CN109371015A - 一种粪便保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及粪便微生物检测领域，具体而言，涉及一种粪便保存液及其制备方法和应用。一种粪便保存液，所述粪便保存液的溶剂为水，以所述粪便保存液的体积计，各组分的浓度如下：乙二胺四乙酸9‑13g/L，异硫氰酸胍400‑600g/L，1M Tris‑HCl(pH＝7‑10)体积百分数为8％‑10％，氯化钠7‑10g/L，山梨醇50‑80g/L，十二烷基硫酸钠20‑40g/L。该粪便保存液实现了粪便样本的常温保存以及随时随地的采集粪便样本，并且提高了每个菌属微生物DNA的稳定性以及保存时间，而且便于长途运输。

Description

一种粪便保存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及粪便微生物检测领域，具体而言，涉及一种粪便保存液及其制备方法和应用。

背景技术

过去10年中，肠道微生物逐渐成为最热门的生物研究领域，这得益于第二代测序手段的成熟和组学思想的发展。宏基因组、宏转录组、代谢组等组学技术逐渐被应用于肠道微生物的研究中，为深入阐明其结构和功能提供了基础。2007年底，美国国立卫生研究院启动了“人类微生物组计划”(human microbiome project)，亚洲乳酸菌协会联盟也发起了“亚洲人肠道菌相与健康研究”计划，各国也纷纷为微生物组学设立了专项计划。研究表明，肠道微生物作为人体代谢的重要参与者，对生理功能起到十分重要的调控作用。肠道微生态环境紊乱会导致宿主多种疾病的发生，如肠易激综合症(IBS)，就是由于患者肠道内变形菌门含量显著升高造成。

目前对肠道微生物的研究主要采用分子生物学方法，相比于传统的体外细菌培养技术，通过对粪便中肠道微生物基因组的分析逐渐成为最可靠的研究手段。而肠道微生物DNA的提取质量成为应用分子生物学技术的前提和试验成功与否的关键。由于肠道菌群的多样性，一旦离开人体，其活性和结构都会发生巨大变化，一种粪便常温保存液成为试验成功的保证。

目前粪便保存的常用方法是液氮速冻，然后-20℃～-80℃保存，这无疑加大了试验的可操作性，不能适用于多样的采集环境。而且常见的粪便保存液，稳定性较差，即使可用于常温保存，也不能保证其中微生物DNA的稳定性。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种粪便保存液，该粪便保存液具有便携性，可随时随地的采集粪便样本，实现了粪便样本的常温保存，并保证其中微生物DNA的稳定。

本发明的第二目的在于提供一种所述的粪便保存液的制备方法，该方法操作简单，而且能够提高保存液的保存时间和稳定性。

本发明的第三目的在于提供一种粪便保存方法，方便快捷，同时也方便了粪便样品的长途运输及长时间保存。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明的第一方面提供一种粪便保存液，所述粪便保存液的溶剂为水，以所述粪便保存液的体积计，各组分的浓度如下：乙二胺四乙酸9-13g/L，异硫氰酸胍400-600g/L，1MTris-HCl(pH＝7-10)体积百分数为8％-10％，氯化钠7-10g/L，山梨醇50-80g/L，十二烷基硫酸钠20-40g/L。

通过上述各成分的添加以及含量的限定，实现了粪便样本的常温保存，能够随时随地对粪便进行采集，并且提高了粪便样本中的各种微生物DNA的稳定性以及保存时间，便于长途运输。

其中，乙二胺四乙酸能够螯合溶液中的钙离子，有效阻止生物体反应和酶反应；Tris-HCl能够为核酸提供一个合适的缓冲体系；氯化钠能够稳定溶液的离子浓度；山梨醇能够防止微生物核酸物质的氧化，而且作为一种食品级添加剂，能够降低粪便保存液对人体的危害，且不同于乙醇，能够实现粪便保存液的长途运输；十二烷基硫酸钠能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质的疏水部位，改变蛋白质构象，同时十二烷基硫酸钠与异硫氰酸胍进行搭配，能够破坏蛋白质的疏水作用；本发明通过上述各成分合理搭配，在其共同作用下，能够快速对粪便中各种微生物进行裂解，溶解细胞中的蛋白质，提高核酸物质的解聚和释放；并且为微生物核酸物质提供了稳定的保存环境，保障了粪便中各种微生物核酸物质的稳定性，进而提高了对粪便中微生物测序分析的准确性。

如在不同的实施例中，粪便保存液的各组分可以为：以所述粪便保存液的体积计，乙二胺四乙酸9g/L，异硫氰酸胍600g/L，1M Tris-HCl(pH＝7-10)体积百分数为10％，氯化钠10g/L，山梨醇50g/L，十二烷基硫酸钠20g/L；

还可以为：以所述粪便保存液的体积计，乙二胺四乙酸10g/L，异硫氰酸胍500g/L，1M Tris-HCl(pH＝7-10)体积百分数为8％，氯化钠7g/L，山梨醇70g/L，十二烷基硫酸钠30g/L；

还可以为：以所述粪便保存液的体积计，乙二胺四乙酸12g/L，异硫氰酸胍450g/L，1M Tris-HCl(pH＝7-10)体积百分数为10％，氯化钠8g/L，山梨醇60g/L，十二烷基硫酸钠30g/L；

还可以为：以所述粪便保存液的体积计，乙二胺四乙酸13g/L，异硫氰酸胍600g/L，1M Tris-HCl(pH＝7-10)体积百分数为8％，氯化钠7g/L，山梨醇80g/L，十二烷基硫酸钠40g/L；

等等。

溴百里酚蓝是一种指示剂，在碱性溶液中显蓝色，在酸性溶液显黄色；本发明中通过在粪便保存液中添加溴百里酚蓝，能够实时监测所述保存液的酸碱环境，并直接判断粪便保存液的有效性。

进一步地，所述粪便保存液还包括判断所述粪便保存液是否有效的指示剂；

所述指示剂为溴百里酚蓝。

优选地，所述溴百里酚蓝在所述粪便保存液中的浓度为0.5-2g/L。

本发明中对粪便保存液的pH值不做严格限制，优选地，所述粪便保存液的pH为7-10；优选pH为9。通过对pH值的具体限定，能够为微生物核酸物质提供稳定的环境，利于提高整个粪便样本中细菌丰度的稳定性。

一般情况下，经上述组分配置得到的粪便保存液偏碱性，其pH可通过添加强碱进行调整，如添加1M的氢氧化钠溶液。

本发明第二方面提供一种上述粪便保存液的制备方法，将各组分混合、定容，随后，进行灭菌，得到所述保存液。

通过灭菌处理，能够防止粪便保存液中繁殖体和芽孢对粪便取样的影响，提高对粪便中微生物测序分析的准确性。

进一步地，配置溶液过程中还包括调节pH值的步骤。

一般情况下，经上述组分配置得到的粪便保存液偏碱性，其pH可通过添加强碱进行调整，如添加1M的氢氧化钠溶液。

进一步地，灭菌为高压蒸汽灭菌；优选地，所述灭菌温度为120-123℃，灭菌时间为18-22分钟。

进一步地，所述灭菌后还包括分装的步骤，搅拌均匀后进行所述分装。灭菌结束后，自然冷却至常温，磁力搅拌器摇匀后分装到保存管中。

进一步地，所述搅拌为磁力搅拌；

优选地，所述搅拌速度750-1000r/min，搅拌时间为10-15min。

采用上述特定的灭菌参数以及搅拌方式，能够提高灭菌效果，以及各成分的混匀度，提高粪便保存液产品的稳定性。

本发明提供的粪便保存液，溶液为蓝色透明液体，无异物；分装差异限度±5％。该成品试剂在37℃，存放14天后复检，结果符合相应要求，复检合格的粪便保存液可以长期保存，即具有储存稳定性。使用该保存液保存的样本提取后DNA结果条带完整，总量大于500ng，即具有DNA含量准确性。

本发明的第三方面提供一种粪便保存方法，该保存方法为在每克粪便样本中至少添加2ml上述的保存液。通过上述保存方法能够提高粪便中微生物DNA的保存稳定性和保存时间。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

(1)本发明粪便保存液实现了粪便样本的常温保存以及随时随地的采集粪便样本，并且提高了粪便样本中各种微生物DNA的稳定性以及保存时间，而且便于长途运输。

(2)本发明粪便保存液的制备方法操作简单，而且能够提高保存液产品的保存时间和稳定性；此外，能够防止保存液中繁殖体和芽孢对粪便样本的影响，提高对粪便中微生物测序分析的准确性。

(3)本发明中粪便保存方法能够提高粪便样本中微生物DNA的稳定性和保存时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验例1中样本DNA的扩增结果图；

图2为本发明实验例1中A组的一份粪便样本不同处理后的生信分析图；

图3为本发明实验例1中A组的另一份粪便样本不同处理后的生信分析图；

图4为本发明实验例1中A组的另一份粪便样本不同处理后的生信分析图；

图5为本发明实验例1中B组的一份粪便样本不同处理后的生信分析图；

图6为本发明实验例1中B组的另一份粪便样本不同处理后的生信分析图；

图7为本发明实验例1中B组的另一份粪便样本不同处理后的生信分析图；

图8为本发明实验例1中C组的一份粪便样本不同处理后的生信分析图；

图9为本发明实验例1中C组的另一份粪便样本不同处理后的生信分析图；

图10为本发明实验例1中C组的另一份粪便样本不同处理后的生信分析图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市面购买获得的常规产品。

实施例1

一、粪便保存液

在500ml的上述保存液中包含：乙二胺四乙酸(0.5M)40ml、1M Tris-HCl(pH为9)50ml、山梨醇(质量浓度70％)50ml、氯化钠4.5g、异硫氰酸胍236.3g、十二烷基硫酸钠15g、余量为水。

粪便保存液的pH为9。

二、制备方法

上述粪便保存液的制备方法，包括将上述各原料成分混合，采用纯化水定容至500ml，调节pH至9；

随后，在温度为121℃下，高压蒸汽灭菌20min，自然冷却至常温，采用磁力搅拌器以750-1000r/min搅拌速度，搅拌10-15分钟，得到上述粪便保存液。

实施例2

本实施例为一种粪便保存液，该粪便保存液与实施例1的粪便保存液基本相同，区别仅在于在还包含溴百里酚蓝0.5g；该粪便保存液的制备方法参照实施例1的制备方法。

实施例3

一、粪便保存液

在500ml的上述保存液中包含：乙二胺四乙酸4.5g、1M Tris-HCl 40ml、山梨醇25g、氯化钠3.5g、异硫氰酸胍300g、溴百里酚蓝1g、十二烷基硫酸钠20g、余量为水。

粪便保存液的pH为7。

二、制备方法

上述粪便保存液的制备方法，包括将上述各原料成分混合，采用纯化水定容至500ml，调节pH至7；

随后，在温度为123℃下，高压蒸汽灭菌20min，自然冷却至常温，采用磁力搅拌器以750-1000r/min搅拌速度，搅拌10-15分钟，得到上述粪便保存液。

实施例4

一、粪便保存液

在500ml的上述保存液中包含：乙二胺四乙酸6.5g、1M Tris-HCl 40ml、山梨醇40g、氯化钠5g、异硫氰酸胍200g、溴百里酚蓝1g、十二烷基硫酸钠10g、余量为水。

粪便保存液的pH为10。

上述粪便保存液的制备方法，包括将上述各原料成分混合，采用纯化水定容至500ml，调节pH至10；

随后，在温度为121℃下，高压蒸汽灭菌20min，自然冷却至常温，采用磁力搅拌器以750-1000r/min搅拌速度，搅拌10-15分钟，得到上述粪便保存液。

实验例1

1、样品来源及保存

采集九位志愿者的粪便样本(分A、B、C三组，每组3份样品)，每个志愿者的样本采集6份，每份至少0.2g粪便样本，分别做6种不同的处理：

(1)立即处理：将采集样本立即进行DNA提取，核糖体16S rRNA V3/V4可变区扩增，电泳检测、文库构建、测序等处理；

(2)自配保存液常温保存：将采集的样本使用本发明实施例2制得的粪便保存液保存，每克粪便样本中添2ml，常温保存5天后，进行DNA提取，核糖体16S rRNA V3/V4可变区扩增，电泳检测、文库构建、测序等处理；

(3)自配保存液常温保存：将采集的样本使用本发明实施例2制得的粪便保存液保存，每克粪便样本中添2ml，常温保存10天后，进行DNA提取，核糖体16S rRNA V3/V4可变区扩增，电泳检测、文库构建、测序等处理；

(4)自配保存液常温保存：将采集的样本使用本发明实施例2制得的粪便保存液保存，每克粪便样本中添2ml，常温保存15天后，进行DNA提取，核糖体16S rRNA V3/V4可变区扩增，电泳检测、文库构建、测序等处理；

(5)不加保存液常温保存：将采集的样本直接常温保存5天后，进行DNA提取，核糖体16S rRNA V3/V4可变区扩增，电泳检测、文库构建、测序等处理；

(6)不加保存液-20℃保存：将采集的样本直接放于-20℃保存5天后，进行DNA提取，核糖体16S rRNA V3/V4可变区扩增，电泳检测、文库构建、测序等处理；

2、粪便样本DNA提取

粪便样本的DNA提取采用OMEGA公司的Stool DNA Kit试剂盒，每次取样0.1g，具体步骤如下：

(1)取样：取样时要先将样品混匀，称取100mg粪便样本于一个2ml带有玻璃珠的离心管中；

(2)裂解抽提：

a.加入10μl Proteinase K和350μl SP1，最大转速震荡5min；

b.放入恒温混匀仪中，设置震荡频率800-1200rpm，70℃孵育13min；

c.-20℃冰箱孵育2min；

d.加入100μl SP2，震荡30s；

e.-20℃冰箱静置5min；

(3)沉淀洗涤：

a.4℃，20000rcf离心5min，小心将上清转至新的1.5ml离心管；

b.加入200μl HTR Reagent，震荡10s，室温静置2min；

c.室温，15000rcf离心2min；

d.将400μl上清转入新的2ml离心管，加入10μl Rnase A混匀，70℃孵育3min；

e.加入400μl无水乙醇、400μl BL，震荡混匀10s；

f.将上一步得到的所有样本转入到放置在收集管里的HiBind DNA column，13000rcf离心1min，弃掉废液及收集管；

g.将吸附柱放入新的收集管里，加入500μl HB洗涤，13000rcf离心1min，弃掉废液及收集管；

h.将吸附柱放入新的收集管里，加入700μl DNA Wash Buffer，13000rcf离心1min，弃掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；

i.室温13000rcf离心2min，将吸附柱放置在新的1.5ml离心管内，加入预热至70℃的50μl EB，室温放置2min，13000rcf离心2min收集DNA。

3、核糖体16S rRNA V3/V4可变区扩增

(1)试剂

a.引物：Primer F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG),Primer F(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)

b.2x Taq Master Mix

c.ddH₂O

d.模板

(2)操作步骤

a.每个PCR反应体系总量为25μl，包括12.5μl 2x Taq Master Mix，上下游引物各0.5μl，模板取用量2μl，ddH₂O 9.5μl。

b.反应程序：95°5min，(95°45s，63°50s，72°45s)35cycles，72°10min，4°+∞。

c.电泳检测：取扩增产物3μl进行电泳检测，结果如图1。

(3)电泳结果

样本DNA的扩增结果如图1所示，图1中，(a、b、c)、(d、e、f)、(g、h、i)分别为A、B、C三组结果；

编号1：立即处理；

编号2：自配粪便保存液常温保存5天处理；

编号3：不加保存液-20℃保存5天处理；

编号4：不加保存液常温保存5天处理；

编号5：自配粪便保存液常温保存10天处理；

编号6：自配粪便保存液常温保存15天处理；

编号M：D2000marker。

每一副小图代表一位志愿者的粪便细菌DNA的扩增结果，有亮色条带并且位置在600bp左右，则表示成功扩增了核糖体16S rRNA基因V3/V4可变区引物对应的目的片段。结果表明，6种方式保存处理的样本，其核糖体16S rRNA基因V3/V4可变区都被成功扩增，说明不同的保存方法对于粪便细菌DNA的扩增效率影响不大。

4、生信分析

构建好的文库在本公司(奥维森基因科技有限公司)进行二代测序，获得序列后进行信息分析，比较各样品的菌群多样性，结果如图2-图10。

图2-图4为A组结果；图5-图7为B组结果；图8-图10为C组结果。

图2-图10中，编号1：立即处理；

编号2：自配粪便保存液常温保存5天处理；

编号3：不加保存液-20℃保存5天处理；

编号4：不加保存液常温保存5天处理；

编号5：自配粪便保存液常温保存10天处理；

编号6：自配粪便保存液常温保存15天处理。

图2-10中，每一副小图代表一位志愿者6种保存方式测得的属水平的细菌相对丰度构成，每一根柱子代表该志愿者的某一种保存方式下属水平的细菌构成，对应的样本处理可见图注，若样本中某细菌占比越大，则其在柱子中所占的比例越高，结果表明，本发明保存液保存样本5天、10天、15天后的结果与直接处理或冻存5天后的样本在属水平上基本一致，而常温保存5天的结果与其他5种方式差异较大。

实施例3-4制得的粪便保存液采用实验例1的方法保存样品，检测结果同实验例1一致。

通过上述结果可知，本发明样本保存液可用于粪便样本的常温保存，能保证样本中的细菌丰度长期稳定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种粪便保存液，其特征在于，所述粪便保存液的溶剂为水，以所述粪便保存液的体积计，各组分的浓度如下：乙二胺四乙酸9-13g/L，异硫氰酸胍400-600g/L，1M Tris-HCl(pH＝7-10)体积百分数为8％-10％，氯化钠7-10g/L，山梨醇50-80g/L，十二烷基硫酸钠20-40g/L。

2.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述粪便保存液还包括判断所述粪便保存液是否有效的指示剂；

所述指示剂为溴百里酚蓝。

3.根据权利要求2所述的粪便保存液，其特征在于，所述溴百里酚蓝在所述粪便保存液中的浓度为0.5-2g/L。

4.根据权利要求1-3任一所述的粪便保存液，其特征在于，所述粪便保存液的pH为7-10；优选pH为9。

5.权利要求1-4任一所述的粪便保存液的制备方法，其特征在于，将各组分混合、定容，随后，进行灭菌，得到所述保存液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，配置溶液过程中还包括调节pH值的步骤。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌为高压蒸汽灭菌。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌温度为120-123℃，灭菌时间为18-22min。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌后还包括分装的步骤，搅拌均匀后进行所述分装，

进一步地，所述搅拌为磁力搅拌；

优选地，所述搅拌速度750-1000r/min，搅拌时间为10-15min。

10.一种粪便保存方法，其特征在于，在每克粪便样本中至少添2ml权利要求1-3任一所述的粪便保存液。