CN102229925A - 一种增强的磁珠法核酸提取方法 - Google Patents

Abstract

当前的磁珠法核酸提取方法有两方面不足：首先是RNA的提取效率较低；其次是核酸提取步骤繁多，裂解与结合分为两步，磁珠在裂解完成之后才能加入溶液中结合核酸，不利于全自动化应用。本发明提供一种增强的磁珠法核酸提取方法，其特征在于核酸提取仅需4个步骤，分别是裂解与结合、清洗1、清洗2、洗脱，而前3个步骤都通过加入异丙醇增强了溶液中磁珠吸附核酸的作用，从而增强了磁珠法核酸提取的效率，在应用于RNA提取时提供了一种高效提取RNA的方法。本发明的特征还在于，裂解与结合一步完成，在应用于自动化核酸提取时每一步骤的反应试剂可以预先灌装入该步骤对应的反应舱内，使本发明更适用于全自动化应用。

Description

一种增强的磁珠法核酸提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种增强的磁珠法核酸提取方法，具体涉及一种通过异丙醇增强溶液中磁珠吸附核酸的作用从而增强核酸提取效率、以及通过核酸提取的裂解与结合步骤一步完成从而增强全自动化应用程度的磁珠法核酸提取方法。

背景技术

核酸包括脱氧核糖核酸(RNA)和核糖核酸(DNA)两类，已知核酸是一切生物体的遗传物质，在细胞主要存在于细胞核内，在病毒存在于病毒衣壳内。细胞是生物体的结构和功能的基本单位，已知除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，但病毒生命活动也必须在细胞中才能体现。

以核酸为研究对象的生物技术，包括对核酸的提取、克隆、扩增、检测、测序等一系列技术，近年来飞速发展，这些技术目前不仅在研究单位使用，而且在社会生活中多个职能部门已经广泛应用。而核酸研究的第一步，就是从各种生物样品中提取核酸，核酸提取的效率成为下游核酸研究能否成功的制约因素。由于核酸提取的重要地位，科学家开发了一系列核酸提取方法，包括用酚/氯仿等有机溶剂抽提的传统方法、操作简便但DNA纯度低的螯合树脂法、目前已经基本淘汰的玻璃粉吸附法、当前主流的硅胶膜吸附柱法、抗DNA单克隆抗体的免疫亲和法、自动化平台广泛应用的磁珠法核酸提取方法等等。

磁珠法核酸提取方法是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠(以下简称磁珠)为载体，通过磁珠在高盐溶液中吸附核酸而在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附的原理进行核酸提取的方法，通常使用的纳米级磁珠的直径在100nm～1000nm之间。由于磁珠的以下特点，磁珠法核酸提取方法非常适用于自动化应用。

第一，磁珠是由磁性粒子与各种含活性功能基团的材料复合而成的具有一定磁性及特殊表面结构的粒子。通过共聚合和表面改性，磁珠表面可被赋予多种活性功能基团，如-COOH、-NH2等，也可共价结合酶、细胞、抗体等生物活性物质。因为具有磁性，磁珠可在外加磁场的作用下方便地被定位、导向和分离，有学者因此将其形象地称为动力粒子(Dynabead)；

第二，相对于普通磁性颗粒材料，磁珠具有良好的表面效应和体积效应，具体反映在其比表面积激增，微球官能团密度和选择性吸附能力增大，吸附平衡时间大大缩短；

第三，磁珠具有很好的选择性磁响应性，当磁性四氧化三铁晶体的粒径小于一定值时，具有超顺磁性，从而可以避免在使用中粒子之间发生磁性团聚；

第四，磁珠的物理化学性质稳定，具备一定的机械强度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解，其内含的磁性物质不易被氧化、磁性能不易下降，并且具有一定的生物相容性，不会对生物体造成明显的伤害。

由于以上原因，磁珠法核酸提取方法得到广泛应用，全球著名的生物技术公司，如Roche、Qiagen、BioMerieux、Life Technology、Promega、Chemagen、Ambion等都建立了各自的磁珠法核酸提取方法，Ambion在RNA提取领域尤为出色。然而，不同的磁珠法核酸提取方法，核酸提取效率差别很大，说明磁珠法核酸提取方法仍然有进一步增强其核酸提取效率的必要性。

以磁珠法核酸提取方法应用于基因组DNA提取为例，近来英国国家遗传学参考实验室(NationalGenetics Reference Laboratory)评价了Chemagen Module I、DRI CST 20ul、Promega MagnaSil、Qiagen EZ1、Roche MagNAPure Compact等多种基于磁珠的自动化核酸提取系统(包括自动化平台和磁珠法核酸提取试剂)，用不同系统分别进行100份全血样品的基因组DNA提取，比较下列指标：(1)DNA产量，包括平均产量、平均相对产量ug/ml blood、标准差(相对产量)、提取失败的样品所占百分比(以产量＜5ug/ml blood判断)；(2)DNA纯度，包括OD260/OD280平均值、标准差、OD260/OD280在1.6-2.0之间的样品所占百分比；(3)PCR，对位于人基因组DNA不同位点的5个基因进行PCR扩增，指标包括5个基因全部扩增成功的样品所占百分比、只有1-4个基因扩增成功的样品所占百分比、无基因扩增的样品所占百分比、交叉污染样品数。(4)所提取DNA的完整性，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳的＞20kb的DNA样品所占百分比来判断。

从比较结果来看，即使是这些全球著名品牌，不同品牌的磁珠法核酸提取方法在基因组DNA提取效率方面也有很大差别。Qiagen EZ1、Chemagen Module I的效果最好，被评价为Excellent；Roche MagNAPureCompact次之，被评价为Very Good；Promega MagnaSil次之，被评价为Generally Good but Yield Poor DRICST 20ul最差，被评价为Poor。研究认为，这些著名品牌的基因组DNA提取效率的差别，主要是磁珠法核酸提取试剂本身的差别，即方法本身的差别，而自动化平台只是帮助这个方法实现自动化步骤的工具。

有别于磁珠法核酸提取方法在DNA提取领域的广泛应用，在RNA提取领域其应用程度相当低，远远不能满足市场需要，首要原因是当前的磁珠法提取RNA的效率与硅胶膜吸附柱法相比较低，在应用于病毒RNA提取时微量病毒RNA提取的差异足以造成判断该样品结果为阳性或阴性的差异。原因之二是当前的磁珠法核酸提取方法，其裂解与结合步骤通常分为两步，需要在裂解完成之后再加磁珠结合核酸，不利于全自动化核酸提取应用。原因之三是进口的磁珠法RNA提取试剂盒的成本过高，而磁珠法RNA提取的主要优势在于自动化，如果不利于自动化操作或自动化成本过高则相比其他方法无优势。

真正意义上的全自动化核酸提取是“一键式操作”，是指手工核酸提取每一步骤的所有反应试剂可以预先灌装入该步骤对应的封闭反应舱内，使用时只需要将样品加入指定反应舱，按“开始键”即可，磁珠将通过磁力作用在不同的反应舱内自动转移，自动完成核酸提取的全过程。这种自动化平台由于其所有试剂预先封装的特点，又称为封闭式自动化平台。封闭式自动化平台的前提在于裂解与结合的步骤一步完成，因此裂解与结合的步骤的所有反应试剂可以预先灌装入该步骤对应的封闭反应舱内。如果裂解与结合的步骤不能一步完成，则只能使用开放式自动化平台进行核酸提取，开放式自动化平台的本质在于通过移液器自动化转移试剂，磁珠溶液只能在裂解步骤完成之后通过自动化平台的移液器转移入样品混合溶液，然而开放式自动化平台并非严格意义上的全自动化反应平台，因为在使用前仍需人工准备所有试剂、Tip头、96孔板等耗材，并将不同试剂置入不同的开放式反应舱内。

在RNA提取领域，当前使用的主流RNA提取方法仍然是以Qiagen为代表的硅胶膜吸附柱法，该方法具有提取效率高的优点，但需要手工操作完成，其操作步骤繁琐，工作量大，效率低，只适用于处理少数样品；同时手工操作增加了RNA酶污染引起的RNA提取失败的风险，手工操作的重复性、稳定性差；此外，在应用于临床时，在操作过程中需要多次接触病原体样品，操作者有严重的心理抵触情绪。

临床上作为病毒遗传物质的RNA可以作为病毒是否存在的依据，在2003年非典病毒、2004年禽流感病毒、2009年甲流病毒肆虐全球时，快速、有效、准确的病毒检测手段就是从疑似病人的呼吸道样品(如拭子)中提取病毒RNA，通过比对该病毒RNA序列是否与某种已知病毒的RNA序列相符(使用包括特异性引物、特异性Taqman荧光探针的荧光RT-PCR检测方法)，来确定是何种病毒RNA，从而诊断是何种病毒。自2003年非典以来，全国1000家左右的三甲医院，400家左右的地市级疾病控制中心，绝大部分已经配置PCR仪/荧光PCR仪，建立了病原微生物的分子诊断实验室，开展了广泛的包括HBV、HCV、HIV、SARS、AIV、H1N1等病毒在内的分子诊断业务，分子诊断的巨大市场培育了一大批诊断试剂的生产厂家，为首的以科华、复星、达安等上市公司为代表，都以分子诊断为主营业务板块，然而当前的以硅胶膜吸附柱法为代表的病毒RNA提取方法显然已经不能适应分子诊断业务发展的需要。

因此，本领域迫切需要开发一种增强的磁珠法核酸提取方法，以进一步提高磁珠法核酸提取的效率，尤其是提高磁珠法RNA提取的效率，从而提供一种高效提取RNA的方法；同时该方法的核酸提取过程具有裂解与结合步骤一步完成的特点，使该方法更适用于全自动化核酸提取应用。

发明内容

本发明目的就是提供一种增强的磁珠法核酸提取方法，不仅增强磁珠法核酸提取效率，而且增强磁珠法核酸提取的全自动化应用程度。

为实现上述目的，本发明提供一种通过异丙醇增强溶液中磁珠吸附核酸的作用从而增强核酸提取效率、以及通过核酸提取的裂解与结合步骤一步完成从而更适用于全自动化核酸提取应用的磁珠法核酸提取方法，它包括步骤：

(1)裂解与结合：将“N”μl生物样品(10≤“N”≤2000，)加入到包含“2N”μl裂解液、“0.25N”μl蛋白酶K溶液、“N”μl磁珠-异丙醇溶液(0.3～0.7mg磁珠溶于100μl异丙醇)的1.5ml离心管中，充分混匀，室温放置8～10min，使细胞、病毒裂解并释放其中的核酸、蛋白质，蛋白质在蛋白酶K的作用下降解，游离的核酸在裂解液中高浓度盐和异丙醇作用下吸附到磁珠表面，最后通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(2)清洗1：在离心管内加入“4N”μl含异丙醇的洗涤液A(“2N”μl洗涤液A+“2N”μl异丙醇)，充分混匀，第一次清洗磁珠，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(3)清洗2：在离心管内加入“4N”μl含异丙醇的洗涤液B(“2N”μl洗涤液B+“2N”μl异丙醇)，充分混匀，第二次清洗磁珠，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(4)洗脱：在离心管内加入“0.2N～2N”μl洗脱液，充分混匀，56℃加热洗脱3～5min，使核酸从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，即为提取好的核酸。

所述的生物样品包括细胞、全血、动物组织匀浆液、植物组织匀浆液等有细胞液体样品，也包括血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、尿液、病毒培养液等无细胞液体样品；所述的异丙醇来自商品化的成品，纯度＞99％；所述的蛋白酶K来自商品化的成品，蛋白酶K溶液的浓度为15～25mg/ml，其他成分包括：50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH7.0-8.0)；所述的磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，来自商品化的成品，磁珠直径在100-1000nm之间，具有核壳结构，即超顺磁性核心及氧化硅外壳。

所述的裂解与结合步骤，此步骤的特征在于，生物样品、异丙醇与裂解液的体积比为1∶1∶2，异丙醇增强了裂解液中高浓度盐(盐浓度≥4M)主导的磁珠吸附核酸的作用，裂解液中高浓度盐的成分选自下组中的任意一种：盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、碘化钾；裂解液的其他成分包括：1～2％曲拉通(TritonX-100)，1～2％壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)，1～2％吐温-20(Tween-20)，10-20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH7.0-8.0)，1-2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

所述的清洗1步骤，此步骤的特征在于，异丙醇与洗涤液A的体积比为1∶1，异丙醇增强了洗涤液A中高浓度盐(盐浓度≥1.3M)主导的磁珠吸附核酸的作用，洗涤液A中高浓度盐的成分选自下组中的任意一种：盐酸胍、氯化钾、氯化钠；洗涤液A的其他成分包括：0.1～0.5％曲拉通(Triton X-100)，0.1～0.5％吐温-20(Tween-20)，10-20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH7.0-8.0)，1-2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

所述的清洗2步骤，此步骤的特征在于，异丙醇与洗涤液B的体积比为1∶1，异丙醇增强了洗涤液B中高浓度盐(盐浓度≥1M)主导的磁珠吸附核酸的作用，洗涤液B中高浓度盐的成分选自下组中的任意一种：氯化钾、氯化钠；洗涤液B的其他成分包括：0.1～0.5％吐温-20(Tween-20)，10-20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH7.0-8.0)，1-2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

所述的洗脱步骤，此步骤的特征在于，洗脱液不含异丙醇，核酸从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，洗脱液的用量根据用户需要在0.2～2倍样品体积之间任选，洗脱液的成分选自下组：10-20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH7.0-8.0)，1-2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

本发明与现有的磁珠法核酸提取方法相比所具有的优点是：由于异丙醇增强了溶液中高浓度盐主导的磁珠吸附RNA的作用，从而增强了RNA提取效率，使本发明在应用于RNA提取时提供了一种高效提取RNA的方法；本发明的全部核酸提取过程仅需4个步骤，克服了现有方法的步骤繁多的缺点，裂解与结合步骤一步完成，使磁珠在核酸提取的开始步骤即可加入反应溶液中，从而使本发明在自动化应用时每一步骤的反应试剂可以预先灌装入对应的反应舱内，使用时只需要将样品加入指定反应舱，按“开始键”即可；比较现有方法的裂解与结合分为两步，磁珠在裂解完成之后才能加入反应溶液中进行核酸结合的步骤，本发明更适用于全自动化核酸提取应用。

附图说明

图1两种DNA的提取前后凝胶电泳图比较

图2本发明与Qiagen Viral RNA Mini Kit的病毒RNA提取效率比较

图3本发明与MagMAX^TM-96 viral RNA Isolation kit的病毒RNA提取效率比较

实施方式

在本发明中，裂解液中使用的高浓度盐的成分选自下组中的任意一种：盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、碘化钾，这些盐都是高离液盐。在正常的情况下，溶液中的核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度高离液盐的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，核酸能有效并牢固吸附到磁珠表面，只有在低盐环境下才能解吸附。因此，本发明的思路从如何增强核酸与磁珠表面形成的疏水作用入手。通常的思路是提高裂解液中盐浓度，以增强裂解液中的疏水环境；但是现有的磁珠法核酸提取方法的裂解液中盐浓度已经很高，并且由于裂解液中的盐的饱和度的原因，盐浓度已经接近极限，因此提高裂解液中盐浓度的方法可操作性不强。

核酸与磁珠表面形成的疏水作用在于溶液的疏水环境，既然现有溶液的疏水环境已经接近极限，可否保留现有的疏水环境不变，通过添加新的有机物继续增强溶液的疏水环境？从而增强疏水作用？从此思路入手，本发明人选择在现有的裂解液之外直接加入乙醇、异丙醇、Triton X-100，Tween-20，NP-40等有机物以增强溶液中的疏水环境，经过广泛而深入的研究，摸索上述成分的最佳比例及反应条件，最终建立有效的通过加入异丙醇增强核酸与磁珠表面的疏水作用的方法。

现有的磁珠法核酸提取方法将裂解与结合分为两步，在结合步骤中通常使用结合缓冲液，结合缓冲液由于是水溶液，因此与本发明的直接使用异丙醇相比，在增强核酸与磁珠表面的疏水作用方面要差一些。现有的磁珠法核酸提取方法将裂解与结合分为两步，原因之一是认为裂解步骤中细胞裂解及核酸释放只能有裂解液及蛋白酶K的作用，加入其他成分将会影响裂解的效果，从而影响核酸提取的效果。本发明人经过大量研究，发现在裂解步骤中添加适当比例的磁珠-异丙醇溶液(1/2裂解液体积)，不会影响裂解的效果，同时由于异丙醇增强了裂解液中高浓度高离液盐形成的核酸与磁珠表面的疏水作用，使结合的步骤与裂解的步骤同时完成，从而极大程度上简化了核酸提取的步骤，使本发明在自动化应用时每一步骤的反应试剂可以预先灌装入对应的反应舱内，使用时只需要将样品加入指定反应舱，按“开始键”即可。

本文所用术语“磁珠”指超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，磁珠直径在100-1000nm之间，具有核壳结构，即超顺磁性核心及氧化硅外壳。术语“磁珠法核酸提取方法”是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠(以下简称磁珠)为载体，通过磁珠在高盐溶液中吸附核酸而在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附的原理进行核酸提取的方法。

根据本发明指导，本领域技术人员能够配制核酸提取试剂盒，用于生物样品的DNA/RNA提取。

在本发明的优选实施例中，使用本发明建立的磁珠法核酸提取方法，进行两种已知量DNA的DNA提取，通过计算提取后所得DNA与提取前已知量DNA的比值，计算本发明的DNA提取效率，结果表明，本发明对两种不同DNA的提取效率都达到85～90％。另一优选实施例中，使用本发明建立的磁珠法核酸提取方法，进行丙肝阳性血浆样品的丙肝病毒RNA提取，并与QIAGEN Viral RNA Mini Kit(硅胶膜吸附柱法)比较，结果表明，本发明的磁珠法病毒RNA提取效率与QIAGEN硅胶膜吸附柱法的病毒RNA提取效率处于同一水平，本发明在全自动化核酸提取应用方面具有优势。另一优选实施例中，使用本发明建立的磁珠法核酸提取方法，进行丙肝阳性血浆样品的丙肝病毒RNA提取，并与Ambion MagMAX^TM-96 viralRNAIsolation kit(磁珠法核酸提取方法)比较，结果表明，本发明的磁珠法病毒RNA提取效率高于Ambion的磁珠法病毒RNA提取效率。

本发明主要特点在于：

由于异丙醇增强了溶液中高浓度盐主导的磁珠吸附核酸的作用，从而提供了一种核酸提取效率增强的磁珠法核酸提取方法。

在应用于RNA提取时提供了一种高效提取RNA的磁珠法RNA提取方法。

本发明的核酸提取全部过程仅需4个步骤，克服了现有方法的步骤繁多的缺点，裂解与结合步骤一步完成，使磁珠在核酸提取的开始步骤即可加入反应溶液中，从而使本发明在自动化应用时每一步骤的反应试剂可以预先灌装入对应的反应舱内，使用时只需要将样品加入指定反应舱，按“开始键”即可，因此本发明更适用于全自动化核酸提取应用。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1实验目的

使用已知量的λ-DNA(购自TAKARA，货号D3010，链长48502bp)，Salmon Sperm DNA(鲑鱼精DNA，购自Sigma，货号D1626，链长2000bp左右)为样品，用本发明建立的磁珠法核酸提取方法进行DNA提取，通过提取后洗脱所得DNA量与提取前已知量DNA比较，计算本发明的DNA提取效率。

2DNA提取

(1)裂解与结合：将100μl已知量DNA样品(λ-DNA，或Salmon Sperm DNA)加入到包含200μl裂解液、25μl蛋白酶K溶液(15～25mg/ml)、100μl磁珠-异丙醇溶液(0.3～0.7mg磁珠溶于100μl异丙醇)的1.5ml离心管中，充分混匀，室温放置8min，游离的DNA在裂解液中高浓度盐和异丙醇作用下吸附到磁珠表面，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(2)清洗1：在离心管内加入400μl含异丙醇的洗涤液A(200μl洗涤液A+200μl异丙醇)，充分混匀，第一次清洗磁珠，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(3)清洗2：在离心管内加入400μl含异丙醇的洗涤液B(200μl洗涤液B+200μl异丙醇)，充分混匀，第二次清洗磁珠，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(4)洗脱：在离心管内加入100μl洗脱液，充分混匀，56℃加热洗脱3～5min，使DNA从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，即为提取好的DNA。

3凝胶电泳及OD值测定

凝胶电泳：配制0.8％琼脂糖凝胶，上样量10μl，使用天能EPS100电泳仪，120V电泳20min后，使用天能2500凝胶成像系统观察结果；

OD值测定：使用Eppendorf BioPhotometer分光光度计，测定样品的OD值。

4结果分析

提取前已知量Salmon Sperm DNA(标准品S02)为11.18ug/0.1ml，提取后洗脱所得Salmon Sperm DNA(S5、S6、S7、S8)介于9.49～10.04μg/0.1ml之间，核酸提取效率介于84.84～89.80％之间(表1)，从提取前已知量S02比较提取后洗脱所得S5、S6、S7、S8的凝胶电泳图(图1，两种DNA的提取前后凝胶电泳图比较)来看，也证实核酸提取的效率非常高。

表1本发明应用于Salmon Sperm DNA提取的提取效率

DNA总量＝(A260-A340)*50μg/ml*洗脱体积(0.1ml)

提取前已知量λ-DN(标准品S02)A为9.6ug/0.1ml，提取后洗脱所得λ-DNA(1、2、3、4)介于8.2～8.7μg/0.1ml之间，核酸提取效率介于85.42～90.63％之间(表2)，从提取前已知量S2比较提取后洗脱所得1、2、3、4的凝胶电泳图(图1，两种DNA的提取前后凝胶电泳图比较)来看，也证实核酸提取的效率非常高。

表2本发明应用于λ-DNA提取的提取效率

DNA总量＝(A260-A340)*50μg/ml*洗脱体积(0.1ml)

实施例2

1实验目的

使用丙肝阳性血浆样品，浓度分别为A组、10倍稀释A组，每组浓度用本发明建立的磁珠法核酸提取方法提取2份，并用QIAGEN Viral RNAMini Kit(购自Qiagen，货号52904，硅胶膜吸附柱法)提取1份，进行同一样品的两种提取方法病毒RNA提取效率的比较。基于硅胶膜吸附柱法的Qiagen Viral RNA MiniKit为当前公认的病毒RNA提取金标准试剂，操作按说明书，以下不再赘述。

2病毒RNA提取

本发明在应用于RNA提取时，所用的所有试剂都要用1‰DEPC处理的超纯水配制，所用的所有耗材都要求无RNA酶污染。

(1)裂解与结合：将50μl丙肝阳性血浆加入到包含100μl裂解液、12.5μl蛋白酶K溶液(15～25mg/ml)、50μl磁珠-异丙醇溶液(0.3～0.7mg磁珠溶于100μl异丙醇)的1.5ml离心管中，充分混匀，室温放置8min，游离的RNA在裂解液中高浓度盐和异丙醇作用下吸附到磁珠表面，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(2)清洗1：在离心管内加入200μl含异丙醇的洗涤液A(100μl洗涤液A+100μl异丙醇)，充分混匀，第一次清洗磁珠，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(3)清洗2：在离心管内加入200μl含异丙醇的洗涤液B(100μl洗涤液B+100μl异丙醇)，充分混匀，第二次清洗磁珠，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(4)洗脱：在离心管内加入50μl洗脱液，充分混匀，56℃加热洗脱3～5min，使RNA从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，即为提取好的RNA。

3实时荧光RT-PCR

使用丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，购自上海科华生物工程股份有限公司，产品注册号：国食药监械(准)字2009第3400677号。按试剂盒说明书配制RT-PCR反应体系：RT-PCR反应液7.0μl，RT-PCR酶混合物5.0μl，丙肝引物及荧光探针混合物0.5μl，提取好的RNA 12.5μl，

使用ABI7500荧光PCR仪进行实时荧光RT-PCR反应，按试剂盒说明书的ABI7500反应程序如下：

50℃，25分钟。

94℃，2分钟。

93℃，3秒，55℃，15秒，72℃，15秒；5个循环。

93℃，3秒，60℃，45秒；42个循环。

4结果分析

表3本发明与Qiagen Viral RNAMini Kit的病毒RNA提取Ct值比较

本发明与Qiagen Viral RNA Mini Kit的病毒RNA提取效率比较，见图2。经过比较，发现本发明建立的磁珠法核酸提取方法与现有的病毒RNA提取金标准(Qiagen Viral RNA Mini Kit，硅胶膜吸附柱法)相比，在病毒RNA提取效率方面两者处于同一水平，而本发明应用于全自动化核酸提取时具有优势。

实施例3

1实验目的

使用丙肝阳性血浆样品，浓度分别为B组、10倍稀释B组，100倍稀释B组，1000倍稀释B组，每组浓度分别用本发明建立的磁珠法核酸提取方法提取2份，同时用MagMAX^TM-96 viral RNAIsolation kit(购自Ambion，货号AM1836，磁珠法RNA提取方法)提取2份，进行同一样品的两种磁珠法提取方法的病毒RNA提取效率比较。

Ambion是Applied Biosystems公司旗下子公司，是全球著名的RNA问题处理专家，其磁珠法病毒RNA提取试剂MagMAX^TM-96 viral RNA Isolation kit不仅推出时间较早，而且是美国FDA认证的用于提取禽流感病毒RNA的磁珠法RNA提取试剂，可以说是目前最好的磁珠法病毒RNA提取试剂。MagMAX^TM-96 viralRNA Isolation kit的操作按说明书，以下不再赘述。

2病毒RNA提取

按实施例2的“病毒RNA提取”操作。

3实时荧光RT-PCR

按实施例2的“实时荧光RT-PCR”操作，唯一不同是此处的荧光PCR仪使用Bio-Rad CFX-96荧光PCR仪。

4结果分析

表4本发明与MagMAX^TM-96 viral RNAIsolation kit的病毒RNA提取Ct值比较

本发明与MagMAX^TM-96 viral RNA Isolation kit的病毒RNA提取效率比较，见图3。经过比较，发现本发明建立的磁珠法病毒RNA提取方法与Ambion MagMAX^TM-96 viral RNA Isolation kit相比，本发明的病毒RNA提取效率更高。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此处应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种增强的磁珠法核酸提取方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)裂解与结合：将“N”μl生物样品(10≤“N”≤2000)加入到包含“2N”μl裂解液、“0.25N”μl蛋白酶K溶液、“N”μl磁珠-异丙醇溶液(0.3～0.7mg磁珠溶于100μl异丙醇)的1.5ml离心管中，充分混匀，室温放置8～10min，使细胞、病毒裂解并释放其中的核酸、蛋白质，蛋白质在蛋白酶K的作用下降解，游离的核酸在裂解液中高浓度盐和异丙醇作用下吸附到磁珠表面，最后通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(2)清洗1：在离心管内加入“4N”μl含异丙醇的洗涤液A(“2N”μl洗涤液A+“2N”μl异丙醇)，充分混匀，第一次清洗磁珠，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(3)清洗2：在离心管内加入“4N”μl含异丙醇的洗涤液B(“2N”μl洗涤液B+“2N”μl异丙醇)，充分混匀，第二次清洗磁珠，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液；

(4)洗脱：在离心管内加入“0.2N～2N”μl洗脱液，充分混匀，56℃加热洗脱3～5min，使核酸从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，转移洗脱液至新的离心管内，即为提取好的核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物样品包括细胞、全血、动物组织匀浆液、植物组织匀浆液等有细胞液体样品，也包括血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、尿液、病毒培养液等无细胞液体样品；所述的异丙醇纯度＞99％；所述的蛋白酶K溶液的浓度为15～25mg/ml，其他成分包括：50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH7.0-8.0)；所述的磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠，磁珠直径在100-1000nm之间，具有核壳结构，即超顺磁性核心及氧化硅外壳。

3.如权利要求1所述的方法的步骤(1)，此步骤的特征在于，生物样品、异丙醇与裂解液的体积比为1∶1∶2，异丙醇增强了裂解液中高浓度盐(盐浓度≥4M)主导的磁珠吸附核酸的作用，裂解液中高浓度盐的成分选自下组中的任意一种：盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、碘化钾；裂解液的其他成分包括：1～2％曲拉通(Triton X-100)，1～2％壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)，1～2％吐温-20(Tween-20)，10-20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH7.0-8.0)，1-2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

4.如权利要求1所述的方法的步骤(2)，此步骤的特征在于，异丙醇与洗涤液A的体积比为1∶1，异丙醇增强了洗涤液A中高浓度盐(盐浓度≥1.3M)主导的磁珠吸附核酸的作用，洗涤液A中高浓度盐的成分选自下组中的任意一种：盐酸胍、氯化钾、氯化钠；洗涤液A的其他成分包括：0.1～0.5％曲拉通(TritonX-100)，0.1～0.5％吐温-20(Tween-20)，10-20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH7.0-8.0)，1-2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

5.如权利要求1所述的方法的步骤(3)，此步骤的特征在于，异丙醇与洗涤液B的体积比为1∶1，异丙醇增强了洗涤液B中高浓度盐(盐浓度≥1M)主导的磁珠吸附核酸的作用，洗涤液B中高浓度盐的成分选自下组中的任意一种：氯化钾、氯化钠；洗涤液B的其他成分包括：0.1～0.5％吐温-20(Tween-20)，10-20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH7.0-8.0)，1-2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

6.如权利要求1所述的方法的步骤(4)，此步骤的特征在于，洗脱液不含异丙醇，核酸从磁珠表面解吸附并进入洗脱液中，洗脱液的用量根据用户需要在0.2～2倍样品体积之间任选，洗脱液的成分选自下组：10-20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH7.0-8.0)，1-2mM乙二胺四乙酸(EDTA)。

7.如权利要求1-6所述的方法，其特征在于，异丙醇增强了溶液中高浓度盐主导的磁珠吸附RNA的作用，从而增强了RNA提取效率，使该方法在应用于RNA提取时提供了一种高效提取RNA的方法。

8.如权利要求1-6所述的方法，其特征在于，该方法的全部核酸提取过程仅需4个步骤，克服了现有磁珠法核酸提取方法的步骤繁多的缺点；裂解与结合步骤一步完成，使磁珠在核酸提取的开始步骤即可加入反应溶液中，从而使该方法在自动化应用时每一步骤的反应试剂可以预先灌装入对应的反应舱内，使用时只需要将样品加入指定反应舱，按“开始键”即可；比较现有磁珠法核酸提取方法的裂解与结合分为两步，磁珠在裂解完成之后才能加入反应溶液中进行核酸结合的步骤，该方法更适用于全自动化核酸提取应用。

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