提取的成功率更高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为采用本发明的试剂盒和方法提取的大肠杆菌(革兰氏阴性)基因组的琼脂糖凝胶电泳条带；

图2为采用本发明的试剂盒和方法提取的金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)基因组的琼脂糖凝胶电泳条带。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。若未特别指明，实例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1细菌基因组提取试剂盒中试剂的配制：

磁珠悬浮液为：25mg/mL，100nm的单分散硅羟基磁珠；

裂解液A为：包含TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0)、10％SDS(取1g SDS粉末，用超纯水溶解定容至10mL)、2mol/L NaCl；

蛋白酶K溶液：成分是20mg/mL蛋白酶K；

溶菌酶缓冲液：需新鲜配置，使用前将相应的溶解酶加入到Enzymatic lysisbuffer中，配置成50mg/mL的溶解酶溶液；

缓冲液B为：60％的异丙醇；

缓冲液C为：2.5mol/L NaCl；

漂洗液D最终浓度组成为：25mmol/L Tris-Acetate(pH7.8)，100mmol/L KOAc，10mmol/L Mg(OAc)₂，1mmol/L DTT；

缓冲液E终浓度组成为：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0。

实施例2

使用包含实施例1中的试剂的试剂盒提取4份大肠杆菌样品基因组，步骤如下：

步骤一，分别取1ml过夜培养的大肠杆菌菌液，加入1.5ml离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入100μl缓冲液E，50μl 2mol/L NaCl，100μl 10％SDS，20μl20mg/mL蛋白酶K溶液，震荡混匀。57℃水浴5min至细胞完全裂解。

步骤二，加入200μl缓冲液B与30μl磁珠悬浮液，震荡混匀然后瞬离，静置2min后瞬离，放磁力架上静置1min弃液。

步骤三，加入500μl缓冲液C，震荡混匀然后瞬离，静置2min后瞬离，放磁力架上静置1min弃液。

步骤四，加入500μl漂洗液D，震荡混匀然后瞬离，静置2min然后放磁力架上静置1min弃液。

步骤五，最后加入50μl缓冲液E，震荡混匀，静置2min后瞬离，放磁力架上静置1min收集上清。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

步骤六，琼脂糖凝胶电泳检测(电压100V，电流80mA)：对所得4份回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示所获得全基因组产物平行性好，条带清晰，无杂带，表明提取的基因组完整性好，且无其它污染。

实施例3

使用实施例1中的试剂盒提取4份金黄色葡萄球菌样品基因组，步骤如下：

步骤一，分别取1ml过夜培养的金黄色葡萄球菌菌液，加入1.5ml离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入100μl缓冲液E，100μl溶菌酶溶液重悬菌液，37℃水浴10min。再加入50μl 2mol/L NaCl，100μl 10％SDS，20μl 20mg/mL蛋白酶K溶液，震荡混匀。57℃水浴1h至细胞完全裂解。

实施例4

4.1细菌基因组提取试剂盒中试剂的配制：

磁珠悬浮液为：20mg/mL，100nm的单分散硅羟基磁珠；

裂解液A为：包含TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0)、8％SDS(取0.8g SDS粉末，用超纯水溶解定容至10mL)、1.5mol/L NaCl、15mg/mL蛋白酶K(蛋白酶K溶解于Enzymatic lysis buffer中)；

溶菌酶缓冲液：需新鲜配置，使用前将相应的溶解酶加入到Enzymatic lysisbuffer中，配置成40mg/mL的溶解酶溶液；

缓冲液B为：50％的异丙醇；

缓冲液C为：2.3mol/L NaCl；

漂洗液D最终浓度组成为：20mmol/L Tris-Acetate(pH7.8)，80mmol/L KOAc，8mmol/L Mg(OAc)₂，0.8mmol/L DTT；

洗脱液E终浓度组成为：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0。

4.2使用包含上述4.1中的试剂的试剂盒提取4份大肠杆菌样品基因组，步骤如下：

步骤一，分别取1ml过夜培养的大肠杆菌菌液，加入1.5ml离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入100μl缓冲液E，50μl 1.5mol/L NaCl，100μl 8％SDS，20μl 15mg/mL蛋白酶K溶液，震荡混匀。50℃水浴8min至细胞完全裂解。

步骤六，琼脂糖凝胶电泳检测(电压100V，电流80mA)：对所得4份回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示所获得全基因组产物平行性好，条带清晰，无杂带，表明提取的基因组完整性好，且无其它污染(与图1无明显实质性差异)。

实施例5

5.1细菌基因组提取试剂盒中试剂的配制：

磁珠悬浮液为：30mg/mL，100nm的单分散硅羟基磁珠；

裂解液A为：包含TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0)、12％SDS(取1.2g SDS粉末，用超纯水溶解定容至10mL)、2.5mol/L NaCl、25mg/mL蛋白酶K(蛋白酶K溶解于Enzymatic lysis buffer中)；

溶菌酶缓冲液：需新鲜配置，使用前将相应的溶解酶加入到Enzymatic lysisbuffer中，配置成60mg/mL的溶解酶溶液；

缓冲液B为：70％的异丙醇；

缓冲液C为：3.0mol/L NaCl；

漂洗液D最终浓度组成为：30mmol/L Tris-Acetate(pH7.8)，120mmol/L KOAc，12mmol/L Mg(OAc)₂，1.2mmol/L DTT；

洗脱液E终浓度组成为：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH为8.0。

5.2使用包含上述4.1中的试剂的试剂盒提取4份大肠杆菌样品基因组，步骤如下：

步骤一，分别取1ml过夜培养的大肠杆菌菌液，加入1.5ml离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入100μl TE缓冲液，50μl 2.5mol/L NaCl，100μl 12％SDS，20μl 25mg/mL蛋白酶K溶液，震荡混匀。60℃水浴5min至细胞完全裂解。

实施例6

对实施例2-5提取得到的DNA的纯度和总量进行测定，测定结果详见下表1

表1

样品	OD260/280	提取得到的DNA总量
			实施例2	1.81	20μg
实施例3	1.83	19μg
			实施例4	1.83	15μg
实施例5	1.82	18μg

备注：上述各实施例中用到的操作步骤“瞬离”是指：瞬时离心，即短时间离心处理，且采用转速小的小离心机即可完成，无需高速离心。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内盛有裂解液和缓冲液C，所述裂解液的组成包括TE缓冲液、SDS、NaCl和蛋白酶K溶液，所述SDS溶液的浓度为0.08-0.12g/mL，所述NaCl溶液的浓度为1.5-2.5mol/L；所述缓冲液C用于在磁珠与细菌的裂解液结合后对磁珠上吸附的DNA进行处理使DNA脱水、沉淀，所述缓冲液C为浓度2.3-3.0mol/L NaCl。

2.根据权利要求1所述的磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述裂解液中TE缓冲液、SDS、NaCl和蛋白酶K溶液的体积比为10:10:5:2。

3.根据权利要求1所述的磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括下述中的任意一种或多种试剂：磁珠悬浮液、溶菌酶溶液、缓冲液B、漂洗液D和洗脱液E；所述磁珠悬浮液的浓度为20-30mg/mL，所述溶菌酶溶液的浓度为40-60mg/mL，所述缓冲液B为体积分数50-70％的异丙醇，所述漂洗液D包括终浓度为20-30mmol/L的Tris-Acetate、80-120mmol/L的KOAc、8-12mmol/L的Mg(OAc)₂、0.8-1.2mmol/L DTT，所述Tris-Acetate的pH＝7.8，所述洗脱液E为TE缓冲液。

4.根据权利要求3所述的磁珠法提取细菌基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬浮液的浓度为25mg/mL，所述溶菌酶溶液的浓度为50mg/mL，所述缓冲液B为体积分数60％的异丙醇，所述漂洗液D包括终浓度为25mmol/L的Tris-Acetate、100mmol/L的KOAc、10mmol/L的Mg(OAc)₂、1mmol/L DTT，所述溶菌酶溶液通过向溶菌酶中加入Enzymaticlysis buffer配制得到；所述SDS溶液的浓度为0.1g/mL，所述NaCl溶液的浓度为2mol/L，所述缓冲液C的浓度为2.5mol/L。

5.一种基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，采用如权利要求1-4中任意一项所述的试剂盒对细菌基因组DNA进行提取。

6.根据权利要求5所述的基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)向细菌菌体中加入裂解液，震荡混匀，50-60℃保温至细胞裂解完全；(2)加入缓冲液B与磁珠悬浮液，震荡混匀后瞬时离心，静置1min后再次瞬时离心后放置于磁力架上静置30s后弃液；(3)向步骤(2)所得样品中加入缓冲液C，震荡混匀后瞬时离心，静置1min后再次瞬时离心后放置于磁力架上静置30s后弃液；(4)向步骤(3)所得样品中加入漂洗液D，震荡混匀后瞬时离心，静置1min，之后置于磁力架上静置30s弃液；(5)向步骤(4)所得样品中加入洗脱液E，震荡混匀，静置1min后瞬时离心，放置磁力架上静置30s，收集上清即得细菌基因组DNA提取液。

7.根据权利要求6所述的基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，采用该方法提取革兰氏阳性菌的DNA时，在加入所述裂解液之前还包括向菌体中加入TE缓冲液和溶菌酶溶液重悬菌体、37℃水浴10-15min的步骤。

8.根据权利要求7所述的基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述TE缓冲液、溶菌酶溶液和缓冲液B的体积比为1:1:2。

9.根据权利要求6所述的基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，提取革兰氏阴性细菌的基因组DNA时，所述步骤(1)的保温时间为5-8min；提取革兰氏阳性细菌的基因组DNA时，所述步骤(1)的保温时间为30-60min。

10.根据权利要求5-9中任意一项所述的基于磁珠提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述裂解液、缓冲液B、磁珠悬浮液、缓冲液C、漂洗液D和洗脱液E的体积比为27:20:3:50:50:5。