CN108998446A - 一种简便无臭提取粪便核酸的试剂盒及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简便无臭提取粪便核酸的试剂盒及其方法，涉及分子生物技术领域。该试剂盒包括有粪便稳定液，该粪便稳定液含有Tris、硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、氯化钠、氯丁醇、绿茶提取物、金银花提取物以及酵素。该粪便稳定液能够使提取粪便样本中的DNA在不高于40摄氏度的常温下保存15天左右，解决运输和保存困难的缺陷，同时便于使用者能够在家中自助提取样本并保存，方便快捷。且该粪便稳定液具有除臭效果好，使用安全的优点，其能够有效清除氨气和硫化氢等粪臭气体，达到消除异味，抑制细菌滋生的效果。

Description

一种简便无臭提取粪便核酸的试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体而言，涉及一种简便无臭提取粪便核酸的试剂盒及其方法。

背景技术

粪便作为一种常见的临床样本，其含有大量核酸信息，由于排便活动具有节律性，相对于其他非损伤性取样材料来说，样本易于采集获取，因而粪便样本可用于相关肿瘤的检测，其中最为常见的用途是用于结直肠癌的诊断。

但由于粪便离体后，其所处环境也发生了变化，主要是从无氧环境转移到有氧环境中，与此同时，其内的部分细菌还保持了部分生理活性，继续繁殖代谢。而由于环境的变化，不同细菌的增长与死亡的速率已不同于排便前。因此，需要对粪便进行一些保存措施，尽量将其中微生物的构成稳定在刚刚离体时的状态，使其能够代表肠道内环境状态。

同时，粪便作为人体的正常排泄物，食物中的蛋白质被肠道内坏细菌分解，形成了吲哚、粪臭素、硫化氢、胺、乙酸、丁酸等物质，这些物质会产生难闻的异味并对人体有害。

传统的保存方法为采集粪便后立即冷冻保存于-20℃或更低的温度中。由于细菌在低温状态下的代谢速率极大降低，因此，可以在一段时间内维持粪便中细菌的构成。但这无疑增加了样本运输保存的成本和难度，实际应用推广的难度非常大。目前，多采用干燥袋保存或于稳定液中运输保存，但都无法在合理有效地保存粪便样本的同时祛除样本自带的异味，为后期样本检测工作者进行样本检测造成极大不便。并且，在粪便核酸提取中还会发生粪便DNA存在浓度和质量低下、易降解、含有PCR抑制剂等问题，这些往往造成PCR扩增实验的失败，无法进行后续样本的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便无臭提取粪便核酸的试剂盒，其能在室温条件下，长时间地对粪便样本中的DNA进行有效保存，有效解决粪便样本DNA保存时间短，运输不便等缺陷，利于粪便样本核酸的检测。

本发明的另一目的在于提供一种简便无臭提取粪便核酸的方法，其能够简单快捷地提取粪便样本中的核酸，无臭便利，且保存时间长。

本发明是这样实现的：

一种简便无臭提取粪便核酸的试剂盒，试剂盒包括有粪便稳定液；粪便稳定液含有Tris、硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、氯化钠、氯丁醇、绿茶提取物、金银花提取物以及酵素。

一种简便无臭提取粪便核酸的方法，该方法采用上述的试剂盒从粪便样本中提取核酸。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的简便无臭提取粪便核酸的试剂盒，其包括有粪便稳定液，该粪便稳定液含有Tris、硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、氯化钠、氯丁醇、绿茶提取物、金银花提取物以及酵素。该粪便稳定液能够使提取粪便样本中的DNA在不高于40摄氏度的常温下保存15天左右，解决运输和保存困难的缺陷，同时便于使用者能够在家中自助提取样本并保存，方便快捷。且该粪便稳定液具有除臭效果好，使用安全的优点，其能够有效清除氨气和硫化氢等粪臭气体，达到消除异味，抑制细菌滋生的效果。

此外，本发明还提供一种简便无臭提取粪便核酸的方法，其包括采用上述试剂盒进行核酸提取，具有操作简单便捷，能够长时间保存提取样本DNA的优点。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供的一种简便无臭提取粪便核酸的试剂盒及其方法进行具体说明。

本发明实施例提供的简便无臭提取粪便核酸的试剂盒，其包括有粪便稳定液；粪便稳定液含有三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硫氰酸胍、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠、氯丁醇、绿茶提取物、金银花提取物以及酵素。

上述绿茶提取物主要是指从绿茶叶片中提取的活性成分，主要包括茶多酚(儿茶素)、咖啡碱及芳香油等；上述金银花提取物是指从天然植物金银花中的提取物，主要活性成分为绿原酸。

绿茶提取物和金银花提取物的提取过程如下。

天然绿茶提取物香精的制备方法，包括如下步骤：

称取重量比例为(1.5～2.3)∶(3.5～5.5)的绿茶叶及纯净水，然后将绿茶叶和纯净水混合，在真空度为-0.050～-0.060MPa的条件下浸泡36～48h，再加热煎煮2～3h，过滤得滤液和滤渣。将滤液脱色，并按体积比为(90～110)∶1(例如浓缩前为90～110L，浓缩后为1L)对滤液进行浓缩，得绿茶提取物。

金银花提取物的制备方法包括以下步骤：

将金银花药材粉碎，以50％(体积/体积)乙醇水溶液提取从而得到提取液。将得到的提取液减压浓缩得到浸膏，加水溶解，过滤，溶液浓缩至干，加95％(体积/体积)乙醇水溶液溶解，同时加入蒸馏水使溶液含乙醇75％(体积/体积)，静置后过滤，滤液回收乙醇的流浸膏。向流浸膏加水溶解并过滤，滤液通过苯乙烯大孔吸附树脂色谱柱，然后依次用水、20％(v/v)乙醇水溶液洗脱，洗脱液经乙醇挥发浓缩后即为金银花提取物。

酵素为微生物酵素，购自日本酵素世界社和日本岛本微生物工业株式会社。

在粪便稳定液中，Tris的浓度为7.8～8.2mM，硫氰酸胍的浓度为1.8～2.2M，EDTA的浓度为5.5～6.5mM，氯化钠的浓度为0.048～0.052mM，氯丁醇的浓度为0.48％～0.52％(m/m)，绿茶提取物为7％～9％(m/m)，金银花提取物的浓度为5～7％(m/m)和酵素的浓度为3.5％～4.5％(m/m)。

具体地，Tris的浓度可以为7.8mM、7.9mM、8.0mM、8.1mM或8.2mM。硫氰酸胍的浓度可以为1.8M、1.9M、2.0M、2.1M或2.2M。EDTA的浓度可以为5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6.0mM、6.1mM、6.2mM、6.3mM、6.4mM或6.5mM。氯化钠的浓度可以为0.048mM、0.049mM、0.050mM、0.051mM或0.052mM。氯丁醇的浓度为0.48％、0.49％、0.50％、0.51％或0.52％。绿茶提取物为7％、8％或9％。金银花提取物的浓度为5％、6％或7％。酵素的浓度为3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％或4.5％。

在采用上述各组分及各组分的配比的粪便稳定液，能够在不高于40摄氏度的常温下保存提取粪便样本DNA 15天左右，有效解决现有技术对采集粪便样本DNA保存时间短，需低温运输等缺陷。该组分及其组分配比能够使粪便样本DNA更加稳定，有利于运输和样本后续检测，便于实施和推广。且该稳定液对粪便样本具有除臭效果，使用安全，有效清除氨气、硫化氢等粪便的异味气体，以分解的方式将样本中的异味有效去除，达到消除异味，抑制细菌滋生的目的，为后续粪便样本DNA的检测带来极大的便利。

试剂盒还包括有裂解液，裂解液包括有Tris-HCl、异硫氰酸胍、氢氧化钠、异丙醇、Triton X-100、儿茶素以及Carrier RNA。在裂解液中，Tris-HCl的浓度为14.5～15.5mmol/L，pH为3.2～3.4，异硫氰酸胍的浓度为9～11mmol/L，氢氧化钠浓度为4.5～5.5mmol/L，异丙醇的浓度为84％～86％(v/v)，Triton X-100的浓度为3.5～4.5％(v/v)，儿茶素的浓度为1.8％～2.2％(m/m)，Carrier RNA的浓度为0.48～0.52μg/mL。

进一步地，试剂盒还包括有第一洗涤液、第二洗涤液以及洗脱液中的一种或多种。

第一洗涤液，其包括Tris-HCl、乙醇以及DTT(二硫苏糖醇)。在第一洗涤液中，Tris-HCl的浓度为64～66mmol/L，乙醇的浓度为48～52％，DTT的浓度为0.48％～0.52％。

第二洗涤液，其包括醋酸钠溶液和乙醇。在第二洗涤液中，醋酸钠溶液的浓度为28～32mmol/L，乙醇的浓度为73～77％。

洗脱液，其包括有Tris-HCl，EDTA-2N和Carrier RNA。在洗脱液中，Tris-HCl的浓度为28～32mmol/L，pH为7.8～8.2，EDTA-2Na的浓度为2.8～3.2mmol/L，Carrier RNA的浓度为0.08～0.12μg/mL。

在该裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液以及洗脱液的组分和配比下，该试剂盒能够有效提取粪便样本中的DNA，采用该组分和配比能够快速方便地从粪便样本中提取高质量的DNA。

试剂盒还包括有层析柱，层析柱内包括有阴离子交换剂，优选地，阴离子交换剂为季铵或二乙基氨基丙基。

本发明实施例还提供简便无臭提取粪便核酸的方法，其包括采用上述试剂盒从粪便样本中提取核酸。

在提取核酸前，提取方法包括粪便样本处理步骤。粪便样本处理处理步骤包括将采集的粪便样本浸泡于上述粪便稳定液中。

提取方法包括采用硅胶柱纯化技术，以及抑制因子吸附技术，采用高结合力的玻璃纤维滤膜作为基质，滤膜在高浓度离子化试剂(如异硫氰酸胍)的条件下，可通过氢键和静电等物理因素吸附核酸，而蛋白质或其他杂志不被吸附而去除，吸附了核酸的滤膜经洗涤去除蛋白质和盐，最后可以用低盐缓冲液或水，洗脱出滤膜上吸附的核酸，同时，吸附剂可高效地吸附溶液中的腐殖酸等抑制因子，纯化的DNA得到的核酸纯度高，可直接用于后续下游检测实验。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

第一实施例

本实施例提供的简便无臭提取粪便核酸的试剂盒如下。

该试剂盒包括粪便稳定液、裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液以及层析柱。

具体地，粪便稳定液含有8mM Tris、2M硫氰酸胍、6mM乙二胺四乙酸、0.05mM氯化钠、0.5％氯丁醇、8％(m/m)绿茶的提取物、6％(m/m)金银花提取物和4％(m/m)酵素。

裂解液中含有15mmol/L Tris-HCl(pH为3.3)、10mmol/L异硫氰酸胍、5mmol/L氢氧化钠、85％(v/v)异丙醇、4％(v/v)Triton X-100、2％(m/m)儿茶素以及0.5μg/mL CarrierRNA。

第一洗涤液含有65mmol/L Tris-HCl、50％(v/v)乙醇以及0.5％(m/m)DTT。

第二洗涤液含有30mmol/L醋酸钠溶液以及75％乙醇。

洗脱液含有30mmol/L Tris-HCl的浓度为(pH为8)、3mmol/L EDTA-2Na以及0.1μg/mL Carrier RNA。

同时本试剂盒还包括一种层析柱，层析柱为硅胶柱，采用阴离子交换树脂二乙基氨基丙基(ANX)。

第二实施例

本实施例提供一种简便无臭提取粪便核酸的方法。

(1)从粪便样本中的人基因组DNA

粪便样本处理步骤

取0.2～0.4g粪便样本至2mL离心管中，若样本处于液体状态，吸取0.2mL液体样本至2mL离心管中，将0.65mL第一实施例提供的粪便稳定液加入至样本中，最高涡旋1分钟打散样本。样本置于稳定液中可室温保存15天，便于实际运输且不影响样本的后续检测。

裂解蛋白步骤

室温下，13000ⅹg离心10分钟。然后，转移500μL上清液至2mL离心管中，加入20μLProteinase K和第一实施例提供的裂解液至上清液中。颠倒混匀得到混合液，70℃消化10分钟。

核酸提取步骤

随后，加入500μL无水乙醇至混合液，涡旋混匀15秒。转移一半体积的混合液至层析柱中，10000ⅹg离心30秒。把剩余的混合液转移至层析柱中。10000ⅹg离心30秒。倒弃流出液，把层析柱装回收集管中。加入650μL第一实施例提供的第一洗涤液至层析柱上，10000ⅹg离心30秒。倒弃滤液把层析柱装回收集管中。加入650μL第一实施例提供的第二洗涤液至层析柱中，10000ⅹg离心30秒。倒弃滤液把层析柱装回收集管中。13000ⅹg离心2分钟甩干层析柱。将层析柱装在1.5mL离心管中，加入30μL预热至65℃的灭菌水或第一实施例提供的洗脱液至层析柱的膜中央，室温放置2分钟，13000ⅹg离心1分钟。丢弃DNA结合柱，把DNA保存4℃，长期保存于-20℃。

(2)从粪便样本中提取微生物核酸和人基因组核酸

该提取方法适合从粪便样本中提取微生物核酸和人基因组核酸，该提取方法包括以下步骤：

粪便样本处理步骤

转移100～200mg粪便样本至2mL离心管或合适匀浆管中，将0.6mL第一实施例提供的稳定液加入至样本中，最高涡旋1分钟打散样本。

裂解蛋白步骤

将样本70℃水浴20分钟。短暂离心收集管壁上的液滴，取0.6mL加入至溶菌酶缓冲液中，涡旋混匀20秒。室温下，将样本13000ⅹg离心10分钟。转移500μL上清液至2mL离心管中，加入20μL Proteinase K和500μL第一实施例提供的裂解液至上清液中。颠倒混匀，70℃消化10分钟。

核酸提取步骤

转移一半体积的混合液至层析柱中，10000ⅹg离心30秒把剩余的混合液转移至层析柱中。10000ⅹg离心30秒。倒弃流出液，把层析柱装回收集管中。加入650μL第一实施例提供的第一洗涤液至层析柱上，10000ⅹg离心30秒。倒弃滤液把层析柱装回收集管中。加入650μL第一实施例提供的第二洗涤液至层析柱中，10000ⅹg离心30-60秒。倒弃滤液把层析柱装回收集管中。13000ⅹg离心2分钟甩干层析柱。将层析柱装在1.5mL离心管中，加入30μL预热至65℃的灭菌水或第一实施例提供的洗脱液至层析柱的膜中央，室温放置2分钟，13000ⅹg离心1分钟。丢弃DNA结合柱，把DNA 4℃保存以待检测或使用，DNA长期保存于-20℃。

第一对比例

验证第一实施例提供的试剂盒中粪便稳定液对核酸样本的保存时间。

实验方法

随机选择3份粪便样本(样本1～3)，均等量取10份(0.2g)分装于离心管中，在分装3份样本的离心管中，加入第一实施例的试剂盒中的稳定液进行保存处理，等量的10份样本1～3于常温环境下分别保存于1h、12h、1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d。然后按照第二实施例中从粪便样本中提取微生物核酸和人基因组核酸的提取方法进行核酸提取，使用超微量紫外-可见光分光光度计对获得的核酸进行OD值检测，检测结果如表1～2所示。

实验结果

表1提取核酸的浓度表

表2提取核酸纯度表

备注：A260为核酸最高吸收峰的吸收波长；A280是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长。A260/A280为核酸纯度的指示值，用于评估核酸样品纯度。

结果如表1～2所示，第一实施例提供的试剂盒的提取的核酸在稳定液中能够稳定保存15天以上，稳定液对样本保存效果好。

第二对比例

验证本发明的粪便稳定液对提取核酸的影响

实验方法

随机取5份受试者提供的新鲜粪便样本(1-5)，分别于Tris-盐酸缓冲液、PBS缓冲液、生理盐水(NS)及本发明第一实施例提供的粪便稳定液(G)中保存等量样本(0.2g)，进行后续核酸提取实验，三组对照例的配方配置如下：

Tris-盐酸缓冲液

50毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与40mL 0.1M盐酸混匀后，加水稀释至100毫升。

PBS缓冲液

PBS(1L)配方：磷酸二氢钾0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8.00g，氯化钾0.20g，加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，高温高压灭菌后室温保存。

生理盐水

称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。

5组样本均采用按照第二实施例中从粪便样本中提取微生物核酸和人基因组核酸的提取方法进行核酸提取，使用超微量紫外-可见光分光光度计对获得的核酸进行OD值检测，检测结果如表3所示。

表3 OD值检测结果

由表3可知，较对比常用样本缓冲液，本发明第一实施例提供的粪便稳定液对样本核酸保存效果更好，便于提取得到较高浓度的样本核酸。

第三对比例

验证第一实施例提供的试剂盒对核酸的提取率。

实验方法

随机选择5份经本发明中粪便稳定液运输保存的粪便样本，并对每份粪便样本取等量(0.2mL)3份于离心管中，分别分为A、B、C三组，组A1～5号样本使用第一实施例的试剂盒和第二实施例提供的提取方法进行核酸提取，B、C组样本分别用天根生化科技(北京)有限公司的粪便核酸提取试剂盒和杭州博日科技有限公司的Biospin粪便DNA提取试剂盒作进行核酸提取对比。天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒提取：严格按照试剂盒的说明书进行核酸提取。杭州博日科技有限公司的试剂盒提取：严格按照试剂盒的说明书进行核酸提取。

使用超微量紫外-可见光分光光度计对15份样本基因组DNA回收产物进行了OD值检测(见表4)。

表4 OD值检测结果

由表4可知，较对比试剂盒，本发明第一实施例提供的试剂盒的提取核酸的提取效率高，提取核酸的纯度更好，无RNA和蛋白质污染。采用本发明提供的试剂盒及提取方法对样本基因组DNA进行提取得到的DNA产物含量高且纯度良好，说明该第一实施例提供的试剂盒适用于高通量提取基因组DNA。

综上，本发明提供的简便无臭提取粪便核酸的试剂盒，其包括有粪便稳定液，该粪便稳定液含有Tris、硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、氯化钠、氯丁醇、绿茶提取物、金银花提取物以及酵素。该粪便稳定液能够使提取粪便样本中的DNA在不高于40摄氏度的常温下保存15天左右，解决运输和保存困难的缺陷，同时便于使用者能够在家中自助提取样本并保存，方便快捷。且该粪便稳定液具有除臭效果好，使用安全的优点，其能够有效清除氨气和硫化氢等粪臭气体，达到消除异味，抑制细菌滋生的效果。

此外，本发明还提供一种简便无臭提取粪便核酸的方法，其包括采用上述试剂盒进行核酸提取，具有操作简单便捷，能够长时间保存提取样本DNA的优点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种简便无臭提取粪便核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有粪便稳定液；

所述粪便稳定液包括有Tris、硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、氯化钠、氯丁醇、绿茶提取物、金银花提取物以及酵素。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，在所述粪便稳定液中，Tris的浓度为7.8～8.2mM，硫氰酸胍的浓度为1.8～2.2M，乙二胺四乙酸的浓度为5.5～6.5mM，氯化钠的浓度为0.048～0.052mM，氯丁醇的浓度为0.48％～0.52％(m/m)，绿茶提取物为7％～9％(m/m)，金银花提取物的浓度为5～7％(m/m)和酵素的浓度为3.5％～4.5％(m/m)。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括裂解液，所述裂解液包括有Tris-HCl、异硫氰酸胍、氢氧化钠、异丙醇、Triton X-100、儿茶素以及Carrier RNA。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，在所述裂解液中，Tris-HCl的浓度为14.5～15.5mmol/L，pH为3.2～3.4，异硫氰酸胍的浓度为9～11mmol/L，氢氧化钠浓度为4.5～5.5mmol/L，异丙醇的浓度为84％～86％(v/v)，Triton X-100的浓度为3.5～4.5％(v/v)，儿茶素的浓度为1.8％～2.2％(m/m)，Carrier RNA的浓度为0.48～0.52μg/mL。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一洗涤液、第二洗涤液或洗脱液中的一种或多种；

第一洗涤液包括Tris-HCl、乙醇以及DTT；

第二洗涤液包括醋酸钠溶液和乙醇；

洗脱液包括Tris-HCl，EDTA-2Na和Carrier RNA。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，在所述第一洗涤液中，Tris-HCl的浓度为64～66mmol/L，乙醇的浓度为48～52％(v/v)，DTT的浓度为0.48％～0.52％(m/m)；

在所述第二洗涤液中，醋酸钠溶液的浓度为28～32mmol/L，乙醇的浓度为73～77％(v/v)；

在所述洗脱液中，Tris-HCl的浓度为28～32mmol/L，EDTA-2Na的浓度为2.8～3.2mmol/L，Carrier RNA的浓度为0.08～0.12μg/mL。

7.根据权利要求1～6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有层析柱，所述层析柱包括有阴离子交换剂，所述阴离子交换剂为季铵或二乙基氨基丙基。

8.一种简便无臭提取粪便核酸的方法，其特征在于，其采用权利要求1～7任一项所述的试剂盒从粪便样本中提取核酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在提取粪便样本核酸之前，所述方法包括粪便样本处理步骤；

所述粪便样本处理步骤包括将采集的粪便样本浸泡于权利要求1或2所述的试剂盒的粪便稳定液中。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括采用硅胶柱纯化技术，将玻璃纤维滤膜作为基质吸附核酸。