CN107312717A - 一种粪便类样本的保存方法、保存用溶液、制备方法及应用 - Google Patents

一种粪便类样本的保存方法、保存用溶液、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种粪便类样本的保存方法、保存用溶液、制备方法及应用，无需复杂的操作就可按照配方所述的材料配置出相应的粪便保存液，将采集的粪便直接置于保存液中，无需特殊处理，即可达到稳定其中所含微生物组份的作用。通过将采集的粪便与以含有水溶性有机溶剂为有效成分的保存溶液混合，能够制备出让粪便样中所含的微生物的保存性优异的粪便样。使用该配方保存粪便样本可以在常温下就能达到样本冻存的效果，从而在任何时候都可以进行采样和样品的保存，便于粪便样本的长途运输。本发明的粪便保存液安全高效，能长时间维持粪便中细菌的丰度，成本低廉，具有良好的应用前景和经济效益。

Description

一种粪便类样本的保存方法、保存用溶液、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种粪便类样本的保存方法、保存用溶液、制备方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
人体微生物是人体的有机组成部分，数量庞大，干重约占人体总重1％至2％，且种类多样(包括细菌、古细菌、真菌和病毒等)，定植于胃肠道、口腔、皮肤、泌尿生殖道等，所编码的基因数量是人体自身基因数量的50～100倍，相当于人体的“第二个基因组”。人身上有100万亿个细菌，重约3斤。
我们生活在被细菌环绕的环境中，每天与细菌打交道。人体正常的菌群种类有1000余种，数量100万亿个(人体细胞仅10万亿个)，平均重约1.5千克，相当于肝脏重量。这些细菌主要分布于肠道、皮肤、口腔、呼吸道、泌尿生殖系统等部位，其中绝大多数定值肠道。肠道微生物主要有细菌、古细菌、真菌及病毒，其中99％以上为细菌，数量约有100亿—10000亿个。
《科学》杂志曾经发表文章，指出肠道微生物是提供人体营养调控肠道上皮细胞、先天性隐约的不可缺少的器官。把肠道微生物当作人体器官，所以它是我们的朋友，是人体重要的组成部分。
许多学者认为人本身就是人体细胞和细菌共同组合而成的共生生物体。它们与人体共生，以人体摄入的食物以及肠道分泌物为食，合成必需氨基酸，维生素，短链脂肪酸等重要物质进入人体，促进宿主健康；相反，其中一些病原菌也分泌有害物质进入体内，损害宿主的健康。由于肠道菌群的复杂和多样性，人类对其结构多样性和功能重要性一直缺乏足够的认知。直至近几年，随着第二代测序等技术的进步，微生物组的黑盒才得以打开，并借助无菌动物的验证，发现了肠道微生物与大量的疾病密切相关，甚至在许多疾病中扮演了病因的角色。
事实上仅肠道就有超过100万亿个不同种类的细菌,这些细菌中很多帮助我们降解食物和发挥重要的免疫作用。肠道的大多数微生物(包括细菌)来自于出生时母亲的产道；如果是剖腹产出生的，微生物来自于你的皮肤和周围环境。饮食、抗生素、遗传和应激等多种因素都会对微生物有影响。很早人们就知道，大脑能够影响肠道的功能，现代医学研究也表明大脑和肠道是双向作用的。近来的研究证明肠道微生物能够影响宿主的状态：肥胖、社会行为缺陷、帕金森病和焦虑。也就是说微生物可以影响人的情绪。
人体肠道内的微生物中，超过99％都是细菌，存活着的数量大约有100兆个，有500～1000个不同的种类。这些数目庞大的细菌大致可以分为三个大类：有益菌、有害菌和中性菌。
①主要(优势)菌群：指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，包括类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，通常属于原籍菌群。优势菌群是对宿主发挥生理功能的菌群，在很大程度上影响着整个菌群的功能，决定着菌群对宿主的生理病理意义。
②次要菌群：主要为需氧菌或兼性厌氧菌，如大肠杆菌和链球菌等，流动性大，有潜在致病性，大部分属于外籍菌群或过路菌群。乳杆菌在数量上归为次要菌群，在回肠中含量较高，但是其具有较为重要的功能，因此在功能上归属于优势菌群。
优势菌群与微生境的特征密切相关，以厌氧菌为主的优势菌群，一般生存在清除速率较低、营养丰富的微生境，如结肠，所以菌群密集度和多样性高；而兼性或需氧菌群一般生活在清除速率高的微生境，如小肠近端，其菌群密集度和菌群多样性较低，由于菌群密集度低，很难称得上是“优势菌群”；在酸性微生境中，耐酸、产酸的细菌成为优势菌群。微生境的改变，可使菌群中的优势菌群发生替换，如便秘时大便优势菌群主要是革兰阴性厌氧菌，慢性腹泻时常见革兰阳性杆菌为优势菌群，而在严重急性腹泻时大便中的优势菌群为致病性细菌或某些兼性/需氧细菌。在肠道中，尽管专性厌氧菌是主要菌群，占据优势，但这些菌群又依赖于需氧菌或兼性厌氧菌等次要菌群的存在，因为后者在增殖过程中消耗氧气，保证前者的生长条件。一个生理性组合的肠道菌群是有益的，而病理性组合的肠道菌群是有害的。
由于肠道微生物存在于人的肠道内，因此最便捷，也是目前采用的最常规的方式是研究人体排出的粪便中的微生物，以此代表大肠内的共生微生物。粪便采集之后，通过提取细菌的总DNA，PCR扩增出核糖体16S rRNA可变区，测序，然后进行生物信息学分析，可以了解粪便中的细菌构成，进一步研究其和人体疾病之间的相关性。
由于粪便离体后，其环境也发生了变化，主要是从无氧环境转变成有氧环境，其中提供微生物代谢的能量来源也进入只消耗而不补充的状态。与此同时，其中的部分细菌还保持了部分活性，继续代谢和生长，而由于环境的变化，不同细菌其增长与死亡的速率已经不同于排便前。因此，需要对粪便进行一些保存措施，尽量将其中微生物的构成稳定在刚刚离体时的状态，从而最好的代表大肠中的共生微生物。目前采用的保存方法为采集粪便后立即冻存在-20℃或者更低的温度中。由于细菌在低温状态下代谢速率极大的降低，因此可以在一段的时间内维持粪便中细菌的构成。
就效果而言，将粪便样的样品冻存在-20℃或者更低的温度中是可以在一段时间内(一周左右)保持粪便内的细菌构成不发生显著性的变化。然而其最大的缺陷则是冻存条件在某些特定情况下是无法实现的，例如外出取样者，采得的粪便样本需要携带一段时间才可以拿回实验室冻存，或者取样者与实验室并不在同一城市，需要采样后通过快递或者其它常规运输方式(非冷链运输)寄送到实验室后才可以完成冻存，而在此过程中，微生物的构成可能己经发生了巨大的改变。
传统的检测粪便微生物菌群的方法中，需要一边需要将采集的粪便样品冷却的同时一边需要分离细菌遗传物质。如果在不冷却的情况下进行该分离操作，由于粪便的变质等而无法得到准确的检测结果。因此，为了有效地防止粪便的变质，在采集粪便后迅速进行冷却很重要。然而，在遇到例如出诊在外或者在顾客家中无法进行粪便采集后迅速冷却等情况下，有效保存原始样本的新鲜度将变得无法实现。
另外，为了防止粪便试样的变质而考虑到将粪便试样冷冻，但在检查前必须使冷冻的粪便试样融解，因此操作变得繁杂。在传统的方法中，通过添加杀菌剂等，从而不需要进行冷却操作就能够在室温下调制和保存粪便样品，但存在从粪便中分离大肠脱落部分细菌的操作繁杂的问题。另外，被杀菌剂等破坏的细菌来源的核酸分解酶、蛋白分解酶会导致从大肠杆菌来源的核酸等的降解，因此，目标细菌的遗传物质检测的精度会降低。
然而目前国内外尚无类似的常温保存技术，因此发明粪便样的细菌保存液，来解决含菌样本比如粪便、肠道内容物等常温运输保存和菌群固化的问题迫在眉睫，该细菌保存液的发明制备可以有效解决含菌样本常温运输保存和菌群丰富度变化的问题。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供一种使采样者在任何时候都可以进行采样和样品的保存、能够用于粪便样本的长途运输、保持菌群丰富度和遗传物质稳定性的粪便类样本的保存方法、保存用溶液、制备方法及应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种粪便类样本保存用溶液，其用于与粪便样本混合，其特征在于：以水溶性有机物作为主要成分，上述水溶性有机物选自水溶性醇、酮类、醛类及砜类的一种或几种。其中水溶性醇以及部分砜类都是良好的低温冻存用的保存剂，而发明中涉及到的主要成分二甲基亚砜是良好的低温冻存保护剂，特定浓度的二甲基亚砜保存的新鲜样品可以在不超过37度的高温天气下保存一天，或者在25度室温下保存两周；或者4度冰箱存放一个月；或者负20度长期保存而使RNA保持完整免受降解。
所述保存用溶液的溶剂为缓冲溶液，水溶性有机物溶于缓冲溶液中，缓冲液中含有低浓度的盐离子，研究表明高浓度NaCl会妨碍样品正常形成颗粒沉淀，因此在去除保存液之后，样品还必须磷酸盐缓冲液进行清洗。因此为了解决在样品检测实验中会样品清洗的问题。本发明涉及到的保存液中NaCl的质量分数定义为2％-5％，处于低盐的水平。
所述粪便类样本保存用溶液的pH为7.0～7.4。所述水溶性有机物可替换为自由直链脂肪酸、二羧酸、氨基酸、芳香族或杂环的多元羧基酸中的一种或几种。这些水溶性有机物可以迅速渗透到组织或其他生物样本中，稳定并保护RNA完整而不被降解，确保下游分析得到的数据真实反应样品的表达信息。例如醇类的代表乙醇是一种便宜的保存液成分，申请人研究证实这种物质即便是在室温下，也能长时间里稳定地保存粪便样品中的微生物菌落结构。
但是乙醇是可燃的，不能用于样品运输，还有更重要的是，添加乙醇的低温冻存保护剂会导致冻存的样品比新鲜采集时的样品，部分菌群数量增加。因此在本发明中通过添加一定比例的氯丁醇，起到菌群稳定剂的作用。
优选的，所述保存用溶液的成分如表1所示：其中w/v为质量体积比，w/v的单位是g/ml。
表1保存用溶液的成分
且所述的保存用溶液的pH值为7.0～7.5，渗透压为260～300mOsm/L。
前述的保存用溶液的制备方法，按照配方称取各组成成分，用无菌去离子水溶解后，通过0.22um的滤膜过滤或高压灭菌，室温保存即得保存用溶液。
本发明也旨在保护上述的保存用溶液在保存粪便细菌、保持细菌遗传物质稳定中的应用。
一种粪便类样本的保存方法，将采集的粪便样本与所述的粪便样本保存用溶液混合。
保存粪便细菌的具体方法如下：
(1)采集至少0.5g新鲜的粪便样品；
(2)在2分钟时间内使用所述的保存用溶液将粪便样品在室温下密封，粪便样品不宜暴露在空气中过久，将粪便样品浸泡在保存用溶液中，所述的粪便样本和保存用溶液用量的比例为1:3(w/v)。
本发明的粪便样保存用溶液包括如下质量体积比的组分二甲基亚砜(DMSO)10.0％～20.0％(w/v)、EDTA-二钠(EDTANa2)3.0％(w/v)、柠檬酸钠(Na3C6H5O7)1.5％(w/v)、氯化钠2.0％(w/v)和氯丁醇(C4H9ClO)0.5％(w/v)，其溶剂为水，pH值为7.0～7.5，在室温条件下就能够长时间的对类粪便的样本中的DNA进行有效保存，有效解决了现有技术采集粪便样本DNA的保存时间短，且需要低温保存运输的缺陷；本发明成本低廉，配制方法简单快捷，适合工业化大规模生产及应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：按照配方配置保存液，将采集的粪便直接置于保存液中，无需冻存，即可达到稳定其中微生物构成的作用。使用该配方保存粪便样本可以在常温下达到冻存粪便样本的效果，从而使采样者在任何时候都可以进行采样和样品的保存，也能够用于粪便样本的长途运输。本发明所述的粪便样的保存液中样本的DNA收获率高，测序数据质量良好，确保样本中菌群的种类和丰度和新鲜样本的菌群丰度保持一致，样本储存在此保存液中可以常温运输，无需冷冻，常温保存可达2周时间。
附图说明
图1.根据配方设计11种不同的量(二甲基亚砜的比例为0％-100％，其余的成分保持一致，DMSO的量由水来替代)的量来测定经不同比例的DMSO的量保存的随机志愿者的粪便样品中的总DNA的保存效果；
图2.经5种不同种方式(具体方式如实施例2中描述)保存的四位随机志愿者粪便样品的菌群的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图3为本发明实施例2-7中多个志愿者的随机抽样在四种不同条件下的DNA回收效率的统计图；其中图3A为四名志愿者的样品分别在五种配方溶液冻存一周的DNA回收效率的统计结果，其中图3B为相同的样本在样品冻存2周后的检测结果；图3C和图3D分别为样品常温放置一周及样品常温放置两周后的遗传物质的变化统计情况；
图4.经六种不同方式保存的四位随机志愿者粪便样品的门水平菌群构成的异同性分析结果；
图5.经六种不同方式保存的四位随机志愿者粪便样品的纲水平菌群构成的丰度分析统计结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明涉及一种粪便保存液的配方，按照配方配置保存液，将采集的粪便直接置于保存液中，无需冻存，即可达到稳定其中微生物构成的作用。使用该配方保存粪便样本可以在常温下达到冻存粪便样本的效果，从而使采样者在任何时候都可以进行采样和样品的保存，也能够用于粪便样本的长途运输。按照以上配方称取各成分，无菌去离子水溶解后，高压灭菌，室温保存。本发明还涉及使用所述保存液进行粪便细菌保存的方法，步骤如下:采集至少200ug的新鲜粪便样品，室温下密封，避光，使用本发明保存液浸泡类粪便样品(0.5g粪便需要约2ml保存液)。
实施例1
1、粪便样本保存液的配制(共四种保存液)：
(1)按下表2和表3中的数据称取各组分，并将EDTA-二钠完全溶解制成母液。
(2)在水中加入其他组分并充分溶解后，加入上述母液充分混合。
(3)用盐酸或者氢氧化钠调节pH至下表中的溶液终pH值后，加去离子水定容至配方所需的体积。
实施例2.
对上述四个志愿者的共4份粪便样本的具体处理过程如下所述:
1.粪便DNA提取:
提取步骤:
(1)取粪便裂解液1.2ml加入到2ml己灭菌的Thermo的EP管中，并放置冰上操作；
(2)称量500mg的粪便样本到每个Thermo的EP管中，直至样本充分裂解均匀；
(3)在常温下最高转速离心5min；
(4)取上清液至新的2ml Thermo的EP管中，重复离心一次，除去粪便样本中的碎颗粒物，将上清液至新的2ml Thermo的EP管中；
(5)称取200mg BSA加入到每个样本中，迅速用涡旋仪震荡摇匀直至BSA完全悬浮，常温下孵化悬浮物5min，使其一些抑制因子被BSA吸收；(的在常温下最高速离心5min，除去粪便颗粒及结合到BSA上的抑制因子；
(7)离心结束，迅速取出上清液至新的2ml Thermo的EP管中，弃沉淀物；
(8)再一次最高速离心5min，取上清液至新的2ml Thermo的EP管中；
(9)在液体中加入浓度为20mg/ml蛋白酶K，58℃水浴消化反应1h；
(10)将样品冰浴5min冷却至常温，加入200ul蛋白沉淀液，震荡涡旋仪剧烈震荡，再次冰浴5min；
(11)最高速离心5min，沉淀蛋白；
(12)取上清液加入至新的2ml Thermo的EP管中；
(13)在上清液中加入DNA硅胶膜结合液，上清液与DNA硅胶膜结合液的体积比为1:1.5；
(14)取出600ml混合物加入到2ml Thermo的EP管中的纯化柱中，常温下孵化5min，盖上盖子，5000rpm/min离心1min，弃去滤出液；
(15)重复步骤(14)两次，使所有的裂解产物都滤过纯化柱底部的硅胶膜；
(16)将硅胶柱放在新的2ml Thermo的EP管中，弃去含有滤出液的Thermo的EP管；
(17)轻轻打开纯化柱盖子，加入硅胶膜洗涤液，盖上盖子，5000rpm/min离心1min，弃去含有滤出液的Thermo的EP管。
2.样品来源及分组保存方式
首先采集4位志愿者的粪便样本。每个志愿者的样品各采集5份，分别对样品做以下5种不同处理：
1)立即处理:采样至少0.2g粪便样品立即进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
2)冻存一周处理:采集至少0.2g粪便样品，-20℃下密封直接冻存，不添加保存液，保存一周，然后一周后再进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
3)表2的三种配方常温避光保存一周:采集至少0.2g粪便样品，室温下25℃密封，避光，使用本发明保存配方(配方见表2)保存一周，然后再进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
4)对照配方2(具体配方见表3)保存一周:室温下25℃密封，避光，使用对照保存配方(详细配方参见表3)，保存一周后，然后再进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
5)不做任何保存一周:室温下25℃密封，避光保存一周，然后再进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
所述三种实验组的保存液配方(保存液1-3)的见表2，所述对照保存液配方(保存液-C)的见表3。
具体测试的实验结果如图2所示：四个志愿者的粪便样品，经过上述五种方式处理后(处理方式1-4代表粪便样品在四种不同保存液常温放置1周，5编号表示样品密封常温避光保存一周)，直观的比较四个样本的凝胶成像的结果，可以明确的得出以下结论：与常温避光储存一周相比较，在添加保存液后(共四种保存液)明显的提高了DNA的存储时间和效率，尽管从结果上看不出各类保存液的对菌群丰度的影响，从宏观证明在常温放置时保存液有利于粪便类样品中的DNA的长时效的稳定性。
表2.实验组三种保存液的详细配方
表3.对照保存液(保存液-C)的配方
结论：如图1所示，以保存液1的配方作为研究案例，只变化二甲基亚砜的比例，从0％-100％，总共11个梯度，制备出对应的保存液，在随机志愿者的粪便样本在对应的保存液中冷冻保存一周(对应的粪便样品每份0.6g)其余的保存液成分保持一致，二甲基亚砜减少的量由水来补足，实验结果显示二甲基亚砜的浓度在10％-30％之间，DNA的回收保存效率较高。总的说来，研究实验结果已经发现加入一种低温冻存保护有助于人体样品的保存。在比较储存样品和新鲜样品中的微生物组成之前，可以采用检测样品DNA的量这种快速的方法，来评估保护剂的作用，如果DNA量不足，那么间接表明采用的保存液并不适用于粪便微生物的保存。
实施例3
1.采集的的四位随机试验者的样本按1∶3与四种粪便保存液(表2中保存液1-3和保存液-C)分别冻存于-20℃冰箱中一周后，将16只冻存混合液取出，取上述混合液各500μL用全血基因组DNA提取试剂盒(天根科技有限公司出品，商品编号N2516)提取DNA，并分别溶解于50μL的洗脱液中得相应的四个志愿者的样品，分别编号样品1、样品2、样品3和样品4。在7天冻存期之前，4个试验对象的新鲜样本各取400ug，基因组抽提后，将基因组DNA预先测定浓度及纯度，然后保存于-20℃冰箱(命名为新鲜样品处理组N)。
上述四个样品的在不同的保存液处理下的吸光值检测结果如表4所示：
表4.粪便样品在保存液中冻存于-20℃一周后的DNA浓度测定(ng/μL)
将上述四个样品的进行琼脂糖凝胶电泳检测和PCR检测，如图2的扩增结果所示，从图上可以看到编号样品1-4在-20℃冻存一周后与新鲜对照组即样品5，这五个样品核糖体16S RNA基因第四可变区扩增差异不显著，间接证明样品在保存液中冻存-20℃一周后，细菌的基因组DNA还是比较稳定的。
实施例4
1.如实施例3的的四位随机试验者的粪便样本，按粪便与保存液质量比1:3的比例，与4位随机的受试者的粪便样品混匀后，将16个样品与保存液的混合物至于常温避光放置7天，取上述混合液各500μL用全血基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司出品，商品编号N2516)提取DNA，并分别溶解于50μL的洗脱液中得相应的四个志愿者的样品，分别编号样品1、样品2、样品3和样品4。
上述四个样品的在不同的保存液处理下的DNA浓度检测结果如下表所示：
表5.粪便样品在保存液中常温放置一周后的DNA浓度测定结果(ng/μL)
如图2所示，图2中的1、2、3和4分别为样品1、样品2、样品3和样品4分别在保存液1中的DNA提取物，通过特异性引物扩增后的凝胶成像结果，从结果中我们可以看到，与对照组相比，通过保存液1-3对粪便样本常温保存一周时，细菌的基因组DNA还是比较稳定的。
上述配方配制的保存液与采集的两个唾液样本按1∶1的体积比充分混合得混合液，分别编号样品5和样品6，该两个样品在37℃及室温条件下保存一定时间后取上述混合液各500μL用全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并分别溶解于100μL的洗脱液中得相应的两个样品。
实施例5
1.如实施例3的四位随机试验者的粪便样本，同样是按样本与粪便保存液(共四种保存液)1∶3的常温避光放置2周后，从16个样品与保存液的混合物，取出混合液各500μL用全血基因组DNA提取试剂盒(天根科技有限公司出品，商品编号N2516)提取DNA，并分别溶解于100ul的洗脱液中得相应的四个志愿者的样品，分别编号样品1、样品2、样品3和样品4。
上述四个样品的在不同的保存液处理下的DNA浓度检测结果如下表所示：
表6.粪便样品在不同的保存液中常温放置两周后的DNA浓度测定结果(ng/μL)
从结果中我们可以看到，与对照组相比，通过保存液1-3对粪便样本常温保存两周时，细菌的基因组DNA明显更为稳定。
实施例6
1.如实施例3的实验操作条件一样，挑选四位随机试验者的粪便样本，按粪便与保存液质量比1:3的比例，与4位随机的受试者的粪便样品混匀后，将16个样品与保存液的混合物至于-20℃放置14天，取上述混合液各500μl用全血基因组DNA提取试剂盒(天根科技有限公司，商品编号N2516)提取DNA，并分别溶解于100μl的洗脱液中得相应的四个志愿者的样品，分别编号样品1、样品2、样品3和样品4，对应的保存液-1，保存液-2，保存液-3，保存液-C分别通过I、II、III、IV来标记，以100ul ddH20溶解抽提到的DNA。
上述四个样品的在不同的保存液处理下的DNA浓度检测结果如下表所示：
表7.粪便样品在不同的保存液中-20℃放置两周后的DNA浓度测定结果(ng/μL)
从结果中我们可以看到，与对照组相比，通过保存液1-3对粪便样本-20℃保存两周时，细菌的基因组DNA明显更为稳定。
实施例7样品DNA扩增结果
I.核糖体16S RNA基因第四可变区扩增(NEB公司的试剂):
1)特异性扩增引物
(上游序列5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’，下游序列5’-TAC GGY TAC CTTGTT ACG ACT T-3’)
2)Taq DNA聚合酶
3)MgC12
4)2.5mmol/L dNTP Mixture
5)ddH20
6)10x rTaq PCR Buffer
7)DNA模板
II.操作步骤:
1)每个PCR反应体系总量为20ul，包括:10.75ul ddH2O，2.5ul 10x Taq Buffer，2ul dNTP Mixture，1.5ul MgC12，0.25ul Taq DNA聚合酶，上游引物和下游引物各0.5ul，2ul模板DNA。
2)在每个EP管中分装好每个20ul的PCR反应体系后，按照以下PCR程序扩增反应:
step1:98℃，2min
step2:92℃，30s
step3:58℃，30s
step4:72℃，45s
step5:One to step 2，32cycles
step6:72℃，5min
step7:40℃，forever
step8:end and hold at 4℃
3)扩增得到的目的基因片段，送往测序公司进行测序，获得序列后进行后续生物信息分析(由金唯智代理分析)，得到菌群结果。
样本DNA的扩增结果如图2所示，每一副小图代表一位志愿者的粪便细菌DNA的扩增结果，有亮色条带并且位置在320bp左右，则表示成功扩增了核糖体16S rRNA基因第四可变区引物对应的目的片段。结果表明，四种方式保存处理的样本，其核糖体16S RNA基因第四可变区都被成功扩增，说明不同的保存方法对于粪便细菌DNA的扩增效率影响不大。
图3为本发明实施例2-7中多个志愿者的随机抽样在四种不同条件下的DNA回收效率的统计图；其中图3A为四名志愿者的样品分别在五种配方溶液冻存一周的DNA回收效率的统计结果，其中图3B为相同的样本在样品冻存2周后的检测结果；图3C和图3D分别为样品常温放置一周及样品常温放置两周后的遗传物质的变化统计情况。由此可知，保存液1-3在冻存条件(-20摄氏度)和常温条件下均对遗传物质的稳定起重要作用。
实施例8.粪便类样品中细菌丰富度比较
经过上述实验操作，我们收集了四位志愿者的粪便样本，分装成六份，分别进行一下六种处理方式：
1)立即处理:采样至少0.2g粪便样品立即进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
2)按照保存液1的配方(配方见表2)，冻存两周后处理(保存于-20度冰箱):采集至少0.2g粪便样品，添加保存液，-20℃下密封，保存2周，2周后再进行DNA提取，核糖体16SRNA基因第四可变区扩增等处理。
3)按照保存液1的配方，常温避光放置保存两周:采集至少0.2g粪便样品，室温下25℃密封，避光，使用本发明保存配方(配方见表2)保存两周，然后再进行DNA提取，核糖体16SRNA基因第四可变区扩增等处理。
4)按照表3的保存液C的对照配方，冻存两周后处理(保存于-20度冰箱):采集至少0.2g粪便样品，添加保存液，-20℃下密封，避光保存2周，使用本发明涉及到的对照保存配方(配方见表3)保存两周，然后再进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
5)按照对照配方保存液C保存两周:室温下25℃密封，避光，使用对照保存配方(配方见表3)保存两周后，然后再进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
6)不做任何处置室温放置两周:室温下25℃密封，避光保存两周，然后再进行DNA提取，核糖体16S RNA基因第四可变区扩增等处理。
具体实验结果如图4所示：将四个志愿者的粪便样品经过6种不同的处理方式收集，交由测序服务公司进行测序，获得对应的菌群，通过生物信息学分析，计算物种多样性指数，进行比较。如图4的统计结果所示，每一副小图是随机的志愿者的粪便样本经过上述6种不同的保存方式(包括更换保存液)测得的细菌的丰富程度，每一个柱子代表某个志愿者的某一种处理方式，每种图案对应的处理方式可见图例，数值越高则代表细菌的丰富程度越高。结果表明，采用本专利涉及到的保存液1的配方冻存粪便样品2周以及常温保存2周的细菌丰富度和采样后立即处理的结果较为接近，而对照配方保存液C的常温保存两周的效果远低于冻存2周的，同时与实验组新鲜样品直接处理组相比较，菌群的丰富度差异显著，远差于保存液1常温保存的细菌丰度，而不做任何保存的结果与采样后立即处理组的结果差异更大。从测序分析的结果展示常温保存需要添加保存液，使用本发明涉及到的保存液能有效维持细菌的组份，降低外界因素对细菌组份的破坏。实施例9.不同的保存方式，粪便样品中纲水平菌群构成的异同性分析
经过上述实验操作，我们获得了四位志愿者六种不同处理方式获得的菌群，通过生物信息学分析，计算每个样品中的细菌分属于哪些细菌纲，进行比较。基于纲水平的细菌相对丰度构成如图5所示，每一副小图是一位志愿者6种不同保存方式测得的纲水平的细菌相对丰度构成，每一个柱子代表的是某个支援者的某一种保存方式，分别由1，2，3，4，5，6表示，对应的保存方式可见图例，若某一种细菌占的比例多，则其在柱子中所占的比例就会变大。从图5的统计结果表明，除去不做任何措施保存两周以外的结果表明，保存液1保存两周的结果与采样后立即处理组最为相似，其次为保存液1常温保存2周后处理，最后为保存液C对照组冻存保存2周，不用任何措施保存2周的结果与其余几种相差较大。
从上述具体的实施案例可以得出以下结论：采用保存液1常温保存最长可达14天，因此可以通过在类粪便样品中添加发明专利中所述的保存液-1，采取常温运输，高效稳定期可达7天。基于细菌丰富度，菌群关系，以及菌属构成的分析，得出本发明所述保存液配方，其效果与传统的冻存液处理相比有明显的优异性，且明显优于发明书涉及到的对照配方以及不做任何处理的保存方案。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用作对本发明保护范围的限定。
序列表
<110>苏州阿迪康生物科技有限公司
<120>一种粪便样本的保存方法、保存用溶液、制备方法及应用
<160> 2
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 16S RNA 基因第四可变区上游序列
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 16S RNA 基因第四可变区下游序列
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (9)

1.一种粪便类样本保存用溶液，其用于与粪便样本混合，其特征在于：以水溶性有机物作为主要成分，上述水溶性有机物选自水溶性醇、酮类、醛类及砜类的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的粪便类样本保存用溶液，其特征在于：所述保存用溶液的溶剂为缓冲溶液，水溶性有机物溶于缓冲溶液中。
3.根据权利要求1所述的粪便类样本保存用溶液，其特征在于：所述粪便样本保存用溶液的pH为7.0～7.4。
4.根据权利要求1所述的粪便类样本保存用溶液，其特征在于：所述水溶性有机物可替换为自由直链脂肪酸、二羧酸、氨基酸、芳香族或杂环的多元羧基酸中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的粪便类样本保存用溶液，其特征在于，所述溶液的具体成分如下：w/v为质量体积比
且所述的保存用溶液的pH值为7.0～7.5，渗透压为260～300mOsm/L。
6.权利要求1-5任意一项所述的保存用溶液的制备方法，其特征在于，按照配方称取各组成成分，用无菌去离子水溶解后，通过0.22um的滤膜过滤或高压灭菌，室温保存即得保存用溶液。
7.权利要求1-5任意一项所述的保存用溶液在保存粪便细菌、保持细菌遗传物质稳定中的应用。
8.一种粪便类样本的保存方法，其特征在于：将采集的粪便类样本与权利要求1-5任意一项所述的粪便类样本保存用溶液混合。
9.根据权利要求8所述的保存方法，其特征在于：保存粪便细菌的方法如下：
(1)采集至少0.2g新鲜的粪便样品；
(2)迅速将粪便样品放入权利要求1-5任意一项所述的保存用溶液，室温下密封，粪便样品不暴露在空气中，粪便样品浸泡于保存用溶液中，所述的粪便样本和保存用溶液用量的比例为1:3w/v。
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