CN101824450A - 基于磁珠提取细菌基因组试剂盒及其提取方法 - Google Patents

Abstract

一种基于磁珠提取细菌基因组试剂盒及其提取方法，属于分子生物技术领域。试剂盒，包括溶菌酶工作液、细菌重悬裂解液、RNA酶工作液、菌体蛋白沉淀液、自研磁珠、异丙醇、漂洗液、DNA洗脱液。试剂盒中提供的高效溶菌酶工作液用于裂解革兰阳性细菌细胞壁。通过菌体蛋白沉淀液去除大部分残壁菌体及蛋白等杂质，再利用单分散磁性微球特异性吸附基因组DNA，仅需简单的漂洗步骤后，就可以将磁性微球上的基因组DNA洗脱下来。本试剂盒提取的基因组DNA产量高、纯度好、片段完整，适合于PCR检测、酶切反应、核酸杂交及构建文库等下游试验。

Description

基于磁珠提取细菌基因组试剂盒及其提取方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，特别是提供了一种基于磁珠提取细菌基因组DNA的试剂盒及其提取方法。

技术背景

核酸是现代分子生物学、生物医学研究中的重要课题。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。因此，无论是进行核酸结构与功能的研究，还是进行基因改造工程、蛋白质工程，首先需要对核酸进行分离与纯化。

从复杂生物样品中分离纯化核酸或者制备核酸模板是许多分子生物学技术中的关键步骤。由于样品基质中存在大量的细胞裂解产物如蛋白质和其他杂质，它们可能抑制下游处理中使用的聚合酶和限制性内切酶的活性，也可能导致目标核酸的降解，因此，在进行核酸测序、扩增、杂交、酶切等操作之前都需要首先采取适当的方法将核酸从混合物中分离出来。常规的核酸提取方法涉及细胞裂解、有机溶剂萃取、沉淀和离心等步骤，传统方法如苯酚氯仿抽提法、Silica管柱法、高盐溶液法等。

细菌基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等，而随着PCR及荧光定量PCR技术的迅速发展，一些食品致病菌(微生物)：如金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、出血性大肠杆菌O157:H7、单增李斯特、沙门氏菌、阪崎肠肝菌等革兰氏阳性或革兰氏阴性菌的分子检测得以快速、准确的鉴定，也需要对其进行基因组DNA的提取。目前，商品化核酸提取试剂盒的使用具有方便、快捷、无需有机溶剂酚仿抽提等优点，大大的替代了传统的核酸提取方法。尤其是新近发展起来的基于磁性微粒的提取方法使得核酸纯化过程大为简化，已经在欧美国家获得了广泛的应用。

基于磁性微粒的核酸纯化技术是利用亲水性磁性微粒吸附样品溶液中的核酸分子，在外加磁场作用下将负载核酸的磁性微粒从样品溶液中分离出来，经适当清洗后，加入适当的溶液使得核酸从磁性微粒上脱附即得到纯化核酸。核酸纯化步骤不仅可以在常规的试管中以手工方式进行，也可以在96孔或382孔微孔板中以自动化方式进行。基于磁性微粒的核酸分离纯化试剂盒以其操作简便快捷和省时省力的特点，成为目前分子生物学和基础研究的理想的辅助工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于磁珠提取细菌基因组DNA的试剂盒及其提取方法，特别涉及葡萄球菌属、链球菌属等革兰阳性细菌细胞壁难于裂解的困难，试剂盒中提供的高效溶菌酶工作液用于裂解革兰阳性细菌细胞壁。通过菌体蛋白沉淀液去除大部分残壁菌体及蛋白等杂质，再利用单分散磁性微球特异性吸附基因组DNA；仅需简单的漂洗步骤后，就可以将磁性微球上的基因组DNA洗脱下来。

本发明的试剂盒包括溶菌酶工作液、细菌重悬裂解液、RNA酶工作液、菌体蛋白沉淀液、磁珠、异丙醇、漂洗液、DNA洗脱液等八种组分，各组分内容如下：

溶菌酶工作液：10-20mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)盐，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合剂、体积分数0.8-1.2％ Trition-X-100，溶菌酶的终浓度为20-30mg/mL；

细菌重悬裂解液：10-20mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)盐，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合剂、50-100mmol/LNa盐、质量浓度2-4％的SDS(十二烷基硫酸钠)和终浓度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K；

RNA酶工作液：为核糖核酸酶A，其终浓度10-20mg/mL；

菌体蛋白沉淀液：5-8mol/L胍盐、2-3mol/L Na盐，PH值6.5-7.5；

磁珠：粒径1-2μm的单分散磁性微球；

异丙醇：分析纯的异丙醇；

漂洗液：10-20mmol/L Tris盐，PH值6.8-7.2、100-200mmol/L Li盐、1-4mmol/L螯合剂与无水乙醇按1∶3-5的体积比混合而成；

DNA洗脱液：10-20mmol/LTris(三羟甲基氨基甲烷)，PH7.5-8.5。

本发明上述试剂盒的提取方法步骤如下：

提取步骤为：将1-2mL供提取细菌培养液放入1.5～2.0mL离心管中，离心8000-10000r/min、3-5min，倒掉培养液并尽量吸净；加溶菌酶工作液100-300μl，涡流混匀室温或37℃，10-30min；加细菌重悬裂解液：150-250μl，混匀，65-70℃、10-20min；加RNA酶工作液5-15μl混匀，室温放置5-10min；加菌体蛋白沉淀液：250-500μl，上下颠倒数次，混匀，离心12000r/min，3-5min，贴上清表面吸取350-700μl，放到另一离心管中；加入10-20μl磁珠、200-400μl异丙醇，水平转动1-2min；磁分离至完全清澈，吸去上清，加漂洗液600-800μl，重悬磁珠核酸复合物，清洗2-3次；放在磁分离器上尽量吸去乙醇，20～37℃放置数分钟，直至闻不到酒精气味；加50-80μl DNA洗脱液，至离心管于55-65℃水浴锅中5-10min，以完全洗脱基因组DNA；磁分离30-40s，吸取上清于另一离心管中，备用或-20℃储存。

本发明的优点在于，试剂盒提取的基因组DNA产量高、纯度好、片段完整，适合于PCR检测、酶切反应、核酸杂交及构建文库等下游试验。

附图说明：

图1为基因组DNA的PCR鉴定。

图2为两种试剂盒提取DNA琼脂糖电泳比较。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌基因组DNA提取

实验材料为革兰阳性致病菌：金黄色葡萄球菌及乙型溶血性链球菌株，按照各自的生长习性，配制增菌培养基，36±1℃、摇菌16h。

基因组DNA提取：

将1-2mL金黄色葡萄球菌及乙型溶血性链球菌培养液放入1.5mL离心管中，离心10000r/min、3min，倒掉培养液并尽量吸净；加溶菌酶工作液200μl，涡流混匀室温或37℃，30min；加细菌重悬裂解液：200μl，混匀，70℃、10min；加RNA酶工作液10μl混匀，室温放置10min；加菌体蛋白沉淀液：350μl，上下颠倒数次，混匀，离心12000r/min，5min，贴上清表面吸取350μl，放到另一离心管中；加入20μl磁珠、200μl异丙醇，水平转动1min；磁分离至完全清澈，吸去上清，加漂洗液750μl，重悬磁珠核酸复合物，清洗2次；放在磁分离器上尽量吸去乙醇，37℃放置数分钟，直至闻不到酒精气味；加50μl DNA洗脱液，至离心管于65℃水浴锅中10min，以完全洗脱基因组DNA；磁分离30s，吸取上清于另一离心管中，备用或-20℃储存。

试剂盒提取步骤：

1、向1.5mlEP管中加入过夜培养细菌，13,000rpm离心2min；2、离心完毕后，丢弃上清液体，留取底部细胞团块(用移液器尽量移除多余的残留液体)。用80μl双蒸水重悬细胞团块吹吸混匀至无可见团块(可用漩涡混合器剧烈震荡)；3、向上述重悬细胞液中，加入20μl Proteinase K(10mg/ml)和100μl gDNA Lysis Buffer，轻弹离心管混合均匀，放置于58℃水浴中孵育30min，期间轻柔颠倒几次EP管以助尽快裂解；4、裂解完全后取出离心管，加入400μl gDNA Binding Buffer和10μl Rnase A(20mg/ml)，上下颠倒混合均匀，并室温静置5min(延长静止时间可减少RNA污染，可延长至10min)；5、向步骤4产物中加入200μl无水乙醇，颠倒混合均匀；6、13,000rpm室温离心2min；7、吸取上清液转入至吸附柱中(尽量不要吸入未完全消化的不溶物，以免堵塞离心柱)，13000rpm室温离心30s，弃废液；8、向吸附柱中加入500μl的WashingBuffer(确保已加入无水乙醇)，13,000rpm室温离心30s，弃收集管中废液；9、重复步骤8一次，弃收集管中废液；10、将吸附柱放回空收集管中，13,000rpm空离2min；11、取出吸附柱，放入新的1.5mlEP管中室温静置1min使痕量乙醇完全挥发；12、向吸附柱的柱面加入30-100μl的Elution Buffer，室温放置1min，然后13,000rpm离心2min，所得液体即为基因组DNA。

2结果分析

基因组DNA的PCR鉴定

以提取的基因组DNA为模板，分别使用特异性引物对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因、乙型溶血性链球菌编码M蛋白的emm基因进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到了687bp、1154bp的目的片段。

提取的基因组DNA产量及纯度检测

培养的1mL金黄色葡萄球菌及乙型溶血性链球菌液，分别使用本试剂盒和A公司试剂盒进行基因组DNA的提取，得到的基因组DNA经紫外分光光度计检测260nm及280nm的吸光度值，DNA纯度用OD260nm/OD280nm比值来衡量(1.8-2.0)、DNA浓度(μg/mL)＝OD260nm*稀释倍数*50、DNA产量＝DNA浓度*洗脱体积。

表1.两种试剂盒提取DNA结果比较

从表1可以看出：两种试剂盒提取得到的基因组DNA纯度上来说，都达到了一定的要求，OD260nm/OD280nm比值都在1.8-1.9之间，A公司试剂盒结果要略好一些，但本发明所得的DNA产量明显提高，为A公司试剂盒DNA产量的1.5倍。

基因组DNA片段完整性检测

分别取2μl提取的基因组DNA，于0.8％的琼脂糖凝胶上100V电压，电泳15min，用紫外凝胶成像系统进行照相，如图1所示。

从图1可以看到，两种试剂盒提取得到的基因组DNA片段都在23Kb以上，A公司试剂盒提取得到的基因组DNA片段大约30Kb左右，而本试剂盒提取得到的基因组DNA片段在50Kb以上。

Claims (2)

1.一种基于磁珠提取细菌基因组DNA的试剂盒，包括溶菌酶工作液、细菌重悬裂解液、RNA酶工作液、菌体蛋白沉淀液、磁珠、异丙醇、漂洗液、DNA洗脱液；

溶菌酶工作液：10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合剂、体积分数0.8-1.2％Trition-X-100，溶菌酶的终浓度为20-30mg/mL；

细菌重悬裂解液：10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合剂、50-100mmol/L Na盐、质量浓度2-4％的十二烷基硫酸钠和终浓度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K；

RNA酶工作液：为核糖核酸酶A，其终浓度10-20mg/mL；

菌体蛋白沉淀液：5-8mol/L胍盐、2-3mol/L Na盐，PH值6.5-7.5；

磁珠：粒径1-2μm的单分散磁性微球；

异丙醇：分析纯的异丙醇；

漂洗液：10-20mmol/L Tris盐，PH值6.8-7.2、100-200mmol/L Li盐、1-4mmol/L螯合剂与无水乙醇按1∶3-5的体积比混合而成；

DNA洗脱液：10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，PH7.5-8.5。

2.一种权利要求1所述试剂盒的提取方法，其特征在于，提取步骤为：将1-2mL供提取细菌培养液放入1.5～2.0mL离心管中，离心8000-10000r/min、3-5min，倒掉培养液并尽量吸净；加溶菌酶工作液100-300μl，涡流混匀，室温～37℃，10-30min；加细菌重悬裂解液：150-250μl，混匀，65-70℃、10-20min；加RNA酶工作液5-15μl混匀，室温放置5-10min；加菌体蛋白沉淀液：250-500μl，上下颠倒数次，混匀，离心12000r/min，3-5min，贴上清表面吸取350-700μl，放到另一离心管中；加入10-20μl磁珠、200-400μl异丙醇，水平转动1-2min；磁分离至完全清澈，吸去上清，加漂洗液600-800μl，重悬磁珠核酸复合物，清洗2-3次；放在磁分离器上尽量吸去乙醇，20～37℃放置，直至闻不到酒精气味；加50-80μl DNA洗脱液，至离心管于55-65℃水浴锅中5-10min，以完全洗脱基因组DNA；磁分离30-40s，吸取上清于另一离心管中，备用或-20℃储存。

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