CN115873848A - 植物dna提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，提出了植物DNA提取试剂盒，包括裂解液、磁珠吸附液、洗涤液I、洗涤液II；所述磁珠吸附液包括binding buffer、异丙醇和磁珠；还提出了植物DNA提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：S1、在样品中加入裂解液震荡，孵育后，离心，收集上清液；S2、将所述上清液与磁珠吸附液混匀后，弃去液体；S3、依次使用洗涤液I、洗涤液II分别洗涤两次，弃去液体；S4、加入RNase‑free振荡混匀，得到的液体即为DNA。通过上述技术方案，解决了现有技术中的DNA的获取耗时费力，且获得的DNA质量和收率低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体的，涉及植物DNA提取试剂盒。
背景技术
DNA是生物体中主要的遗传物质，从植物组织中提取核酸是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。从植物组织中提取纯度高、完整性好的核酸更是很多研究的关键所在。
传统的核酸分离方法主要有化学法、抽提法、冷冻法、煮沸法和硅基质柱膜法。最常见的提取步骤为裂解、萃取、离心、沉淀、洗涤。大部分样本利用传统技术虽然可以得到质量和得率都相对较好的DNA，但耗时费力，且对于富含多糖多酚类的植物组织来讲，很难从粘稠的多糖溶液中有效分离DNA，造成DNA损失，影响下游试验。所以如何从植物中快速高效获得高质量DNA仍旧是一个难题。
发明内容
本发明提出植物DNA提取试剂盒，解决了相关技术中DNA的获取耗时费力，且获得的DNA质量和收率低的问题。
本发明的技术方案如下：
植物DNA提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、磁珠吸附液、洗涤液I、洗涤液II；
所述磁珠吸附液包括binding buffer、异丙醇和磁珠。
作为进一步的技术方案，所述裂解液的组成为：300～500mM缓冲液、20～30mM核酸酶抑制剂、1～3M氯化物、1～5M蛋白变性剂和1～5％(v/v)表面活性剂。
作为进一步的技术方案，所述缓冲液为Tris-HCl；
所述氯化物为NaCl；
所述蛋白变性剂为异硫氰酸胍；
所述表面活性剂为吐温-20；
所述核酸酶抑制剂包括EDTA和DTT。
作为进一步的技术方案，所述EDTA和DTT的摩尔比为(3～7):1。
作为进一步的技术方案，所述EDTA和DTT的摩尔比为5:1。
作为进一步的技术方案，所述binding buffer、异丙醇和磁珠的体积比为(5～15):10:1。
作为进一步的技术方案，所述binding buffer、异丙醇和磁珠的体积比为10:10:1。
作为进一步的技术方案，所述binding buffer的组成为：3～5M氯化物、3～5％(v/v)表面活性剂。
作为进一步的技术方案，所述氯化物为NaCl；
所述表面活性剂包括吐温-20和曲拉通-100。
作为进一步的技术方案，所述吐温-20和曲拉通-100的体积比为(1.5～2.5):2。
作为进一步的技术方案，所述吐温-20和曲拉通-100的体积比为1:1。
作为进一步的技术方案，所述洗涤液I的组成为80～100mM缓冲液，1～5M氯化物和50～70％醇溶液；
所述洗涤液II的组成为40～60mM缓冲液和60～80％醇溶液。
作为进一步的技术方案，包括裂解液、磁珠吸附液、洗涤液I、洗涤液II；还包括RNase-free。
本发明还提出了植物DNA提取试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、在样品中加入裂解液震荡，孵育后，离心，收集上清液；
S2、将所述上清液与磁珠吸附液混匀后，弃去液体；
S3、依次使用洗涤液I、洗涤液II分别洗涤两次，弃去液体；
S4、加入RNase-free振荡混匀，得到的液体即为DNA。
作为进一步的技术方案，所述样品与裂解液的质量体积比为(30～100)mg:400μL。
作为进一步的技术方案，所述上清液与磁珠吸附液的体积比为1:2.1。
作为进一步的技术方案，所述上清液与洗涤液I的体积比为3:5。
作为进一步的技术方案，所述上清液与洗涤液II的体积比为1:2。
作为进一步的技术方案，所述上清液与RNase-free的体积比为6:(1～2)。
作为进一步的技术方案，植物DNA提取试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
S1、将植物组织碾磨后，加入裂解液震荡，孵育，离心，收集上清液；
S2、取上清液加入磁珠吸附液混匀、静置，弃去液体；
S3、加入洗涤液I振荡、静置，弃去液体；
S4、加入洗涤液I振荡、静置，弃去液体；
S5、加入洗涤液II振荡、静置，弃去液体；
S6、加入洗涤液II振荡、静置，弃去液体；
S7、晾干后，加入RNase-free振荡、静置，得到的液体，即为DNA。
作为进一步的技术方案，所述静置时，在磁力架上静置。
本发明的工作原理及有益效果为：
本发明利用磁珠对DNA的特异性吸附作用，提供了一种快速简便的从各类植物材料中提取高质量、高收率DNA的方法。该方法不需使用酚、氯仿等有毒有害试剂，且操作过程只有30～40min，过程简便迅速，适合大通量自动化提取。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
实施例1
S1、将南瓜的新鲜组织100mg加入液氮碾磨，加入400μL裂解液震荡后，在70℃下孵育10min，离心，收集上清液；
S2、取300μL上清液加入630μL磁珠吸附液颠倒混匀5min、静置于磁力架上0.5min，吸弃液体，
S3、加入500μL洗涤液I振荡30s、静置于磁力架上30s，吸弃液体；
S4、加入500μL洗涤液I振荡30s、静置于磁力架上30s，吸弃液体；
S5、加入600μL洗涤液II振荡30s、静置于磁力架上30s，吸弃液体；
S6、加入600μL洗涤液II振荡30s、静置于磁力架上30s，吸弃液体；
S7、室温晾干5min，加入50μL RNase-free在56℃振荡混匀10min、静置于磁力架上1min，得到的液体，即为DNA。
磁珠吸附液由体积比为10:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：4M NaCl，2％吐温-20，2％曲拉通-100。
裂解液的组成为：400mM Tris-HCl、pH＝8.0，25mM EDTA、pH＝8.0，2M NaCl，1M异硫氰酸胍，3％吐温-20和5mM DTT。
洗涤液I的组成为50mM Tris-HCl、pH＝8.0，50mM醋酸铵、pH＝7.0，1M NaCl和60％无水乙醇。
洗涤液II的组成为50mM醋酸铵、pH＝7.0和70％无水乙醇。
实施例2
S1、将南瓜的干重组织30mg加入液氮碾磨，加入400μL裂解液震荡后，在70℃下孵育10min，离心，收集上清液；
S2、取300μL上清液加入630μL磁珠吸附液颠倒混匀5min、静置于磁力架上1min，吸弃液体，
S3、加入500μL洗涤液I振荡30s、静置于磁力架上50s，吸弃液体；
S4、加入500μL洗涤液I振荡30s、静置于磁力架上30s，吸弃液体；
S5、加入600μL洗涤液II振荡30s、静置于磁力架上30s，吸弃液体；
S6、加入600μL洗涤液II振荡30s、静置于磁力架上30s，吸弃液体；
S7、室温晾干5min，加入100μL RNase-free在56℃振荡混匀10min、静置于磁力架上1min，得到的液体，即为DNA。
磁珠吸附液由体积比为10:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：3M NaCl，1.5％吐温-20，1.5％曲拉通-100。
裂解液的组成为：300mM Tris-HCl、pH＝8.0，25mM EDTA、pH＝8.0，1M NaCl，3M异硫氰酸胍，1％吐温-20和5mM DTT。
洗涤液I的组成为40mM Tris-HCl、pH＝8.0，40mM醋酸铵、pH＝7.0，3M NaCl和50％无水乙醇。
洗涤液II的组成为40mM醋酸铵、pH＝7.0和60％无水乙醇。
实施例3
S1、将南瓜的新鲜组织80mg加入液氮碾磨，加入400μL裂解液震荡后，在70℃下孵育10min，离心，收集上清液；
S2、取300μL上清液加入630μL磁珠吸附液颠倒混匀5min、静置于磁力架上0.5min，吸弃液体，
S3、加入500μL洗涤液I振荡30s、静置于磁力架上60s，吸弃液体；
S4、加入500μL洗涤液I振荡30s、静置于磁力架上30s，吸弃液体；
S5、加入600μL洗涤液II振荡30s、静置于磁力架上30s，吸弃液体；
S6、加入600μL洗涤液II振荡30s、静置于磁力架上30s，吸弃液体；
S7、室温晾干5min，加入80μL RNase-free在56℃振荡混匀10min、静置于磁力架上1min，得到的液体，即为DNA。
磁珠吸附液由体积比为10:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：5M NaCl，2.5％吐温-20，2.5％曲拉通-100。
裂解液的组成为：500mM Tris-HCl、pH＝8.0，25mM EDTA、pH＝8.0，3M NaCl，5M异硫氰酸胍，5％吐温-20和5mM DTT。
洗涤液I的组成为45mM Tris-HCl、pH＝8.0，45mM醋酸铵、pH＝7.0，5M NaCl和70％无水乙醇。
洗涤液II的组成为60mM醋酸铵、pH＝7.0和80％无水乙醇。
实施例4
与实施例1的区别仅在于：
裂解液的组成为：400mM Tris-HCl、pH＝8.0，15mM EDTA、pH＝8.0，2M NaCl，1M异硫氰酸胍，3％吐温-20和5mM DTT。
实施例5
与实施例1的区别仅在于：
裂解液的组成为：400mM Tris-HCl、pH＝8.0，21mM EDTA、pH＝8.0，2M NaCl，1M异硫氰酸胍，3％吐温-20和3mM DTT。
实施例6
与实施例1的区别仅在于：
磁珠吸附液由体积比为10:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：4M NaCl，1.5％吐温-20，2％曲拉通-100。
实施例7
与实施例1的区别仅在于：
磁珠吸附液由体积比为10:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：4M NaCl，2.5％吐温-20，2％曲拉通-100。
实施例8
与实施例1的区别仅在于：
磁珠吸附液由体积比为15:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：4M NaCl，2％吐温-20，2％曲拉通-100。
实施例9
与实施例1的区别仅在于：
磁珠吸附液由体积比为5:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：4M NaCl，2％吐温-20，2％曲拉通-100。
对比例1
与实施例1的区别仅在于：
磁珠吸附液由体积比为10:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：4M NaCl，2％吐温-20。
对比例2
与实施例1的区别仅在于：
磁珠吸附液由体积比为10:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：4M NaCl，2％曲拉通-100。
对比例3
与实施例1的区别仅在于：
磁珠吸附液由体积比为10:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：4M NaCl。
对比例4
与实施例1的区别仅在于：
磁珠吸附液由体积比为10:10:1的binding buffer、异丙醇和磁珠组成；bindingbuffer的组成为：4M NaCl，2％十二烷基苯磺酸钠，2％曲拉通-100。
利用紫外分光光度计对实施例1～9及对比例1～4提取到的DNA进行溶度以及纯度的检测，检测结果记录在表1中：
表1实施例1～9及对比例1～2提取的DNA溶度及纯度
由表1可以看出本发明实施例1～9提供的植物DNA提取试剂盒稳定，同时提取质量高。对比例1与实施例1的区别仅在于binding buffer中的表面活性剂为吐温-20，对比例2与实施例1的区别仅在于binding buffer中的表面活性剂为曲拉通-100，对比例3与实施例1的区别仅在于binding buffer中没有表面活性剂，对比例1～3提供的植物DNA提取试剂盒的提取DNA的质量和收率均不如实施例1，因此binding buffer中的表面活性剂为吐温-20和曲拉通-100时，二者协同作用使得试剂盒的提取效果最佳。
对比例4与实施例1的区别仅在于binding buffer中表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠和曲拉通-100，得到的试剂盒的提取效果不如实施例1，因此，吐温-20和曲拉通-100共同使用时试剂盒的效果最好。
使用实施例1提供的植物DNA提取试剂盒及其使用方法，分别提取茄子、棉花、松针、刺苋、桃子叶片、白桦、木薯、84K杨、悬铃木、金钟花、铁冬青、紫叶李、刺柏中的DNA。并利用紫外分光光度计对提取到的DNA进行溶度以及纯度的检测，检测结果记录在表2中：
表2DNA溶度及纯度
| 物种 | 浓度(ng/μL) | A260/280 |
| 茄子 | 56.6 | 1.77 |
| 棉花 | 118 | 2.04 |
| 松针 | 118 | 1.88 |
| 刺苋 | 69 | 1.69 |
| 桃子叶片 | 49.4 | 1.79 |
| 白桦 | 104 | 1.99 |
| 木薯 | 65.8 | 1.92 |
| 84K杨 | 30.4 | 1.98 |
| 悬铃木 | 104 | 1.99 |
| 金钟花 | 16.4 | 1.99 |
| 铁冬青 | 44.4 | 2.03 |
| 紫叶李 | 30.4 | 2.66 |
| 刺柏 | 120 | 1.99 |
由表2可以看出，本发明提供的提取植物DNA的试剂盒可用于多种植物且效果稳定，提取质量高，具有快速、高效，环保的优点。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.植物DNA提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、磁珠吸附液、洗涤液I、洗涤液II；
所述磁珠吸附液包括binding buffer、异丙醇和磁珠。
2.根据权利要求1所述的植物DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液的组成为：300～500mM缓冲液、20～30mM核酸酶抑制剂、1～3M氯化物、1～5M蛋白变性剂和1～5％(v/v)表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的植物DNA提取试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl；
所述氯化物为NaCl；
所述蛋白变性剂为异硫氰酸胍；
所述表面活性剂为吐温-20；
所述核酸酶抑制剂包括EDTA和DTT。
4.根据权利要求3所述的植物DNA提取试剂盒，其特征在于，所述EDTA和DTT的摩尔比为(3～7):1。
5.根据权利要求1所述的植物DNA提取试剂盒，其特征在于，所述binding buffer、异丙醇和磁珠的体积比为(5～15):10:1。
6.根据权利要求1或5所述的植物DNA提取试剂盒，其特征在于，所述binding buffer的组成为：3～5M氯化物、3～5％(v/v)表面活性剂。
7.根据权利要求6所述的植物DNA提取试剂盒，其特征在于，所述氯化物为NaCl；
所述表面活性剂包括吐温-20和曲拉通-100。
8.根据权利要求7所述的植物DNA提取试剂盒，其特征在于，所述吐温-20和曲拉通-100的体积比为(1.5～2.5):2。
9.根据权利要求1所述的植物DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液I的组成为80～100mM缓冲液，1～5M氯化物和50～70％醇溶液；
所述洗涤液II的组成为40～60mM缓冲液和60～80％醇溶液。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的植物DNA提取试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在样品中加入裂解液震荡，孵育后，离心，收集上清液；
S2、将所述上清液与磁珠吸附液混匀后，弃去液体；
S3、依次使用洗涤液I、洗涤液II分别洗涤两次，弃去液体；
S4、加入RNase-free振荡混匀，得到的液体即为DNA。
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Citations (2)
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| CN102229925A (zh) * | 2011-05-13 | 2011-11-02 | 薛昱 | 一种增强的磁珠法核酸提取方法 |
| CN102618532A (zh) * | 2012-05-02 | 2012-08-01 | 易春 | 基于磁珠法从植物叶片中提取基因组dna的试剂盒及其提取方法 |
-
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