CN113637723A

CN113637723A - 一种粪便样本核酸保存液及其制备方法

Info

Publication number: CN113637723A
Application number: CN202110778533.2A
Authority: CN
Inventors: 殷剑峰; 龚波; 王春香
Original assignee: Jiangsu Kangwei Century Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Kangwei Century Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2041-07-09
Also published as: CN113637723B

Abstract

本发明提供了一种粪便样本核酸保存液及其制备方法，具体地，本发明提供了一种粪便样本核酸保存液，所述保存液含有变性剂、螯合剂、离子强度维持剂、抑菌剂和除味剂。用本发明的保存液处理粪便样本，可有效(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和/或(ii)灭活粪便样本中的细菌。

Description

一种粪便样本核酸保存液及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及种粪便样本核酸保存液及其制备方法。

背景技术

肠道，是人体的第二大脑，人体最大的“加油站”，也是人体内最大的排毒器官和免疫器官，人体约99％的营养物质都是由肠道吸收，80％以上的毒素由肠道排出体外，60-70％的免疫细胞都集中在肠道中抵抗外来菌与毒素的入侵，包括巨噬细胞、T细胞、NK细胞、B细胞等。日常饮食中，大多数营养物质都在小肠被吸收，而难于消化吸收的食物残渣进入大肠，最终形成粪便下移至直肠排出。而随着生活水平的提高，人类进食肉食比例的增加、生活压力大、饮食不规律，消化道的问题越来越突出。关于我国肠道健康状况的社会调查结果显示，超过90％的人存在肠道健康问题。2009年，肠癌跃居国人十大癌症之首，几乎每天有288人死于大肠癌，平均每小时有12个人死于肠癌。肠道也是人体最大的细菌库，肠道内微生物种群达500余种，数量10万亿以上。肠道微生物是人体代谢反应的重要参与者，可帮助人体完成多种生理生化反应，肠道微生物的失调与多种疾病的发生发展密切相关，例如肠道肿瘤、肠易激综合症 (IBS)、肥胖、糖尿病等。

近年来，随着分子生物学和核酸检测技术的日益发展，为研究肠道与人体健康疾病之间的关系提供了有力的检测分析手段。粪便样本是肠道疾病研究和肠道临床检测的重要样本来源。粪便中含有宿主脱落细胞，这些脱落细胞中常含有癌变信号，粪便中脱落细胞的检测由于无创、无痛、且检测特异性高等特征，常用于结直肠癌等消化道疾病的初筛普查，能更好地达到″早发现、早诊断、早治疗″的目的，是最有效最节约成本的降低肠癌(结直肠癌)发病率和死亡率的方法。肠道微生物研究的主要样本也是粪便样本，可以反应人体肠道内微生物的共生状态。但是当粪便从人体排出后，样本中微生物的生存环境发生了很大的改变，从肠道获取营养物质的来源随之丧失，并且从无氧环境变成了有氧环境，样本中的厌氧菌将会迅速死亡，非厌氧菌还能继续代谢和生长，这会造成微生物的种类和丰度发生改变，不能很好的反应体内的真实状态。此外，粪便样本成分复杂，含有大量蛋白酶、核酸酶及各种PCR抑制剂(如胆盐、胆红素、腐殖质和色素)，使得粪便样本中的细胞及核酸极易受到破坏和降解。因此，需要对粪便样品采取保护措施，使其微生物构成固定在离体时的状态，真实反映肠道微生物的构成。传统采用低温-20℃—-80℃保存粪便样本，低温冷冻保存可使样本中各种酶活力降低，减少样本中细胞(包括人脱落细胞和各种微生物菌体细胞)和核酸的破坏降解，低温也能降低菌群的代谢和繁殖，能在一定时间内较好地保持菌群的固有状态。但冷冻保存的样本保存时间短，样本再度利用合格率低，并且样本运输和保存需要超低温设备和仪器的支持，保存条件苛刻，成本高。如果受检者采集样本后不能立即低温保存，期间粪便样本内的脱落细胞、核酸和微生物的总量、组成和相对丰度都有可能发生改变，影响后续检测结果，不能准确的反应受检者肠道的真实状况。因此，需要一种能够在常温下长时间有效保存粪便样本的粪便样本核酸保存液。另外，粪便样本由于具有大量细菌和难闻的臭味，实验操作人员和临床检测人员对此类样本接受意愿度比较差，这也是粪便类样本类型在临床推广应用过程中面临的一个问题。

此外，目前国内外已有一些厂家推出粪便保存液可用于常温保存运输粪便样本，但大部分产品含有醇类(如甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、三氯丁醇等) 或二甲基亚砜等易挥发或可燃成分，产品稳定性较差，不能保证样本中微生物 DNA的稳定性。中国专利CN111183974A、CN107980763A和CN111197042A提供的粪便保存液主要对粪便中的脱落细胞进行有效保护，避免脱落细胞降解，为粪便中脱落细胞的检测提供了有利条件，但是该保存液如果要维持样本中脱落细胞形态稳定，势必减弱对微生物活性的抑制能力，因此对样本中微生物活性的抑制力稍显不足，不能及时固定样本核酸总量，因此均不适用于肠道微生物的研究和检测；专利CN106255753A提供一种稳定化生物学样本(包括粪便)中的DNA核酸的组合物，专利CN110004212A、CN107988076A和CN107312717A提供了有利于保护样本中微生物菌群丰富度和遗传物质稳定性的粪便保存液，专利 CN111004831A和CN109122667A提供了有利于保持微生物和细胞稳定的粪便保存液，但这些组合物或者保存液中的固定剂/抑菌剂多采用甲醇、乙醇、丙醇或氯丁醇等醇类或二甲基亚砜(DMSO)等，这些成分易挥发、易燃，因此产品的保质期和稳定性容易受到影响，并且含有可燃性成分的产品在货运/运输方面也会受到一些限制，一般需要强制特殊包装，增加了产品的运输复杂性和成本。中国专利CN108998446A提供一种带有除臭效果的粪便稳定液，通过添加绿茶提取物、金银花提取物以及微生物酵素等物质达到遮盖臭味的效果，但添加绿茶、金银花提取物或微生物酵素等物质会引入多酚(儿茶素)、咖啡碱、绿原酸等成分以及外源动植物和微生物核酸物质，提取过程中酚类及植物酸类物质残留可能会对后续核酸分子检测造成不利影响，而外源核酸的引入也会造成检测过程中基因组背景增加，也会对检测造成不利影响。

因此，本领域迫切需要开发一种能够在常温下长时间有效保存粪便样本并且便于使用的粪便样本核酸保存液。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够在常温下长时间有效保存粪便样本的粪便样本核酸保存液。

本发明的第一方面，提供了一种粪便样本核酸保存液，所述保存液含有变性剂、螯合剂、离子强度维持剂、抑菌剂和除味剂。

在另一优选例中，所述保存液的pH为9.0-11.0。

在另一优选例中，所述变性剂包括胍盐和离子型表面活性剂。

在另一优选例中，所述胍盐选自下组：盐酸胍、异硫氰酸胍、或其组合。

在另一优选例中，所述离子型表面活性剂选自下组：十二烷基硫酸钠、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、十二烷基硫酸铵、十二烷基硫酸锂、癸基硫酸钠、辛基硫酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、硫酸化蓖麻油、月桂基硫酸二乙醇胺、十二烷基硫酸三乙醇胺、月桂基硫酸钾、月桂基硫酸三乙醇胺、月桂基硫酸单乙醇胺、月桂基硫酸镁、或其组合。

在另一优选例中，所述离子型表面活性剂包括Triton X-100。

在另一优选例中，所述螯合剂选自下组：乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、次氮基三乙酸三钠盐一水合物(NTA)、或其组合。

在另一优选例中，所述螯合剂包括EDTA。

在另一优选例中，所述离子强度维持剂包括有机缓冲溶液和/或无机缓冲溶液。

在另一优选例中，所述有机缓冲溶液选自Tris、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸、丙氨酸、甘露糖和柠檬酸三钠，优选甘氨酸。

在另一优选例中，所述无机缓冲溶液选自碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐和硼酸盐，优选碳酸钠、碳酸氢钠或磷酸氢盐。

在另一优选例中，所述抑菌剂选自下组：Proclin 300、β-丙内酯(BPL)、或其组合，优选为Proclin 300。

在另一优选例中，所述除味剂包括活性炭，优选为粉末状或颗粒状活性炭。

在另一优选例中，按粪便样本核酸保存液的总量计，胍盐的的含量为0.1-30M，较佳地，0.5-20M，更佳地，0.8-10M，更佳地，1-4M。

在另一优选例中，按粪便样本核酸保存液的总量计，离子型表面活性剂的重量含量为0.5-10％，较佳地，1-4％。

在另一优选例中，按粪便样本核酸保存液的总量计，螯合剂的含量为0.01-5M，较佳地，0.08-2M，更佳地，0.1-0.5M。

在另一优选例中，按粪便样本核酸保存液的总量计，离子强度维持剂的含量为5－500mM，较佳地，10－200mM。

在另一优选例中，按粪便样本核酸保存液的总量计，抑菌剂的含量为1－ 50ppm，较佳地，5-20ppm。

在另一优选例中，按粪便样本核酸保存液的总量计，除味剂的含量为1－ 50g/L，较佳地，5-30g/L的。

本发明的第二方面，提供了本发明第一方面所述的所述粪便样本核酸保存液的用途，其特征在于，用于(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和/或(ii)灭活粪便样本中的细菌。

在另一优选例中，所述粪便来源于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述DNA包括微生物DNA或者人体脱落细胞(如白细胞) 基因组DNA。

本发明的第三方面，提供了一种粪便样本核酸处理试剂盒，所述试剂盒含有本发明第一方面所述的所述的粪便样本核酸保存液；和

标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和/或(ii)灭活粪便样本中的细菌。

在另一优选例中，所述的粪便样本核酸保存液的各个组分分别位于不同容器中。

在另一优选例中，所述的粪便样本核酸保存液的各个组分位于同一容器中。

本发明的第四方面，提供了一种本发明第三方面所述的所述的试剂盒的用途，用于(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和/或(ii)灭活粪便样本中的细菌。

本发明的第五方面，提供了一种(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和/ 或(ii)灭活粪便样本中的细菌的方法，包括步骤：

在本发明第一方面所述的粪便样本核酸保存液存在下，对粪便样本进行处理。

在另一优选例中，所述粪便来源于人或非人哺乳动物。

本发明的第六方面，提供了一种本发明第一方面所述的粪便保存液的制备方法，包括步骤：

(1)将除活性炭以外的各组分混合，用氢氧化钠调节pH，用去离子水定容；

(2)过滤除菌，然后加入活性炭混匀，即得到所述保存液。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了液抑菌性能研究结果。

图2显示了1号保存液及对照qPCR检测结果。

图3显示了2号保存液及对照qPCR检测结果。

图4显示了3号保存液及对照qPCR检测结果。

图5显示了琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA核酸。

图6显示了志愿者1样本的检测结果。

图7显示了志愿者2样本的检测结果。

图8显示了志愿者3样本的检测结果。

图9显示了志愿者1样本的高通量测序检测结果。

图10显示了志愿者2样本的高通量测序检测结果。

具体实施方式

本发明人经过长期广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次意外地发现，将变性剂、螯合剂、离子强度维持剂、抑菌剂和除味剂以一定浓度进行配比，配制的保存液的pH为9.0-11.0，可有效(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和 /或(ii)灭活粪便样本中的细菌。在此基础上，本发明人完成了本发明。

样本

如本文所用，术语“样本”、“标本”可互换使用。在本发明中，所述样本的来源没有特别限制，可以由生物体采集，在一优选例中，所述“样本”来自粪便样本。并且，采集样本的方法没有特别限制，可以采用常规方法进行采集。

粪便样本核酸保存液

本发明提供了一种粪便样本核酸保存液，在本发明中，所述粪便样本核酸保存液含有如下组分：变性剂、螯合剂、离子强度维持剂、抑菌剂和除味剂；其中，所述保存液的pH为9.0-11.0。

在本发明中，所述变性剂及其浓度不受特别的限制，所述变性剂包括胍盐和离子型表面活性剂；胍盐优选为盐酸胍和异硫氰酸胍中的至少一种；表面活性剂为十二烷基硫酸钠、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、十二烷基硫酸铵、十二烷基硫酸锂、癸基硫酸钠、辛基硫酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、硫酸化蓖麻油、月桂基硫酸二乙醇胺、十二烷基硫酸三乙醇胺、月桂基硫酸钾、月桂基硫酸三乙醇胺、月桂基硫酸单乙醇胺和月桂基硫酸镁中的至少一种，优选为Triton X-100。一种优选的变性剂为异硫氰酸胍和、TritonX-100。一种优选的胍盐的含量为 0.1-30M，较佳地，0.5-20M，更佳地，0.8-10M，更佳地，1-4M。一种优选的离子型表面活性剂的含量为0.5-10％，较佳地，1-4％。

在本发明中，所述螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)和次氮基三乙酸三钠盐一水合物(NTA)中的一种或几种，优选地为EDTA。EDTA是常用的Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二价金属离子螯合剂，能有效去除样本中的二价金属离子，抑制多数依靠Mg²⁺作用的核酸酶的活性，降低核酸酶对核酸降解的风险，有利于保持核酸稳定。

一种优选的螯合剂的含量为0.01-5M，较佳地，0.08-2M，更佳地，0.1-0.5M。

所述离子强度维持剂(两性离子缓冲液)可以为有机缓冲溶液和/或无机缓冲溶液，其中有机溶液可以为Tris、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸、丙氨酸、甘露糖或柠檬酸三钠等，无机溶液可以为碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐或硼酸盐。本发明优选有机缓冲液甘氨酸和无机缓冲液碳酸钠、碳酸氢钠或磷酸氢盐中的至少一种。其中甘氨酸为具有氨基和羧基的两性离子，有很强的缓冲性，可以提供 pH8.6-10.6偏碱性的缓冲环境，保持DNA核酸的稳定性，此外，甘氨酸对大肠杆菌等菌体的繁殖有一定抑制作用，可起到一定的抑菌作用。碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液可以提供pH9.16-10.83的碱性缓冲环境，碳酸钠-氢氧化钠缓冲液可以提供 pH9.6-11.0的碱性缓冲环境，磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液可以提供pH10.9-12.0 的强碱性缓冲环境。

所述抑菌剂包括Proclin 300或β-丙内酯(BPL)中的至少一种，优选为 Proclin300。ProClin生物灭活剂具有广谱抗菌性，使用剂量少，作用速度快，能够迅速穿透细胞膜，抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶，因此一接触微生物有机体就会立即抑制细胞活性，5-20ppm的ProClin300即可达到抑菌的目的。此外， ProClin安全，毒性远低于同类产品，并且具有良好的酶和诊断因子相容性，不会影响后续反应过程中与酶或抗体的相关反应。

一种优选的抑菌剂的含量为1－50ppm，较佳地，5-20ppm。

所述除味剂为活性炭，优选为粉末状或颗粒状活性炭，无毒无味，孔隙发达，具有很大的比表面积，合适的孔隙结构，不含对液相有不良影响的溶解物，具有吸附能力强、脱色除味效果佳等优点，广泛应用于饮用水及工业给水的深度净化、脱色、脱氯、除味、除油，以及污水的深度净化处理、电子工业中超纯水的制取，食品工业用水的净化，去除液相中的有机物质、有色分子等，特别是对污水的脱色、除味，降COD等有绝佳的效果。

一种优选的除味剂的含量为1－50g/L，较佳地，5-30g/L的。

在一些实施例中，粪便保存液可包含以下成分(在溶液总量中)：1-4M的异硫氰酸胍、1-4％的Triton X-100，0.1-0.5M的EDTA，10–200mM的甘氨酸、碳酸钠、碳酸氢钠或磷酸氢二钠，5-20ppm的ProClin300，5-30g/L的活性炭，保存液pH值9-11。其中胍盐作为强蛋白变性剂可以将粪便样品中的粘蛋白和球蛋白等有机物质和降解酶如蛋白酶、DNA酶(DNases)和RNA酶(RNases)进行变性处理，同时使得样本中的脱落细胞和微生物菌体细胞裂解并释放核酸，微生物不易滋生；甘氨酸、碳酸钠、碳酸氢钠或磷酸氢二钠可维持缓冲液总离子强度的稳定，维持偏碱性的缓冲环境，并提供一个高盐环境，使释放出来的DNA充分溶解于液相中，核酸保持稳定；EDTA螯合样本中的二价金属离子，作为核酸酶抑制剂保护样本核酸免遭降解；Proclin 300作为抑菌剂能抑制样本中微生物的活性，防止微生物的丰度发生变化；保存液中添加活性炭，有助于吸附祛除粪便样本的杂质及异味，并且不会对样本核酸保存及后续核酸提取及检测产生不利影响。

综上所述，本发明提出了一种无臭、可常温运输保存粪便样本核酸的粪便保存液，能够有效灭活裂解粪便样本中的宿主细胞和微生物菌体细胞，释放核酸，并在常温保存运输过程中有效保持核酸稳定，防止核酸降解，样本保存时间长。

此外，在一优选实施方式中，本发明提供一种所述的粪便保存液的制备方法，具体步骤为：将除活性炭以外的各组分混合，用氢氧化钠调节pH，用去离子水定容，然后进行0.22μm的滤膜过滤除菌，然后加入适量活性炭，混匀，即得到所述保存液。过滤除菌不会使保存液产生化学变化，有利于保存液理化性质保持准确稳定。

在一优选实施方式中，本发明提供了所述的粪便保存液在粪便保存中的应用，具体步骤为取0.5-1g粪便样本于5ml所述粪便保存液中，混匀。规格30 ml的粪便保存液可保存2.5g-5g粪便样本。

本发明提供的一种可常温保存、运输粪便样本的粪便核酸保存液，与粪便样本混合后，可迅速渗入粪便中的脱落细胞及微生物细胞内，使粪便中的细胞裂解灭活，释放核酸，同时抑制样本中降解酶活性，达到DNA稳定保存的状态，在常温下即可长时间保存粪便样本核酸稳定。本发明提供的保存液不含乙醇等挥发性成分，产品保质期长，性能稳定，使用简单方便，运输成本低，可广泛用于医院、科研院所、家庭等常温条件下粪便样本的采集、运输与保存。粪便样本中的DNA经粪便保存液稳定后可在室温(15-25℃)条件下保存至少7天而免于降解，并且经粪便保存液稳定的粪便样本可配套市面上常用的粪便DNA纯化试剂盒提取粪便DNA。此外，保存液采用活性炭物理吸附的方式祛除样本的异味，能使实验操作人员对粪便样本的接受度大大增加，便于此类样本的临床推广应用。

粪便样本核酸处理试剂盒

本发明还提供了一种用于(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和/或(ii)灭活粪便样本中的细菌的粪便样本核酸处理试剂盒。

在本发明中，本发明的试剂盒含有以下组分的粪便样本核酸保存液：

变性剂、螯合剂、离子强度维持剂、抑菌剂和除味剂。

在一优选实施方式中，所述保存液的pH为9.0-11.0。

在本发明中，本发明的试剂盒中的各个组分之间的比例，以及各个组分的含量可以不受特别限制。

本发明的试剂盒中的各组分可购买获得，或用常规方法制备。

在本发明中，所述保存液的各个组分可分别位于不同容器中或位于同一容器中。

本发明的试剂盒可有效(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和/或(ii)灭活粪便样本中的细菌。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的保存液可有效(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和/或(ii)灭活粪便样本中的细菌。

(2)室温运输、保存：本发明提供的粪便保存液能够在室温条件下有效释放和保存粪便样本中脱落细胞和微生物细胞的核酸，并在样本常温运输和保存过程中有效防止核酸降解，在15～37℃下保存样本至少30天，降低了因运输或保存不当导致核酸降解的可能性，解决了传统粪便冷冻保存法要求低温保存的问题，减少对冷冻设备或仪器的依赖，降低样本运输和保存的成本。

(3)灭活病原微生物：本发明提供的粪便保存液是一种灭活型保存液，可以使粪便样本中的微生物迅速灭活不再具有活性，对于操作人员和环境都非常安全，降低对环境造成的不利影响；此外，保存液迅速渗入细胞，使细胞裂解释放核酸，防止样本中微生物的种类、丰度和核酸总量发生变化，使样本能真实反映宿主体内的真实状态。

(4)物理吸附：本发明提供的粪便保存液采用活性炭物理吸附除味方式，在有效消除样本异味的同时，不会对样本核酸保存及后续核酸提取及检测产生不利影响。而且，本发明人在实验中意外发现，在保存液中添加活性炭后，能够显著提高 DNA保存效果，非常有利于样本中DNA的长期稳定。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明所用的材料和细胞系如无特别说明，均为市售产品。

实施例1.粪便保存液配方

本发明粪便样本保存液的配方主要包括以下组分：1-4M的异硫氰酸胍、 1-4％的Triton X-100，0.1-0.5M的EDTA，10–200mM的甘氨酸、碳酸钠、碳酸氢钠或磷酸氢二钠，5-20ppm的ProClin300和0.1-3％的活性炭，保存液pH值 9-11，优选pH值为9.5-10.5。

表1.粪便保存液配方

实施例2.粪便保存液抑菌性能研究

实验材料：带有氨苄抗性质粒的大肠杆菌菌种

实验组保存液：实施例1中的1-3号粪便保存液

对照组：无菌水

实验方法：大肠杆菌过夜培养，取10μl过夜培养的大肠杆菌菌液分别加入30ml无菌水和1-3号保存液中，涡旋混匀，每份样品等分成3份，分别于室温放置0天、30天，样本混匀后取100μl保存液涂LB固体培养基(添加氨苄)，置于37℃培养箱过夜培养12-16小时，观察记录菌体生长情况。

实验结果：结果如图1所示，大肠杆菌菌液保存在3种保存液中0天和30天后涂布在培养基中无细菌生长，而用无菌水保存的菌液在培养0天后出现大量细菌生长。这说明保存液1、2、3具有抑菌效果，防止细菌生长。

实施例3.粪便保存液的核酸保存能力研究

实验材料：实施例1中的1、2、3号粪便保存液，人白细胞基因组DNA(保存于-80℃冰箱)，志愿者新鲜粪便。

实验方法：将等量(约1克)新鲜粪便分别加入实施例1中配制的5ml 1、 2、3号粪便保存液中，然后再分别加入等量的人白细胞基因组DNA，颠倒混匀；每份保存液等分成两份，分别置于室温保存0天、30天后，每份取300μl保存液样本采用粪便基因组DNA提取试剂盒(康为世纪，货号CW2092)进行DNA提取，具体操作步骤详见产品说明书，样本在70μL洗脱液中洗脱，每个样本取5μl 作为模板进行荧光定量qPCR检测人类内参基因。

使用康为世纪qPCR检测试剂(货号CW0957)对提取的DNA核酸样本进行荧光定量PCR检测，所用引物为人类内参基因GAPDH引物，引物序列信息为 GAPDH-F：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT(SEQ ID NO.:1)，GAPDH-R： GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG(SEQ IDNO.:2)。以在无菌水中添加粪便和人白细胞基因组DNA样本提取的DNA核酸作为阴性对照，具体操作参考说明书。反应体系采用25μl PCR反应体系(包括：12.5μl UltraSYBRMixture、0.5μl GAPDH-F (10μM)、0.5μl GAPDH-R(10μM)、6.5μl无核酸酶水)+5μl提取的DNA样本模板。在伯乐CFX96型荧光定量PCR仪上进行人类内参基因actin核酸检测，反应条件如下：95℃5min→95℃10s,60℃30s(40个循环)， SYBR通道。所有检测均进行3次重复，取平均循环阈值(cycling threshold， Ct)进行计算。

实验结果：结果如表2所示，与0天对照组的Ct相比，1、2、3号保存液保存的样本在室温保存30天后检测的Ct差值基本都在1以内，大部分差异不显著(p＞0.05)，说明三种保存液在室温条件下均能有效保持DNA核酸稳定，可以在保存30天后也能保证核酸有效检出。

表2.qPCR检测粪便保存液对DNA核酸的保存效果

实施例4.粪便保存液对粪便样本核酸保存的研究

实验组保存液：采用上述实施例1中的1号粪便保存液；

对比组保存液：参考专利CN104073564A，配制一种粪便样品保存液(包含 EDTA-二钠0.24％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.75％(w/v)，硫氰酸胍0.05M，余量为去离子水，pH调至7.5，灭菌即得)作为对比例。

粪便样本采集与DNA提取：采集3位志愿者的粪便样本，分别做4种不同处理，每种处理设置3个重复，具体处理为：

(1)直接提取组：称取3份粪便样本，每份0.5g，立即进行DNA提取，提取好的核酸于-80℃保存，备用。

(2)-80℃冻存30天：称取3份粪便样本，每份0.5g，-80℃下密封保存 30天，然后进行DNA提取，备用。

(3)实验组保存液保存30天：称取3份粪便样本，每份1g，分别放入5ml 的1号粪便保存液中，混匀，室温下(18-25℃)密封保存30天，然后取2.5ml粪便保存液样本(约含0.5g粪便样本)进行DNA提取，备用。

(4)对比组保存液保存30天：称取3份粪便样本，每份1g，分别放入5ml 的对比组保存液中，混匀，室温下(18-25℃)密封保存30天，然后取2.5ml粪便保存液样本(约含0.5g粪便样本)进行DNA提取，备用。

采用粪便基因组DNA提取试剂盒(康为世纪，货号CW2092)进行DNA提取，具体操作步骤详见产品说明书，最后采用70μL洗脱液进行DNA核酸洗脱。

提取的DNA核酸质量检测及结果分析：

核酸浓度纯度检测：提取后的DNA核酸使用Qubit测定浓度，并采用 Nanodrop测定DNA纯度，结果如表3所示，与直接提取组(0天)相比，冻存组 (-80℃，30天)和实验组(室温，30天)在保存30天后检测到的浓度和纯度未发生明显变化，且比对比组(室温，30天)浓度高，说明保存液在置于室温 30天的条件下能有效保持DNA核酸稳定。

表3.不同处理组的粪便样本提取DNA核酸质量检测

将各个处理小组的三个重复样本提取的DNA分别混合，对各组提取的DNA核酸依次进行电泳检测、荧光定量PCR检测和二代测序检测。

琼脂糖凝胶电泳检测：每组样本各取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示(道1：志愿者1-直接提取组；泳道2：志愿者1-冻存组；泳道3：志愿者1-实验组；泳道4：志愿者1-对比组；泳道5：志愿者2-直接提取组；泳道6：志愿者2-冻存组；泳道7：志愿者2-实验组；泳道8：志愿者2-对比组；泳道9：志愿者3-直接提取组；泳道10：志愿者3-冻存组；泳道11：志愿者3- 实验组；泳道12：志愿者3-对比组)，各电泳泳道亮度与qubit测量的核酸浓度一致，所以粪便保存液对粪便样本核酸具有保护效果，防止核酸降解。

实施例5荧光定量PCR检测宿主基因核酸稳定性

通过荧光定量PCR检测人内参基因，验证粪便保存液对宿主DNA核酸的保存效果。使用康为世纪qPCR检测试剂(CW0957)对提取得到的核酸样本进行荧光定量PCR检测，具体操作参考说明书。所用引物为人类内参基因β-actin引物，引物序列信息为β-actin-F：GCGCCGTTCCGAAAGTT(SEQ ID NO.:3)，β-actin-R： CGGCGGATCGGCAAA(SEQ ID NO.:4)。以无菌去离子水作为阴性对照，具体操作参考说明书。反应体系采用25μl PCR反应体系(包括：12.5μl UltraSYBR Mixture、0.5μlβ-actin-F(10μM)、0.5μlβ-actin-R(10μM)、6.5 μl无核酸酶水)+5μl提取的DNA样本模板。在ABI7500(美国Thermofisher 公司)型荧光定量PCR仪上进行人类内参基因β-actin核酸检测，反应条件如下：95℃5min→95℃10s,60℃30s(40个循环)，SYBR通道。所有检测均进行3次重复，取平均循环阈值(cycling threshold，Ct)进行计算。

结果如表4所示，与直接提取组(0天)相比，冻存组(-80℃，30天)和实验组(室温，30天)在保存30天后检测到的Ct差值基本都在1以内，且比对比组(室温，30天)Ct值小，说明保存液在室温条件下能有效保持宿主核酸的稳定性。

表4.人内参基因PCR检测Ct值

图6显示了志愿者1样本的检测结果；图7显示了志愿者2样本的检测结果；图8显示了志愿者3样本的检测结果。

实施例6高通量测序检测微生物种群结构及丰度变化

采用康为世纪NGS文库构建试剂盒(货号CW3025)对提取的部分样本DNA进行 NGS文库构建，并上机测序。获得测序数据后进行生物信息学分析，统计样本中物种种群组成、多样性和相对丰度等信息，并对各个处理组进行比较。

结果如图9和图10所示，直接提取组和实验组(室温30天)中物种种群组成、多样性和相对丰度没有发生明显变化，说明保存液可以将微生物固定在离体的状态，真实的反映肠道微生物的构成。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 江苏康为世纪生物科技股份有限公司

<120> 一种粪便样本核酸保存液及其制备方法

<130> 035004

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gcgccgttcc gaaagtt 17

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cggcggatcg gcaaa 15

Claims

1.一种粪便样本核酸保存液，其特征在于，所述保存液含有变性剂、螯合剂、离子强度维持剂、抑菌剂和除味剂；优选地，所述保存液的pH为9.0-11.0。

2.如权利要求1所述的粪便样本核酸保存液，其特征在于，所述变性剂包括胍盐和离子型表面活性剂。

3.如权利要求1所述的粪便样本核酸保存液，其特征在于，所述螯合剂选自下组：乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、次氮基三乙酸三钠盐一水合物(NTA)、或其组合。

4.如权利要求1所述的粪便样本核酸保存液，其特征在于，所述离子强度维持剂选自有机缓冲溶液和/或无机缓冲溶液。

5.如权利要求1所述的粪便样本核酸保存液，其特征在于，所述抑菌剂选自下组：Proclin 300、β-丙内酯(BPL)、或其组合，优选为Proclin 300。

6.如权利要求1所述的粪便样本核酸保存液，其特征在于，所述除味剂包括活性炭，优选为粉末状或颗粒状活性炭。

7.一种权利要求1所述粪便样本核酸保存液的用途，其特征在于，用于(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和/或(ii)灭活粪便样本中的细菌。

8.一种粪便样本核酸处理试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的粪便样本核酸保存液；和

9.一种(a)保持粪便样本中的DNA核酸稳定；和/或(ii)灭活粪便样本中的细菌的方法，其特征在于，包括步骤：

在权利要求1所述的粪便样本核酸保存液存在下，对粪便样本进行处理。

10.一种权利要求1所述的粪便保存液的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(1)将除活性炭以外的各组分混合，用氢氧化钠调节pH，用去离子水定容；和

(2)过滤除菌，然后加入活性炭混匀，即得到所述保存液。