CN115058342A - 一种具有酸碱指示功能的粪便样本常温保护液 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种具有酸碱指示功能的粪便样本常温保护液，包括有硫氰酸胍、乙醇、EDTA‑Na2、NaCl、磷酸缓冲液、吐温20、BSA、甲基红、溴甲酚绿、儿茶酚紫、溴甲酚紫；其中，硫氰酸胍、乙醇、EDTA‑Na2、NaCl、磷酸缓冲液、吐温20和BSA构成保护液A，用于在常温下保存粪便；在保护液A的基础上增加甲基红、溴甲酚绿、儿茶酚紫和溴甲酚紫构成保护液B，用于快速检测粪便的酸碱性。该保护液能够在常温条件下稳定保存粪便样本菌群结构，同时具备快速检测粪便酸碱性的功能。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种具有酸碱指示功能的粪便样本常温保护液。
背景技术
随着人们对肠道微生态的研究深入，肠道健康与肠道菌群受到了更多的关注。许多文献报道称，粪便样本的pH会随着饮食习惯及身体健康状况变化。素食主义者的粪便pH普遍在6.0-6.3之间；而喜食肉类蛋白的人群粪便pH则多为6.0-7.0；多数正常人的粪便pH为6.6±0.3；结直肠癌患者的pH则为碱性(pH≥7.0)，且粪便pH为碱性的人群相较于其他人，结直肠癌病发的概率更高。当肠道菌群失衡、消化不良或患有急性肠炎时，粪便就会呈酸性。除此之外，患有一些其他疾病时，粪便的pH也会发生改变。因此粪便的酸碱性可以快速粗略的反映人体的健康状况。
在临床粪便样本检测中，经常会结合粪便菌群的结构丰度来预测分析人体的各项健康指标。然而，在粪便排泄出体外后，菌群结构会随着细菌的繁殖及死亡不断的发生改变，从而导致长时间放置后的粪便样本与初始的粪便样本菌群结构差异大，检测结果出现大幅偏差。因此如何保存粪便样本，使其菌群结构不会发生明显改变成了肠道菌群研究的重中之重。
目前医院及检测机构常用的粪便样本保存方法为-80℃超低温冻存，这种保存方式对设备要求高，保存成本高，难以长途运输，并且反复冻融容易破坏其中的DNA，导致检测结果不准确。因此，粪便常温保护液成为了保存粪便样本的最佳选择。它能使粪便样本摆脱低温保存的限制，可以在常温环境中保存和运输，同时也能最大程度的减小肠道菌群结构发生的变化。
如专利申请2017113700585公开了一种粪便保存液及其应用。本发明的粪便保存液利用乙醇作为固定剂、柠檬酸钠作为固定辅助剂、EDTA-二钠为抗凝剂、Tris-HCl为缓冲液、NaCl为离子强度维持剂，并配方有十二烷基硫酸钠，实现粪便样本的常温保存。又如专利申请2018115344096公开了一种粪便保存液，所述粪便保存液的溶剂为水，以所述粪便保存液的体积计，各组分的浓度如下：乙二胺四乙酸9-13g/L，异硫氰酸胍400-600g/L，1MTris-HCl(pH＝7-10)体积百分数为8％-10％，氯化钠7-10g/L，山梨醇50-80g/L，十二烷基硫酸钠20-40g/L。该粪便保存液实现了粪便样本的常温保存以及随时随地的采集粪便样本。
然而，现如今检测粪便酸碱性的常规方法多为使用pH检测仪直接插入粪便样本中进行检测，然而这种方法不但容易使得粪便样本交叉污染，且仪器清洗困难，检测所需的粪便量也较大。不论是对检测者还是被检测者都造成了不小的麻烦。
因此，需要设计出一种可以检测粪便酸碱性的常温保护液。这种保护液在保证其能在常温条件下稳定保存粪便样本菌群结构的前提下，也同时具备快速检测粪便酸碱性的功能。
发明内容
为解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种具有酸碱指示功能的粪便样本常温保护液，该保护液在保证其能在常温条件下稳定保存粪便样本菌群结构的前提下，也同时具备快速检测粪便酸碱性的功能。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下。
一种具有酸碱指示功能的粪便样本常温保护液，包括有硫氰酸胍、乙醇、EDTA-Na2、NaCl、磷酸缓冲液、吐温20、BSA、甲基红、溴甲酚绿、儿茶酚紫、溴甲酚紫；其中，硫氰酸胍、乙醇、EDTA-Na2、NaCl、磷酸缓冲液、吐温20和BSA 构成保护液A，用于在常温下保存粪便；在保护液A的基础上增加甲基红、溴甲酚绿、儿茶酚紫和溴甲酚紫构成的保护液B，用于快速检测粪便的酸碱性。
具体的保护液配方如下：
以重量百分比计算，保护液A包括有：硫氰酸胍0.01-5M、乙醇30％-60％、EDTA-Na20.001-0.35M、NaCl 0.15M、磷酸缓冲液5％-15％、吐温20 0.05％-1％、BSA 2.5-100mM，PH7.0；
保护液B包括有：硫氰酸胍0.01-5M、乙醇30％-60％、EDTA-Na2 0.001-0.35M、NaCl0.15M、磷酸缓冲液5％-15％、吐温20 0.05％-1％、BSA 2.5-100mM、0.5％-2％的甲基红、0.01％-1％的溴甲酚绿、0.01-0.8％的儿茶酚紫、0.05％-1％的溴甲酚紫；保护液B具有酸碱指示功能，其变色范围为4.2-9.0。
最优的组方为：硫氰酸胍(Guanidinethiocyanate)2M、乙醇30％、EDTA-Na20.25M、NaCl 0.15M、磷酸缓冲液10％、吐温20 0.5％、BSA 5mM，0.5％的甲基红、0.25％的溴甲酚绿、0.5％的儿茶酚紫、1％的溴甲酚紫，pH7.0；保护液B具有酸碱指示功能，其变色范围为4.2-9.0。
本发明的保护液A对粪便样本中的DNA具有良好的保护效果从而起到保护菌群结构的目的，同时，在保护液A的基础上增加甲基红、溴甲酚绿、儿茶酚紫和溴甲酚紫构成保护液B能够根据不同的酸碱度进行变色，在保持原有的DNA保护功能的前提下，具有快速指示粪便样本酸碱性的功能。
本发明具有以下几个优点：
(1)成本低廉；
(2)菌群结构能长时间保持稳定及完整性；
(3)保护液物理及化学性质稳定；
(4)生产工艺简单；
(5)能够快速简便的检测粪便酸碱性。
附图说明
图1为本发明的常温保护液颜色对照图。
图2为本发明的保护液B恒温环境下颜色变化示意图。
图3为第一个志愿者粪便样本在两种常温保护液中的菌群丰度图。
图4为第二个志愿者粪便样本在两种常温保护液中的菌群丰度图。
图5为第三个志愿者粪便样本在两种常温保护液中的菌群丰度图。
图6为本发明的粪便样本菌群结构对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所实现的保护液具有保护液A和保护液B两部分，其中：
保护液A包括有：硫氰酸胍2M，乙醇30％、EDTA-Na2 0.25M、NaCl 0.15M、磷酸缓冲液10％、吐温20 0.5％、BSA 5mM，pH7.0；
在保护液A的基础上，又增加0.5％的甲基红、0.25％的溴甲酚绿、0.5％的儿茶酚紫、1％的溴甲酚紫构成保护液B，保护液B具有酸碱指示功能，其变色范围为4.2-9.0。
其中，保护液A对粪便样本中的DNA具有良好的保护效果从而起到保护菌群结构的目的，而保护液B在保护液A的基础上能够根据不同的酸碱度进行变色，在保持原有的DNA保护功能的前提下，具有快速指示粪便样本酸碱性的功能，便于快速检测粪便酸碱性。
实验试剂：硫氰酸胍、乙醇、EDTA-Na2、NaCl、磷酸缓冲液、吐温20、BSA、甲基红、溴甲酚绿、儿茶酚紫、溴甲酚紫、粪菌基因提取试剂盒(QIamp Fast DNA Stool Mini Kit(50))。
常温保护液配方：
粪便样本常温保护液(保护液A)：硫氰酸胍(Guanidinethiocyanate)2M、乙醇30％、EDTA-Na2 0.25M、NaCl 0.15M、磷酸缓冲液10％、吐温20 0.5％、BSA 5mM，pH7.0
升级常温保护液(保护液B)：在粪便样本常温保护液配方的基础上，加入0.5％的甲基红、0.25％的溴甲酚绿、0.5％的儿茶酚紫、1％的溴甲酚紫；具有酸碱指示功能，其变色范围为4.2-9.0。
一、实验方案。
1、pH检测效果研究。
招募三名志愿者提供新鲜的粪便样本，每位志愿者的粪便样本先用pH计(METTLERTOLEDO)检测粪便pH值，分别挖取0.4～0.6g粪便样本置于装有4ml常温保护液B的采样管中，采样管上下颠倒混匀，静置5min后观察采样管中上清液的颜色，判断酸碱，并用pH计检测加有不同粪便样本的保护液B的pH值。
2、保护液稳定性研究。
为了进一步观察产品的稳定性，通过55℃高温下的加速试验进行稳定性评估。将保护液B分装至采样管中，每根采样管分装5ml，分装10根采样管。将10根采样管置于55℃恒温环境中。每隔10天拍照观察检测采样管中保护液的理化性质，检测颜色、pH是否有所变化，连续检测60天。
3、保护液对粪便中菌群丰度和结构影响研究。
将两种保护液各分装9根采样管，共18根采样管，每根采样管分装5ml保护液。将18根采样管置于55℃恒温环境中放置60天后取出，模拟保护液长时间储存后对粪便样DNA的保护效果。另外招募三个健康志愿者，每个志愿者分发装有两种保护液(常温保护液A和保护液B)的采样管各三管，每根采样管中收集0.4～0.6g左右的粪便样本。将装有粪便样本的取样管置于室温避光处放置48h，模拟采样管快递运输过程，用粪菌基因提取试剂盒(QIampFast DNA Stool Mini Kit(50))提取DNA并进行粪便菌群的高通量测序。
二、实验结果。
1、pH检测效果探究。
本实验招募的三名志愿者，其粪便pH分别为5.7、6.5、7.5，其粪便样本在常温保护液B中的颜色结果如表1所示。常温保护液颜色对照如图1所示，其中，A是保护液A；B是保护液B；C是加有粪便样本1的保护液B；D是加有有粪便样本2的保护液B；E是加有粪便样本3的保护液B。
粪便样本在加入常温保护液B后pH会有轻微的改变，但该变化幅度不大，与粪便样本pH接近，原常温保护液颜色为透明色(图1A)，升级常温保护液初始颜色为蓝色(图1B)。在加入粪便样本后常温保护液颜色会立即发生改变。当志愿者粪便样本pH为5.0-6.0时，保护液会呈现土黄色(图1C)；当志愿者粪便样本pH为6.1-6.9时，保护液会呈现黄绿色(图1D)；当志愿者粪便样本pH大于7.0时，保护液会呈现蓝紫色(图1E)；从颜色上可以明确的对三种不同酸碱性的粪便样本进行区分，说明保护液B能够在其变色范围内随着粪便样本pH变色，可以快速直观的反应粪便样本的酸碱性。
表1.粪便pH检测与常温保护液显色结果对比
| 样本 | 样本1 | 样本2 | 样本3 |
| 粪便pH | 5.7 | 6.5 | 7.5 |
| 保护液B pH | 5.9 | 6.6 | 7.4 |
| 保护液B颜色 | 土黄色 | 黄绿色 | 蓝紫色 |
2、保护液稳定性研究。
通过55℃恒温环境下长期跟踪观测具有酸碱指示功能的粪便样本常温保护液的稳定性。从外观上看(如图2所示，图2是保护液B在55℃恒温环境下的颜色变化图)，保护液(B)在60天的稳定性实验中颜色稳定，无明显变化；从理化性质上看(表2)，保护液(B)在60天的稳定性实验中pH稳定，无沉淀出现，理化性质稳定，说明该配方(常温保护液B)理化性质稳定，在37℃的环境中储存60天无显著改变。
表2.具有酸碱指示功能的常温保护液稳定性观察
| 时间 | pH | 颜色 | 性状 |
| 0天 | 7.01 | 蓝色 | 透亮无沉淀 |
| 10天 | 7.02 | 蓝色 | 透亮无沉淀 |
| 20天 | 7.01 | 蓝色 | 透亮无沉淀 |
| 30天 | 7.00 | 蓝色 | 透亮无沉淀 |
| 40天 | 7.01 | 蓝色 | 透亮无沉淀 |
| 50天 | 6.98 | 蓝色 | 透亮无沉淀 |
| 60天 | 7.02 | 蓝色 | 透亮无沉淀 |
3、保护液对菌群丰度的影响
为了还原实际应用场景，使用的常温保护液均在55℃环境中储存60天，并在加入粪便样本后于室温再放置2天，以模拟放置一段时间后的常温保护液在取完样本后，通过快递寄送的过程。之后利用QIamp Fast DNA Stool MiniKit(50)提取粪便菌群的DNA，并通过对V4区域进行测序，分析了同一粪便样本在原常温保护液和升级常温保护液中的菌群丰度。从三个志愿者粪便样本的丰度图结果来看(图3-图5所示)，样本1两种保护液菌群丰度均以Bacteroides、Parabacateroides、Roseburia、Escherichia-Shigella、Lachnospira等菌属为主；样本2两种保护液菌群丰度均以Prevotellaceae、Faecalibacterium、Ruminococcus、Bacteroides、Lachnospiracear等菌属为主；样本3两种保护液菌群丰度均以Prevotellaceae、Faecalibacterium、Lachnospiracear、Ruminococcus、Ruminococcacear等菌属为主；说明具有酸碱指示功能的粪便样本常温保护液不会影响粪便样本菌群丰度。
图6.是粪便样本菌群结构对比图，其中A为三个志愿者样本间的菌群结构图；B为志愿者1样本两种保护液之间菌群结构图；C为志愿者2样本两种保护液之间菌群结构图；D为志愿者3样本两种保护液之间菌群结构图。
再通过对测序数据的OTU进行两种保护液保护效果的菌群结构分析，以分析两种常温保护液间的差异大小。首先从三个志愿者粪便样本间的PCA图上看(图6A)，三个志愿者样本间的菌群结构显示出一定的差异性，不过对于同一个志愿者，两种保护液的样本间菌群结构无差异；进一步的从同一志愿者粪便样本的不同保护液组间PCA图来看(图6B、6C、6D)，志愿者1样本和志愿者2样本的PCA图显示出两种保护液菌群丰度的存在差异，但这种差异不具有统计学意义上的显著性(p＝0.1)；志愿者3样本的PCA图两种保护液的菌群结果高度相似，不存在显著性差异(p＝0.8)。
从上述的实验可以看出，本发明所实现的保护液在保持其原有的DNA保护功能的前提下，同时具有快速指示粪便样本酸碱性的功能。在此基础上，验证了其稳定性及其相较于原配方对菌群结构的影响。从验证的结果来看，不论是酸碱指示的快速直观性还是其理化性质的稳定性、菌群结构的保护效果均较好，本发明的结果符合预期及目标。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种具有酸碱指示功能的粪便样本常温保护液，其特征在于所述保护液包括有硫氰酸胍、乙醇、EDTA-Na2、NaCl、磷酸缓冲液、吐温20、BSA、甲基红、溴甲酚绿、儿茶酚紫、溴甲酚紫；其中，硫氰酸胍、乙醇、EDTA-Na2、NaCl、磷酸缓冲液、吐温20和BSA构成保护液A，用于在常温下保存粪便；在保护液A的基础上增加甲基红、溴甲酚绿、儿茶酚紫和溴甲酚紫构成的保护液B，用于快速检测粪便的酸碱性。
2.根据权利要求1所述的具有酸碱指示功能的粪便样本常温保护液，其特征在于以重量百分比计算，保护液A包括有：硫氰酸胍0.01-5M、乙醇30％-60％、EDTA-Na2 0.001-0.35M、NaCl 0.15M、磷酸缓冲液5％-15％、吐温20 0.05％-1％、BSA 2.5-100mM，PH7.0；
保护液B包括有：在A的基础上增加0.5％-2％的甲基红、0.01％-1％的溴甲酚绿、0.01-0.8％的儿茶酚紫、0.05％-1％的溴甲酚紫；保护液B具有酸碱指示功能，其变色范围为4.2-9.0。
3.根据权利要求2所述的具有酸碱指示功能的粪便样本常温保护液，其特征在于保护液A包括有：硫氰酸胍2M、乙醇30％％、EDTA-Na2 0.25M、NaCl 0.15M、磷酸缓冲液10％、吐温20 0.5％、BSA 5mM，PH7.0
保护液B包括有：硫氰酸胍2M、乙醇30％％、EDTA-Na2 0.25M、NaCl 0.15M、磷酸缓冲液10％、吐温20 0.5％、BSA 5mM、0.5％的甲基红、0.25％的溴甲酚绿、0.5％的儿茶酚紫、1％的溴甲酚紫，PH7.0。
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