CN114096668A - 样本保存液以及使用它的分析用装置和分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种在不冷冻保存样本的情况下能够稳定地保存样本中含有的胆汁酸、酚类、吲哚类以及有机酸的方法。本发明的样本保存液是用于分析来自生物体或来自环境的样本中含有的由胆汁酸、酚类、吲哚类以及有机酸组成的组中选择的至少1种成分而使用的样本保存液，至少含有以下(A)和(B)：(A)缩合磷酸盐或聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物；(B)硫氰酸胍、Tris‑HCl(pH 7至9)以及EDTA。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够稳定地保存来自生物体或环境的样本中含有的胆汁酸、酚类、吲哚类或有机酸等成分的样本保存液，涉及一种具有该样本保存液的分析用装置以及使用该样本保存液的分析方法。
背景技术
为了评价人或动物的健康状况或病理状况，采集粪便等的来自生物体的样本，并利用分子生物学技术分析该样本中存在的微生物群落结构(非专利文献1)。而且，除了微生物群落结构的分析之外，通过分析这些样本中含有的各种代谢物来综合阐明生物体内的代谢活性的代谢组学分析也已积极进行。
然而，由于粪便等来自生物体的样本主要由有机物和微生物构成，因此由于微生物对有机物的分解作用、微生物的繁殖/死亡等而容易随时间发生，非常不稳定。另外，样本中含有的代谢物也由于氧化、分解或挥发等其量随时间增减，容易发生变化。另外，由于上述的分析是由具备所述分析仪器的检验机构进行的，因此需要将采集的样本运送到检验机构，到检验机构拿到样本是需要时间的。因此，存在的问题是，根据从采集样本到进行分析为止的经过时间、保存/运输时的温度和保存方法等，分析的微生物群落结构和代谢物的分析值与采集时刻的值不同。
因此，在进行微生物群落结构分析和代谢物的分析时，通常的做法是在采集后立即冷冻保存样本，以维持采集时刻的样本的内含物。因此，在没有冷冻设施的地方采集样本实际上是不可能的，即使有冷冻设施，在普通家庭和工作场所中由于卫生方面的问题将粪便等来自生物体的样本冷冻保存也是困难的事情。另外，研究了对冷冻处理前后的样本和长时间冷冻保存前后的样本进行分析的结果，发现存在由于冷冻处理或长时间的冷冻保存降低部分微生物群落的检出率的情况，存在发生DNA分解的嫌疑以及有机酸量发生变化等的问题。
因此，作为不冷冻保存样本而能够稳定地保存/运输样本、使样本含有的微生物群落结构不发生变化的方法，在申请人的专利文献1中，已经公开了一种在含有0.01M以上且小于4M的硫氰酸胍、100mM Tris-HCl(pH 9.0)以及40mM EDTA的溶液中常温保存样本的方法。另外，在申请人的专利文献2中，提出了在含有4M的硫氰酸胍、100mM Tris-HCl(pH 9.0)或者40mM EDTA中的任何一种以上的溶液中室温保存样本、从而保存样本的DNA以及有机酸和多胺类等的化学物质的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2016-136911号公报
专利文献2：国际公开第2018/138913号公报
非专利文献
非专利文献1：Koji NAGASHIMA，Daisuke YASOKAWA，Kentaro ABE，RyojiNAKAGAWA，Tooru KITAMURA，Toshiharu MIURA，Shu KOGAWA，Bioscience Microflora，Vol.29，No.2,2010年,p.97-110
发明内容
发明所要解决的课题
近年来，通过与肠道菌群的分析一起进行分析，作为能够多方面评估肠道环境的代谢物，粪便中含有的胆汁酸、腐败物质(酚类和吲哚类)以及有机酸备受关注。例如，胆汁酸是在生物体内涉及到胆固醇代谢、脂溶性成分的消化吸收、表面活性引起的肠道菌群的变化的化合物。胆汁酸包括在肝脏中生物合成的初级胆汁酸和该初级胆汁酸通过肠道细菌的转化而生成的次级胆汁酸，次级胆汁酸具有毒性，被称为大肠癌的致癌促进剂。
另外，苯酚、对甲酚以及4-乙基苯酚等的酚类是在生物体内通过肠道细菌的作用由酪氨酸生成的，而吲哚以及粪臭素等的吲哚类是在生物体内通过肠道细菌的作用由色氨酸生成的。这些酚类以及吲哚类被称为腐败物质，除了被称为粪便恶臭的原因之外，还作为表示肠道环境恶化的指标而被熟知。生成的酚类的大部分通过血液对表皮形成过程产生不利影响，因此还被列为导致皮肤粗糙的因素之一。
并且，有机酸是除了使生物体内的肠道保持酸性，促进肠道的蠕动运动和从肠道的水分的分泌之外，还具有预防感染、抑制腐败产物的产生、粪便性状/排便的改善效果的化合物。有机酸是通过肠道细菌的膳食纤维和碳水化合物的代谢产物，在蛋白质和肽的消化中也会增加，因此最好与肠道菌群一起评估。
然而，如上所述，粪便样本中含有的胆汁酸、酚类、吲哚类以及有机酸等代谢物由于氧化、分解或挥发等其量容易随时间增减，即使将样本冷冻保存的情况下，代谢物的量也有可能会因冷冻处理或长期冷冻保存等而发生变化，因此存在难以分析采集时刻的粪便样本中含有的代谢物的量的问题。
另外，虽然在专利文献1和专利文献2中分别记载了样本在不冷冻的情况下能够稳定地保存/运输的保存方法，但至少没有关注胆汁酸、酚类以及吲哚类，没有进行用于将这些代谢物稳定的保存/运输方面的研究，其有效性也是未知的。
因此，本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于，提供一种不冷冻保存样本而能够稳定地保存样本中含有的胆汁酸、酚类、吲哚类以及有机酸的方法。
另外，本发明的另一个目的在于，提供一种在能够稳定地保存样本中含有的胆汁酸、酚类、吲哚类以及有机酸等的代谢物的同时也能够稳定地保存样本中含有的微生物群落结构的方法。
课题解决手段
为了解决上述课题，本发明的样本保存液是用于分析来自生物体或来自环境的样本中含有的由胆汁酸、酚类、吲哚类以及有机酸组成的组中选择的至少1种成分而使用的样本保存液，至少含有以下(A)和(B)：(A)缩合磷酸盐或聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物、(B)硫氰酸胍、Tris-HCl(pH 7至9)以及EDTA。
通过在含有(A)缩合磷酸盐或聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物和(B)硫氰酸胍、Tris-HCl(pH 7至9)以及EDTA的样本保存液中保存样本，可以在30℃以下的室温条件下将样本中含有的胆汁酸、酚类、吲哚类或有机酸稳定地保存至少2周。并且，由于也能够稳定地保存样本中含有的微生物群落结构，因此可以基于保存在同一样本保存液中的样本进行胆汁酸、酚类、吲哚类或有机酸等代谢物的分析和微生物群落结构的分析。另外，由于本发明的样本保存液的混合成分中不包含进行代谢物的分析和微生物群落结构的分析时的干扰物质，因此不需要进行预处理，分析和解析等的操作可以遵循一般方法步骤进行。另外，本说明书中的“室温”是指1℃至30℃(以日本药典为基准)。另外，本说明书中的“稳定地保存”是指，对保存期间前后的样本获取的分析值或解析值之间的差异保持在30％以内。
另外，优选地，本发明的样本保存液的缩合磷酸盐为5mM至150mM的焦磷酸钠。由此，选择作为缩合磷酸盐合适的化合物以及其保存液中的合适的浓度。
另外，优选地，本发明的样本保存液的聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物为0.2重量％至1.0重量％的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯。由此，选择作为聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物合适的化合物以及其保存液中的合适浓度。
另外，优选地，本发明的样本保存液是硫氰酸胍的浓度为0.1M至5M，Tris-HCl(pH7至9)的浓度为40mM至150mM，以及EDTA的浓度为1mM至50mM。由此，选择各成分合适的浓度。
另外，优选地，适用于本发明的样本保存液的样本是粪便。由此，选择作为样本合适的。
本发明的分析用装置具有保存样本的保存容器和上述的样本保存液，并被构成为，使样本以浸渍或悬浮在样本保存液中的状态保存在保存容器中。因此，由于样本以浸渍或悬浮在样本保存液中的状态保存在保存容器中，因此任何人都可以轻松完成从样本采集到保存/运输为止的方法步骤，可以在样本被稳定地保存的状态下进行分析和解析。
另外，优选地，本发明的分析用装置被构成为，相对于样本的样本保存液的量以容量比计为样本：样本保存液＝1：3以上。因此，选择对作为保存对象的样本应使用的样本保存液的量的合适的比率。
另外，本发明的分析方法包括：对样本添加上述样本保存液以保存样本的步骤、分析从至少保存7天后的样本中含有的由胆汁酸、酚类和吲哚类以及有机酸组成的组中选择的至少一种成分的步骤。由此，即使至少保存7天后，样本中含有的胆汁酸、酚类、吲哚类以及有机酸等代谢物的增减和变化也被抑制，从而能够进行高精度的分析。
发明效果
根据本发明，可以提供具有以下优异效果的样本保存液以及使用其的分析用装置和分析方法。
(1)可以在30℃以下的室温条件下将样本中含有的胆汁酸、酚类、吲哚类或有机酸稳定地保存至少2周。
(2)由于也能够稳定地保存样本中含有的微生物群落结构，因此可以通过分子生物学方法使用保存在同一样本保存液中的样本进行微生物群落结构的分析。
(3)由于不包含进行代谢物的分析和微生物群落结构的分析时的干扰物质，因此不需要进行预处理，可通过常规操作应用于分析或解析。
(4)通过使用具有保存样本的保存容器和样本保存液的分析用装置，可以在30℃以下的室温环境下稳定地保存和运输样本，因此可以容易地进行样本的分析或解析。另外，由于能够稳定地保存至少2周，因此也可以应对从远距离运输的样本的分析。
附图说明
图1是示出本发明的分析用装置的第一实施方式及其使用状态的主视图。
图2是示出本发明的分析用装置的第二实施方式的分解立体图(A)和主视图(B)。
图3是示出图2所示的第二实施方式的分析用装置的使用状态的主视图。
图4是示出实施例1中的在各样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存14天后(纵轴)的各样本悬浮液中含有的苯酚的浓度的图表。
图5是示出实施例2中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的苯酚的浓度的图表。
图6是示出实施例2中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的对甲酚的浓度的图表。
图7是示出实施例2中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的4-乙基苯酚的浓度的图表。
图8是示出实施例3中的在各样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存14天后(纵轴)的各样本悬浮液中含有的胆酸的浓度的图表。
图9是示出实施例3中的在各样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存14天后(纵轴)的各样本悬浮液中含有的鹅去氧胆酸的浓度的图表。
图10是示出实施例4中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的胆酸的浓度的图表。
图11是示出实施例4中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的鹅去氧胆酸的浓度的图表。
图12是示出实施例4中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的熊去氧胆酸的浓度的图表。
图13是示出实施例6中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的醋酸的浓度的图表。
图14是示出实施例6中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的丙酸的浓度的图表。
图15是示出实施例6中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的正丁酸的浓度的图表。
图16是示出实施例6中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的正戊酸的浓度的图表。
图17是示出实施例6中的在样本保存液中保存粪便样本前(横轴)和保存一定期间后(纵轴)的样本悬浮液中含有的异戊酸的浓度的图表。
图18是示出实施例7中的对在样本保存液中保存粪便样本前(0天生粪便/28天冷冻粪便)和保存一定期间后(14天/28天)的样本悬浮液中萃取的DNA进行的实时PCR的结果的图表。
图19是示出比较例3中的对在各样本保存液中保存粪便样本前(0天)和保存一定期间(3天/7天)后的各样本悬液中萃取的DNA进行的实时PCR的结果的图表。
具体实施方式
下面，详细说明本发明。本发明的样本保存液至少含有以下(A)成分和(B)成分群，(A)为缩合磷酸盐或聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物、(B)为硫氰酸胍、Tris-HCl(pH7至9)以及EDTA。另外，本发明的样本保存液的溶剂为水。
(A)成分为缩合磷酸酯或聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物，将所述(A)成分添加到后述的(B)成分群并混合时，胆汁酸、酚类、吲哚类或有机酸在30℃以下的室温条件下至少稳定地保存2周。因此，可以认为这些成分具有防止样本保存液中的胆汁酸、酚类、吲哚类或有机酸的氧化、分解或挥发等的作用。
作为(A)成分的缩合磷酸盐，可以列举焦磷酸盐、偏磷酸盐和多磷酸盐，具体地可以列举焦磷酸钠、焦磷酸钾、偏磷酸钠、偏磷酸钾、多磷酸钠和多磷酸钾。其中，从样本保存液中的胆汁酸、酚类、吲哚类或有机酸的保存效果优异的观点考虑，优选使用焦磷酸钠。作为混合在样本保存液的缩合磷酸盐的浓度，优选1mM至300mM，更优选5mM至150mM，特别优选10mM至100mM。
另一方面，作为(A)成分的聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物，优选使用具有水溶性的，具体地，可以列举聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(吐温20)、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯(吐温40)、聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯(吐温60)以及聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80)。其中，从样本保存液中的胆汁酸、酚类、吲哚类或有机酸的保存效果优异的观点考虑，特别优选使用聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(吐温20)。作为混合在样本保存液中的聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物的浓度，优选0.05重量％至3.0重量％，更优选0.1重量％至2.0重量％，特别优选0.2重量％至1.0重量％。
另外，(B)成分群为硫氰酸胍、Tris-HCl(pH7至9)以及EDTA，所述(A)成分群主要通过使样本中含有的微生物的细胞壁的蛋白质变性，具有抑制微生物的繁殖和活动，从而阻碍DNA的再合成/分解的作用。由此，能够维持样本中含有的微生物群落结构并能够稳定地保存。另外，由于微生物的繁殖和活动受到抑制，因此还具有抑制通过微生物的代谢物的产生和消耗的作用。
作为混合在样本保存液中的(B)成分群的硫氰酸胍的浓度，优选0.01M至5M，更优选0.1M至5mM，特别优选0.5M至4M。另外，作为混合在样本保存液中的Tris-HCl的浓度，优选10mM至300mM，更优选40mM至150mM，特别优选50mM至100mM。另外，对于Tris-HCl的pH，优选pH＝7至9的范围，更优选pH＝7.5至8.5，特别优选pH＝8.0。另外，作为混合在样本保存液中的EDTA的浓度，优选1mM至50mM，更优选10mM至50mM，特别优选30mM至50mM。
本发明的样本保存液在不损害本发明的作用效果的范围内也可以含有上述成分以外的其他成分。作为其他的成分，可以列举着色剂、香料、分散剂、保湿剂等。
本发明的样本保存液中保存的样本是来自生物体或来自环境的样本。作为来自生物体的样本，可以列举粪便、直肠拭子、尿液、鼻涕、痰、唾液、组织、血液或血清等。其中，即使粪便中含有大量的微生物和有机物，也可以通过本发明的样本保存液稳定地保存。另外，作为来自环境的样本，可以列举来自河流/湖泊与沼泽/海洋等的环境水、土壤、废水、污水处理中的生物处理池水/污泥等。
在本发明中，通过使用上述的样本保存液保存样本，样本中含有的量和内含物的变化被抑制的成分是胆汁酸、酚类、吲哚类以及有机酸。下面，详细说明这些成分。
胆汁酸是在生物体中由胆固醇生物合成的类固醇化合物。能够在本发明的样本保存液中稳定地保存的胆汁酸包括初级胆汁酸、次级胆汁酸以及这些的反应中间体、和与氨基酸结合的结合胆汁酸。作为胆汁酸的具体例子虽然没有特别限制，但可以列举胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、脱氢胆酸、异脱氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、葡糖石胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺石胆酸、牛磺熊去氧胆酸、α-鼠胆酸、β-鼠胆酸、ω-鼠胆酸、牛磺α-鼠胆酸、牛磺β-鼠胆酸以及7-氧代石胆酸等。
另外，作为能够在本发明的样本保存液中稳定地保存的酚类，可以列举通过在生物体内的肠道细菌的作用下由酪氨酸生成的酚类，虽然没有特别的限制，但可以列举例如苯酚、对甲酚、以及4-乙基苯酚等。同样地，作为能够在本发明的样本保存液中稳定地保存的吲哚类，可以列举通过生物体内的肠道细菌的作用由色氨酸生成的吲哚类，虽然没有特别的限制，但作为一个例子可以列举例如吲哚以及粪臭素等。
另外，作为能够在本发明的样本保存液中更稳定地保存的有机酸，主要可以列举通过在生物体内的肠道细菌的作用产生的短链脂肪酸，但也广泛地包括除短链脂肪酸以外的其他的羧酸类。作为一个例子，可以列举醋酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、己酸、甲酸、琥珀酸以及乳酸等。
本发明的样本保存液通过将待保存的样本浸渍或悬浮并保存来使用。由此，可以在30℃以下的室温条件下将代谢物稳定地保存至少2周。使用的样本保存液的量以容量比计，优选样本：样本保存液＝1:3以上，更优选样本：样本保存液＝1:4以上，特别优选样本：样本保存液＝1:5以上。
此外，本发明的样本保存液不仅稳定地保存上述的胆汁酸等的代谢物，还可以抑制样本中含有的微生物群落结构的变化。因此，可以使用实时PCR分析、通过下一代测序仪的宏基因组分析、T-RFLP分析和DG GE分析等的微生物群落结构分析以及作为进行生物培养菌株的DNA碱基序列分析和菌株鉴定的DNA多态性分析方法的RAPD分析、微卫星分析等的利用DNA的各种分子生物学方法。通过这种方式，由于可以使用保存在样本保存液中的同一样本进行代谢物的分析和微生物群落结构的分析，在使样本的保存/运输省事且简便的同时，能够可靠地进行对同一样本的分析和解析，因此可以进行综合性且多方面的评估。
作为使用本发明的样本保存液保存样本时的保存温度，为1℃至30℃的室温环境下，但是本发明的样本保存液即使在10℃至30℃的温度范围、15℃至30℃的温度范围、20℃至30℃的温度范围或25℃至30℃的温度范围中也能够稳定地保存代谢物和微生物群落结构。
下面，将参考图1至图3对具有上述的样本保存液和保存样本的保存容器的分析用装置进行详细的说明。
首先，对图1所示的第一实施方式的分析用装置1进行说明。本实施方式的分析用装置1包括：一端开口的有底圆筒形的保存容器3、收纳在该保存容器3中的本发明的样本保存液S、密封保存容器3的开口部的盖构件2以及用于采集样本的样本采集构件4。样本采集构件4具有形成在其前端并能够舀取一定量的样本并保持的勺状的采集部42和延伸至另一端侧的轴部41。轴部41的前端侧连接至盖构件2的背面，形成为能够通过握住盖构件2来操作样本采集构件4。另外，样本采集构件4的采集部42设有贯穿其底面的2个孔43。设置在该采集部42的孔43是为了在保存容器3中使样本保存液S通过该孔43与保持在采集部42中的样本C接触，并使样本保存液S流入至采集部42的底面。由此，保持在收集部42中的样本C从采集部42的底面远离并移动到样本保存液S中，由于样本C分散、悬浮在样本保存液S中，能够使样本C与本发明的样本保存液S可靠地接触的状态下被保存。另外，在本实施方式中，在采集部42的底面设置2个孔43，但其数量没有特别的限制，另外，也可以是不设置孔43的结构。
在如图1所示的被使用的状态下，样本保存液S以到样本采集构件4的采集部42完全被浸没的位置为止被收纳在保存容器3中。样本保存液S被收纳在保存容器3中，以容量比计，其量为使样本C：样本保存液S＝1:3以上，更优选样本C：样本保存液S＝1:4以上，特别优选样本C：样本保存液S＝1:5以上。在本实施方式中，作为一例，样本采集构件4的采集部42的容量为1mL时，收纳5mL的样本保存液S。
图1所示的分析用装置1的使用方法如下。首先，在打开分析用装置1的盖构件2后，握住盖构件2操作样本采集构件4，将样本C采集到采集部42。将该样本采集构件4放入保存容器3的内部，将保持样本C的采集部42浸渍在保存容器3中的样本保存液S中，用盖构件2密封保存容器3。由此，样本C以浸渍、悬浮在样本保存液S中的状态被保存在分析用装置1中。保存后每个分析用装置1都可以在室温下保存和运输。
然后，对图2、3所示的第二实施方式的分析用装置10进行说明。本实施方式的分析用装置10包括：一端开口的有底圆筒形的保存容器3、密封保存容器3的开口部的盖构件20、收纳在该盖构件20内的收纳空间内的本发明的样本保存液S、能够使该盖构件20内的收纳空间与保存容器3连通以使样本保存液S向保存容器3移动的按压构件5、以及用于采集样本的样本采集构件4。样本采集构件4包括：形成在其前端使得能够舀取并保持一定量的样本的勺状的采集部42和延伸至另一端侧的轴部41。轴部41的前端侧连接至按压构件5的内部，被形成为能够通过握住按压构件5的外周面来操作样本采集构件4。另外，样本采集构件4的采集部42设有贯穿其底面的2个孔43。对于该孔43的功能以及作用，与上述的第一实施方式相同。
另外，如图2所示，安装在盖构件20和保存容器3之间的按压构件5的与盖构件20相向的一侧设置有按压销5a。另一方面，在盖构件20的收纳空间的底部具有被形成为通过被按压销5a按压而可破裂的薄壁部(未图示)，被形成为当用盖构件20密封保存容器3时，按压构件5的按压销5a挤压盖构件20的底部使该底部破裂，以使收纳空间中的样本保存液S从破裂的部分漏出。从盖构件20中的收纳空间中漏出的样本保存液S通过按压构件5的间隙流入至保存容器3。由此，通过做成样本保存液S不预先收纳在保存容器3中的结构，可以杜绝从保存容器3取入和取出样本采集构件4时有可能意外洒出或丢失样本保存液S的风险，因此可以将采集到的样本C可靠地保存在预定量的样本保存液S中。另外，由于能够使样本保存液S的量保持恒定，因此通过测定分析用装置10的重量，能够准确地计算出保存在保存容器3中的样本C的重量，可以更准确地获得作为分析对象的代谢物的浓度。
在如图3所示的被使用的状态下，仅将样本采集构件4的采集部42完全被浸没的位置的量的样本保存液S收纳在盖构件20中的收纳空间内。样本保存液S被收纳在保存容器3中，优选地其量以容量比计为使样本C：样本保存液S＝1:3以上，更优选样本C：样本保存液S＝1:4以上，特别优选样本C：样本保存液S＝1:5以上。在本实施方式中，作为一例，样本采集构件4的采集部42的容量为1mL时，在盖构件20中收纳5mL的样本保存液S。
图2和图3所示的分析用装置10的使用方法如下。首先，在打开分析用装置10的盖构件20后，握住按压构件5的外周面来操作样本采集构件4，将样本C采集到采集部42。将该样本采集构件4放入保存容器3的内部(此时，样本保存液S尚未进入保存容器3中)，在保存容器3的开口部侧嵌入按压构件5。另外，盖上盖构件20以覆盖按压构件5，并用盖构件20密封保存容器3。此时，由于按压构件5的按压销5a按压盖构件20的底部，因此盖构件20的底部破裂，样本保存液S从盖构件20的底部漏出并通过挤压构件5流入至保存容器3。由此，保持有样本C的采集部42浸渍在保存容器3中的样本保存液S中，样本C以浸渍、悬浮在样本保存液S中的状态被保存在分析用装置10中。保存后每个分析用装置10可以在室温下保存和运输。
接下来，通过实施例更详细地说明本发明，但是本发明不被这些实施例所限制。
实施例
实施例1
1.粪便样本中含有的酚类的分析(1)
对于粪便样本，使用采集后立即在-80℃的超低温冷冻室中冷冻保存的样本，使用了从3名受试者获取的粪便样本A至C。取解冻后的粪便样本1g，分别悬浮于3种类型的样本保存液5mL中，在30℃的恒温槽中保存14天。作为3种类型的样本保存液，使用了含有0.5重量％吐温20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)、4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl、40mM EDTA(pH 8.0)以及水的“0.5％吐温20/4M GTC溶液”、含有10mM焦磷酸钠、4M硫氰酸胍、100mMTris-HCl、40mM EDTA(pH8.0)以及水的“10mM焦磷酸钠/4M GTC溶液”、含有4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl、40mM EDTA(pH 8.0)以及水的“4M GTC溶液”。对于在30℃保存前的样本悬浮液(0天)和保存后的样本悬浮液(14天)，通过以下所示的方法测定了苯酚、对甲酚以及4-乙基苯酚各自的浓度。精确称取一定量的样本悬浮液到离心管中，添加含有内标物质(4-异丙基苯酚)的磷酸盐缓冲液并混合。将其在85℃热处理15分钟，冷却后进行了溶剂萃取。将该粗提取液用固相萃取柱纯化，将得到的提取液作为测定试样。对于该测定试样，通过气相色谱法-质谱法-选择离子检测法(GC-MMS-SIM)测定了苯酚、对甲酚以及4-乙基苯酚各自的浓度。结果示于下表1和图4中。另外，粪便样本B中未检测到4-乙基苯酚。
表1
在表1中，上栏示出各测定对象物质的浓度，下栏示出相对于保存前的浓度(0天的浓度)的比值(％)。根据该结果，发现通过使用除了4M GTC溶液之外还混合有焦磷酸钠或吐温20的样本保存液，即使在30℃经过14天之后，也能够稳定地保持各粪便样本中的酚类化合物。并且，在图4中示出了各样本保存液的回归直线，其中横轴绘制了保存前的各粪便样本的苯酚的浓度(0天的浓度)，纵轴绘制了14天后各粪便样本的苯酚的浓度。根据该图表，发现除了4M GTC溶液之外还混合有焦磷酸钠或吐温20的样本保存液的回归方程的斜率变大(接近1)，即使在30℃保存14天之后各粪便样本中的酚类的浓度没有发生明显变化，能够定量酚类。
实施例2
2.粪便样本中含有的酚类的分析(2)
对于粪便样本，使用采集后立即在-80℃的超低温冷冻室中短期冷冻保存的样本，对从-80℃中冷冻保存开始1周以内的粪便样本进行了该试验。对于粪便样本，使用了从6名受试者获取的No.1-1至No.1-6。取解冻后的粪便样本1g，使其悬浮在含有100mM焦磷酸钠、4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl、40mM EDTA(pH 8.0)以及水的样本保存液5mL中，在30℃的恒温槽中保存。对于在30℃保存前(0天生粪便)、保存7天后(7天)、保存14天后(14天)、保存28天后(28天)的样本悬浮液，通过与实施例1相同的方法测定了苯酚、对甲酚以及4-乙基苯酚各自的浓度。另外，将剩余的各粪便样本再次在-80℃冷冻，并在-80℃原样保存28天后解冻，并以与上述的方法相同地使其悬浮在样本保存液中。对于该样本悬浮液(28天冷冻粪便)，测定了苯酚、对甲酚以及4-乙基苯酚各自的浓度。对于苯酚的结果示于表2和图5，对于对甲酚的结果示于表3和图6，对于4-乙基苯酚的结果示于表4和图7。另外，粪便样本No.1-3、No.1-5、6中未检测到4-乙基苯酚。
表2
| 苯酚(ug/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.1-1 | 5.00 | 5.31 | 4.04 | 5.23 | 4.44 |
| No.1-2 | 11.01 | 11.69 | 8.21 | 10.33 | 11.24 |
| No.1-3 | 7.65 | 9.17 | 6.31 | 7.49 | 8.13 |
| No.1-4 | 7.30 | 5.23 | 5.45 | 5.01 | 6.92 |
| No.1-5 | 1.76 | 1.53 | 2.03 | 1.78 | 1.37 |
| No.1-6 | 11.43 | 7.86 | 9.80 | 7.01 | 8.74 |
表3
| 对甲酚(ug/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.1-1 | 18.69 | 16.17 | 12.31 | 13.53 | 20.84 |
| No.1-2 | 32.51 | 29.90 | 24.35 | 28.10 | 34.51 |
| No.1-3 | 88.70 | 92.41 | 66.93 | 63.38 | 75.14 |
| No.1-4 | 139.71 | 106.11 | 112.28 | 104.85 | 120.03 |
| No.1-5 | 106.36 | 87.89 | 100.20 | 77.13 | 99.65 |
| No.1-6 | 1.38 | 0.87 | 1.03 | 1.17 | 1.51 |
表4
| 4-乙基苯酚(ug/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.1-1 | 20.93 | 18.62 | 16.23 | 16.63 | 16.92 |
| No.1-2 | 0.48 | 0.45 | 0.41 | 0.50 | 0.48 |
| No.1-4 | 6.37 | 4.77 | 4.62 | 4.84 | 6.96 |
表2至4中示出测定时刻的各测定对象物质的浓度。图5-7示出了基于该结果求出回归直线的图表，其中在横轴绘制了30℃保存前(0天生粪便)的各粪便样本的各测定对象物质的浓度，在纵轴绘制了各粪便样本的各测定时刻的各测定对象物质的浓度。根据这些图表，使用本发明的样本保存液(100mM焦磷酸钠+4M GTC溶液)在30℃保存的样本与在-80℃原样保存的粪便样本(28天(冷冻粪便))相比，没有发现浓度有明显变化，由此可知能够在30℃稳定地长期保存28天。具体地，根据图5，对于苯酚，发现在30℃保存7天时(回归方程的斜率：0.84)与在-80℃保存28天时(回归方程的斜率：0.90)显示相似的分析值，保存14天或28天时，虽然分析值具有变得略小的倾向，但回归方程的斜率停留到0.7左右。另外，根据图6，对于对甲酚，发现在30℃条件下保存14天时(回归方程的斜率：0.80至0.85)与在-80℃保存28天时(回归方程的斜率：0.85)显示相似的分析值，保存28天时，虽然分析值具有变得略小的倾向，但回归方程的斜率停留到0.7左右。另外，根据图7，对于4-乙基苯酚，发现在30℃条件下保存28天时(回归方程的斜率：0.78至0.90)与在-80℃保存28天时(回归方程的斜率：0.78)显示相似的分析值。
比较例1
3.粪便样本中含有的酚类的分析(3)
对于粪便样本，使用采集后立即在-80℃的超低温冷冻室中冷冻保存的样本，使用了从3名受试者获取的粪便样本1至3。取解冻后的粪便样本1g，分别悬浮于4种类型的样本保存液5mL中，在30℃恒温槽中保存7天。作为4种类型的样本保存液使用了含有20mM的焦磷酸钠和水的“20mM焦磷酸钠”、含有50mM的焦磷酸钠和水的“50mM焦磷酸钠”、含有100mM的焦磷酸钠和水的“100mM焦磷酸钠”、含有4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl、40mM EDTA(pH 8.0)和水的“4M GTC溶液”。对于在30℃保存前的样本悬浮液(0天)和保存后的样本悬浮液(7天)，与实施例1相同的方法测定了苯酚、对甲酚以及4-乙基苯酚各自的浓度。由于粪便样本1至3中未检测到4-乙基苯酚，因此苯酚和对甲酚的测定结果示于下表5。
表5
在表5中，上栏示出各测定对象物质的浓度，下栏示出相对于保存前的浓度(0天的浓度)的比值(％)。由该结果发现，当使用仅包含焦磷酸钠的样本保存液时，各粪便样本中的酚类化合物的浓度与保存前相比有明显变化。由于具有混合的焦磷酸钠的浓度越高浓度变化的程度就越大的倾向，因此推测焦磷酸钠可能会促进粪便样本中含有的微生物的生长。然而，在实施例1、2中证明，通过组合焦磷酸钠与含有4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl以及40mM EDTA(pH 8.0)的“4M GTC溶液”，可以获得即使在30℃条件下也能够稳定地保存有机酸类的样本保存液。
实施例3
4.粪便样本中含有的胆汁酸的分析(1)
(实验方法)
对于粪便样本，使用采集后立即在-80℃的超低温冷冻室中冷冻保存的样本，使用从4名受试者获取的粪便样本A至D。取解冻后的粪便样本1g，分别悬浮于3种类型的样本保存液5mL中，在30℃恒温槽中保存14天。作为3种类型的样本保存液，使用了与实施例1记载的相同的样本保存液。对于在30℃保存前的样本悬浮液(0天)和保存后的样本悬浮液(14天)，基于柿山等人的分析方法(Kaki yama G,Muto A,Takei H,Nittono H,Murai T etal.,A simple and accurate HPLC method for fecal bile acid profile in healthyand cirrhotic subjects:validation by GC-MS and LC-MS,J Lipid Res.,2014,Vol.55,pp.978-990)进行了胆酸、鹅去氧胆酸以及熊去氧胆酸各自的浓度的测定。另外，对试样的预处理方法做了如下的修改。精确称取一定量的样本悬浮液到研磨管(bead tube)中，加入9倍量的醋酸钠缓冲液/乙醇混合溶液，破碎样本悬浮液。将其在85℃热处理30分钟，冷却后以18,400×g进行10分钟的离心分离处理。回收上清液，用超纯水稀释4倍，用固相萃取柱(Bond Elut C18萃取柱，安捷伦科技有限公司产品)进行了固相萃取。将得到的提取液干燥之后，溶解于50％乙醇中，并在通过孔径为0.2μm的亲水性PTFE过滤器过滤后加入内标溶液作为测定试样溶液。使用液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪(LC-QTOF/MS)对该测定样本溶液测定胆酸、鹅去氧胆酸以及熊去氧胆酸各自的浓度。结果示于下表6以及图8、9中。另外，在粪便样本A和C中未检测到熊去氧胆酸。
表6
在表6中，上栏示出各测定对象物质的浓度，下栏示出相对于保存前的浓度(0天的浓度)的比值(％)。根据该结果，发现通过使用除了4M GTC溶液之外还混合有焦磷酸钠或吐温20的样本保存液，即使在30℃下经过14天之后，也能够稳定地保持各粪便样本中的胆酸、鹅去氧胆酸以及熊去氧胆酸等的胆汁酸化合物。另外，在图8、9中示出了各样本保存液的回归直线，其中横轴绘制了保存前的各粪便样本的胆酸或鹅去氧胆酸的浓度(0天的浓度)，纵轴绘制了14天后的各粪便样本的胆酸或鹅去氧胆酸的浓度。根据该图表，发现除了4M GTC溶液之外还混合有焦磷酸钠或吐温20的样本保存液的回归方程的斜率变大(接近1)，即使在30℃保存14天之后各粪便样本中的胆汁酸的浓度也没有发生明显变化，能够定量胆汁酸。
实施例4
5.粪便样本中含有的胆汁酸的分析(2)
对于粪便样本，使用采集后立即在-80℃的超低温冷冻室中短期冷冻保存的样本，对从-80℃中冷冻保存开始1周以内的粪便样本进行了该试验。对于粪便样本，使用了从不同的6名受试者获取的No.2-1至No.2-5。取解冻后的粪便样本1g，使其悬浮在含有100mM焦磷酸钠、4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl、40mM EDTA(pH 8.0)以及水的样本保存液5mL中，在30℃的恒温槽中保存。对于在30℃保存前(0天生粪便)、保存7天后(7天)、保存14天后(14天)、保存28天后(28天)的样本悬浮液，通过与实施例3相同的方法测定了胆酸、鹅去氧胆酸以及熊去氧胆酸各自的浓度。另外，将剩余的各粪便样本再次在-80℃下冷冻，并在-80℃原样保存28天后解冻，并以与上述的方法相同地使其悬浮在样本保存液中。对该样本悬浮液(28天冷冻粪便)测定了胆酸、鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸各自的浓度。对于胆酸的结果示于表7和图10，对于鹅去氧胆酸的结果示于表8和图11，对于熊去氧胆酸的结果示于表9和图12。另外，由于在粪便样本No.2-5中未检测到熊去氧胆酸，因此对从不同的受试者获取的粪便样本No.2-6进行了相同的试验。
表7
| 胆酸(umol/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.2-1 | 0.70 | 0.57 | 0.64 | 0.59 | 0.64 |
| No.2-2 | 2.07 | 2.06 | 2.04 | 1.71 | 2.01 |
| No.2-3 | 1.90 | 1.89 | 1.79 | 1.62 | 1.74 |
| N0.2-4 | 0.51 | 0.41 | 0.38 | 0.42 | 0.46 |
| No.2-5 | 0.11 | 0.10 | 0.10 | 0.15 | 0.10 |
表8
| 鹅去氧胆酸(umol/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.2-1 | 0.53 | 0.45 | 0.52 | 0.42 | 0.55 |
| No.2-2 | 0.88 | 0.67 | 0.76 | 0.56 | 0.81 |
| No.2-3 | 0.92 | 0.70 | 0.71 | 0.58 | 0.70 |
| No.2-4 | 0.41 | 0.38 | 0.41 | 0.32 | 0.38 |
| No.2-5 | 0.11 | 0.15 | 0.16 | 0.14 | 0.10 |
表9
| 熊去氧胆酸(umol/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.2-1 | 0.18 | 0.15 | 0.16 | 0.19 | 0.14 |
| No.2-2 | 1.18 | 1.05 | 1.07 | 0.82 | 1.07 |
| No.2-3 | 0.28 | 0.26 | 0.25 | 0.25 | 0.23 |
| No.2-4 | 0.32 | 0.32 | 0.31 | 0.28 | 0.29 |
| No.2-6 | 0.19 | 0.19 | 0.16 | 0.19 | 0.17 |
表7-9示出测定时刻的各测定对象物质的浓度。图10-12示出了基于该结果求出回归直线的图表，其中在横轴绘制了在30℃保存前(0天生粪便)的各粪便样本的各测定对象物质的浓度，在纵轴绘制了各粪便样本的各测定时刻的各测定对象物质的浓度。根据这些图表，使用本发明的样本保存液(100mM焦磷酸钠+4M GTC溶液)在30℃保存的样本与在-80℃原样保存的样本(28天(冷冻粪便))相比，没有发现浓度有明显变化，由此可知能够在30℃稳定地长期保存28天。具体地，根据图10，对于胆酸，发现在30℃保存14天时(回归方程的斜率：0.99)与在-80℃保存28天时(回归方程的斜率：0.96)显示相似的分析值，即使在30℃保存28天时(回归方程的斜率：0.96)回归公式的斜率停留到0.82。另外，根据图11，发现鹅去氧胆酸在30℃条件下保存14天时(回归方程的斜率：0.67至0.71)与在-80℃保存28天时(回归方程的斜率：0.8)得到相似的分析值。另外，根据图12，对于熊去氧胆酸，发现在30℃条件下保存14天时(回归方程的斜率：0.88至0.91)与在-80℃保存28天时(回归方程的斜率：0.93)得到相似的分析值。
实施例5
6.粪便样本中含有的有机酸的分析(1)
对于粪便样本，使用采集后立即在-80℃的超低温冷冻室中冷冻保存的样本，使用从3名受试者获取的粪便样本A至C。取解冻后的粪便样本1g，分别悬浮于3种类型的样本保存液5mL中，在30℃恒温槽中保存14天。作为3种类型的样本保存液，使用了与实施例1记载的相同的样本保存液。对于在30℃保存前的样本悬浮液(0天)和保存后的样本悬浮液(14天)，通过以下所示的方法测定了醋酸、丙酸以及正丁酸各自的浓度。精确称取一定量的样本悬浮液至研磨管中，加入提取液并混合。将其在85℃热处理15分钟，冷却后用珠破碎样本悬浮液，以18,400×g进行10分钟的离心分离处理。回收上清液，用孔径为0.20μm的薄膜过滤器过滤后，作为测定试料溶液。对于该测定试样溶液，通过高效液体色谱装置(株式会社岛津制作所产品、有机酸分析系统)测定了醋酸、丙酸和正丁酸各自的浓度。
表10
在表10中，上栏示出各测定对象物质的浓度，下栏示出相对于保存前的浓度(0天的浓度)的比值(％)。根据该结果，发现通过使用除了4M GTC溶液之外还混合有焦磷酸钠或吐温20的样本保存液，即使在30℃下经过14天之后，也能够稳定地保持各粪便样本中的有机酸类化合物。
实施例6
7.粪便样本中含有的有机酸的分析(2)
对于粪便样本，使用采集后立即在-80℃的超低温冷冻室中短期冷冻保存的样本，对从-80℃中冷冻保存开始1周以内的粪便样本进行了该试验。对于粪便样本，使用了从14名受试者获取的No.3-1至No.3-14。取解冻后的粪便样本1g，使其悬浮在含有100mM焦磷酸钠、4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl、40mM EDTA(pH 8.0)以及水的样本保存液5mL中，保存在30℃的恒温槽中。对于在30℃下保存前(0天生粪便)、保存7天后(7天)、保存14天后(14天)、保存28天后(28天)的样本悬浮液，通过与实施例5相同的方法使用HPLC测定了醋酸、丙酸、正丁酸、正戊酸以及异戊酸各自的浓度。另外，将剩余的各粪便样本再次在-80℃冷冻，在-80℃原样保存28天后解冻，并以与上述的方法相同地使其悬浮在样本保存液中。对该样本悬浮液(28天冷冻粪便)，测定了醋酸、丙酸、正丁酸、正戊酸以及异戊酸各自的浓度。对于醋酸的结果示于表11和图13，对于丙酸的结果示于表12和图14，对于正丁酸的结果示于表13和图15，对于正戊酸的结果示于表14和图16，对于异戊酸的结果示于表15和图17。另外，在粪便样本No.3-10至14中未检测到正丁酸和正戊酸，在粪便样本No.3-3、11、13、14中未检测到异戊酸。
表11
| 醋酸(mg/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.3-1 | 2.14 | 2.41 | 2.60 | 2.57 | 2.16 |
| No.3-2 | 3.03 | 3.01 | 3.09 | 3.10 | 2.96 |
| No.3-3 | 4.78 | 4.63 | 4.69 | 4.78 | 5.12 |
| No.3-4 | 3.69 | 3.68 | 3.82 | 3.83 | 3.76 |
| No.3-5 | 2.90 | 3.06 | 3.23 | 3.25 | 3.30 |
| No.3-6 | 2.51 | 2.57 | 2.67 | 2.95 | 2.62 |
| No.3-7 | 3.71 | 3.43 | 3.45 | 3.56 | 3.76 |
| No.3-8 | 3.73 | 3.67 | 3.94 | 3.91 | 3.83 |
| No.3-9 | 3.04 | 2.97 | 3.12 | 3.27 | 2.97 |
| No.3-10 | 2.54 | 2.66 | 2.65 | 2.79 | 2.74 |
| No.3-11 | 2.05 | 2.04 | 2.32 | 2.44 | 1.78 |
| No.3-12 | 1.18 | 1.29 | 1.46 | 1.79 | 1.40 |
| No.3-13 | 3.24 | 3.25 | 3.41 | 3.47 | 3.18 |
| No.3-14 | 5.12 | 5.13 | 5.57 | 5.55 | 5.22 |
表12
| 丙酸(mg/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.3-1 | 1.12 | 1.14 | 1.20 | 1.12 | 1.13 |
| No.3-2 | 2.18 | 2.10 | 2.12 | 2.09 | 2.11 |
| No.3-3 | 1.34 | 1.27 | 1.27 | 1.32 | 1.34 |
| No.3-4 | 1.83 | 1.77 | 1.80 | 1.75 | 1.83 |
| No.3-5 | 1.25 | 1.31 | 1.32 | 1.31 | 1.33 |
| No.3-6 | 1.70 | 1.65 | 1.66 | 1.77 | 1.74 |
| No.3-7 | 1.19 | 1.12 | 1.14 | 1.15 | 1.13 |
| No.3-8 | 1.14 | 1.09 | 1.19 | 1.16 | 1.14 |
| No.3-9 | 1.83 | 1.70 | 1.71 | 1.74 | 1.77 |
| No.3-10 | 1.06 | 1.06 | 0.95 | 0.99 | 1.03 |
| No.3-11 | 1.33 | 1.10 | 1.15 | 1.10 | 1.10 |
| No.3-12 | 0.80 | 0.79 | 0.87 | 0.79 | 0.78 |
| No.3-13 | 1.25 | 1.21 | 1.26 | 1.27 | 1.20 |
| No.3-14 | 1.42 | 1.39 | 1.50 | 1.49 | 1.45 |
表13
| 正丁酸(mg/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.3-1 | 1.11 | 1.12 | 1.18 | 1.07 | 1.07 |
| No.3-2 | 1.12 | 1.06 | 1.07 | 1.03 | 1.05 |
| No.3-3 | 2.00 | 1.94 | 1.93 | 1.93 | 2.02 |
| No.3-4 | 1.35 | 1.29 | 1.29 | 1.22 | 1.33 |
| No.3-5 | 1.50 | 1.58 | 1.59 | 1.54 | 1.61 |
| No.3-6 | 0.85 | 0.81 | 0.82 | 0.80 | 0.83 |
| No.3-7 | 1.26 | 1.19 | 1.16 | 1.16 | 1.18 |
| No.3-8 | 1.32 | 1.23 | 1.36 | 1.30 | 1.30 |
| No.3-9 | 0.76 | 0.70 | 0.69 | 0.63 | 0.75 |
表14
| 正戊酸(mg/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.3-1 | 0.24 | 0.23 | 0.24 | 0.20 | 0.23 |
| No.3-2 | 0.15 | 0.14 | 0.15 | 0.11 | 0.15 |
| No.3-3 | 0.16 | 0.16 | 0.14 | 0.15 | 0.16 |
| No.3-4 | 0.34 | 0.32 | 0.33 | 0.27 | 0.33 |
| No.3-5 | 0.22 | 0.21 | 0.23 | 0.19 | 0.22 |
| No.3-6 | 0.20 | 0.17 | 0.16 | 0.18 | 0.19 |
| No.3-7 | 0.32 | 0.30 | 0.29 | 0.29 | 0.28 |
| No.3-8 | 0.13 | 0.13 | 0.13 | 0.13 | 0.14 |
| No.3-9 | 0.23 | 0.22 | 0.20 | 0.20 | 0.22 |
表15
| 异戊酸(mg/g) | 0天(生粪便) | 7天 | 14天 | 28天 | 28天(冷冻粪便) |
| No.3-1 | 0.41 | 0.42 | 0.47 | 0.39 | 0.41 |
| No.3-2 | 0.14 | 0.14 | 0.12 | 0.12 | 0.13 |
| No.3-4 | 0.14 | 0.13 | 0.14 | 0.13 | 0.15 |
| No.3-5 | 0.30 | 0.29 | 0.32 | 0.25 | 0.31 |
| No.3-6 | 0.23 | 0.22 | 0.24 | 0.20 | 0.21 |
| No.3-7 | 0.19 | 0.18 | 0.17 | 0.16 | 0.17 |
| No.3-8 | 0.12 | 0.12 | 0.13 | 0.13 | 0.14 |
| No.3-9 | 0.24 | 0.22 | 0.19 | 0.21 | 0.21 |
| No.3-10 | 0.43 | 0.42 | 0.36 | 0.36 | 0.41 |
| No.3-12 | 0.28 | 0.26 | 0.26 | 0.23 | 0.26 |
表11至15示出测定时刻的各测定对象物质的浓度。图13至17示出了基于该结果求出回归直线的图表，其中在横轴绘制了在30℃保存前(0天生粪便)的各粪便样本的各测定对象物质的浓度，在纵轴绘制了各粪便样本的各测定时刻的各测定对象物质的浓度。根据这些图表，使用本发明的样本保存液(100mM焦磷酸钠+4M GTC溶液)在30℃保存的样本与在-80℃下原样保存的样本(28天(冷冻粪便))相比，没有发现浓度有明显变化，由此可知能够在30℃稳定地长期保存28天。具体地，根据图13，对于醋酸，发现在30℃条件下保存28天时(回归方程的斜率：0.89至0.95)与在-80℃下保存28天时(回归方程的斜率：1.0)得到相似的分析值。另外，根据图14，对于丙酸，发现在30℃条件下保存28天时(回归方程的斜率：0.92至0.95)与在-80℃下保存28天时(回归方程的斜率：0.99)得到相似的分析值。同样地，根据图15，对于正丁酸，也发现在30℃条件下保存28天时(回归方程的斜率：1.00至1.04)与在-80℃下保存28天时(回归方程的斜率：1.06)得到相似的分析值。另外，根据图16，对于正戊酸，发现在30℃条件下保存28天时(回归方程的斜率：0.81至0.95)与在-80℃下保存28天时(回归方程的斜率：0.85)得到相似的分析值。另外，根据图17，对于异戊酸，发现在30℃条件下保存14天时(回归方程的斜率：0.86至1.02)与在-80℃下保存28天时(回归方程的斜率：0.98)得到相似的分析值。
比较例2
8.粪便样本中含有的有机酸的分析(3)
对于粪便样本，使用采集后立即在-80℃的超低温冷冻室中冷冻保存的样本，使用了从3名受试者获取的粪便样本1至3。取解冻后的粪便样本1g，分别悬浮于4种类型的样本保存液5mL中，在30℃恒温槽中保存7天。作为4种类型的样本保存液，使用了含有20mM的焦磷酸钠和水的“20mM焦磷酸钠”、含有50mM的焦磷酸钠和水的“50mM焦磷酸钠”、含有100mM的焦磷酸钠和水的“100mM焦磷酸钠”、含有4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl、40mM EDTA(pH 8.0)和水的“4M GTC溶液”。对于在30℃保存前的样本悬浮液(0天)和保存后的样本悬浮液(7天)，通过与实施例5相同的方法测定了醋酸、丙酸、正丁酸以及异戊酸各自的浓度。结果示于下表16中。
表16
在表16中，上栏示出各测定对象物质的浓度，下栏示出相对于保存前的浓度(0天的浓度)的比值(％)。由该结果发现，当使用仅含有焦磷酸钠的样本保存液时，各粪便样本中的有机酸类的浓度与保存前相比有明显变化。然而，在实施例5、6中证明，通过组合焦磷酸钠与含有4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl以及40mM EDTA(pH 8.0)的“4M GTC溶液”，可以获得即使在30℃条件下也能够稳定地保存有机酸类的样本保存液。
实施例7
9.粪便样本中含有的微生物数的分析(1)
对于粪便样本，使用采集后立即在-80℃的超低温冷冻室中短期冷冻保存的样本，对从-80℃中冷冻保存开始1周以内的粪便样本进行了该试验。对于粪便样本，使用了从19名不同的受试者获取的19样本。取解冻后的粪便样本1g，使其悬浮在含有100mM焦磷酸钠、4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl、40mM EDTA(pH 8.0)以及水的样本保存液5mL中，保存在30℃的恒温槽中。从在30℃保存前(0天生粪便)、保存14天后(14天)、保存28天后(28天)的样本悬浮液中分别萃取DNA。对萃取的DNA进行实时PCR，以求得试样1g中包含的全部真细菌的目标基因(16S rRNA)的拷贝数。用于实时PCR的全部真细菌的拷贝数定量用的引物组序列为“341F：5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'”、“534R：5'-ATTACCGCGGCTGCG-3'”。实时PCR是使用实时PCR装置(Rotor-Gene Q，株式会社QIAGE N产品)和实时PCR用试剂(TB Green Premix ExTaq II(Tli RNa seH Plus)，Takara Bio株式会社产品)进行的。结果示于图18。
在图18中，纵轴示出每1g试样的全部真细菌的拷贝数。根据这些图表，使用本发明的样本保存液(100mM焦磷酸钠+4M GTC溶液)在30℃保存的粪便样本与保存前的粪便样本(0天(生粪便))相比，没有发现其拷贝数有明显变化，能够在30℃稳定地长期保存28天。另外，对于将剩余的各粪便样本再次在-80℃冷冻、在-80℃原样保存28天后解冻、并以与上述的方法相同地使其悬浮在样本保存液中获得的样本(28天(冷冻粪便))，发现拷贝数略有减少。
比较例3
10.粪便样本中含有的微生物数的分析(2)
对于粪便样本，使用采集后立即在-80℃的超低温冷冻室中冷冻保存的样本，使用了从5名受试者获取的粪便样本。取解冻后的粪便样本1g，分别悬浮于4种类型的样本保存液5mL中，在30℃恒温槽中保存7天。作为4种类型的样本保存液，使用含有20mM的焦磷酸钠和水的“20mM焦磷酸钠”、含有50mM的焦磷酸钠和水的“50mM焦磷酸钠”、含有100mM的焦磷酸钠和水的“100mM焦磷酸钠”、含有4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl、40mM EDTA(pH 8.0)和水的“4M GTC溶液”。对在30℃保存之前的样本悬浮液(0天)和保存后的样本悬浮液(保存第3天和第7天)，分别萃取DNA。对萃取的DNA进行实时PCR，以与实施例7相同的方法测定试样1g中包含的全部真细菌的目标基因(16S rRNA)的拷贝数。对于得到的定量结果，以在30℃保存前的样本悬浮液(0天)为基准(数值1.0)，求出经过各保存日的变化比率。结果示于图19。
在图19中，纵轴示出以从样本悬浮液(保存0天)求出的目标基因的拷贝数作为基准(基准值1)时的比率。由该结果发现，当使用仅含有焦磷酸钠的样本保存液时，目标基因的拷贝数与保存前有明显的增减。由于具有混合的焦磷酸钠的浓度越高比率的变化的程度就越大的倾向，因此推测焦磷酸钠有可能促进了粪便样本中含有的微生物的生长和作用。然而，在实施例7中证明，通过组合焦磷酸钠与含有4M硫氰酸胍、100mM Tris-HCl以及40mMEDTA(pH 8.0)的“4M GTC溶液”，可以获得即使在30℃条件下也能够稳定地保存微生物的DNA的样本保存液。
本发明不限于上述的实施方式或实施例，在不脱离权利要求书中记载的发明的主旨的范围内的各种设计变更的方式也包含在技术范围内。
附图标记
1、10 分析用装置
2、20 盖构件
3 保存容器
4 样本采集构件
41 轴部
42 采集部
43 孔
5 按压构件
5A 按压销
S 样本保存液
C 样本
序列表自由文本
SEQ ID NO:1：用于16S rRNA基因区域的PCR扩增的正向引物
SEQ ID NO:2：用于16S rRNA基因区域的PCR扩增的反向引物
序列表
<110> 株式会社骏河生物技术研究所
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<400> 1
cctacgggag gcagcag 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 反向引物
<400> 2
attaccgcgg ctgctgg 17
Claims (8)
1.一种样本保存液，所述样本保存液是用于分析来自生物体或来自环境的样本中含有的由胆汁酸、酚类、吲哚类以及有机酸组成的组中选择的至少1种成分而使用的样本保存液，其特征在于，
所述样本保存液至少含有以下(A)和(B)：
(A)缩合磷酸盐或聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物；
(B)硫氰酸胍、Tris-HCl(pH7至9)以及EDTA。
2.根据权利要求1所述的样本保存液，其特征在于，所述缩合磷酸盐是5mM至150mM的焦磷酸钠。
3.根据权利要求1所述的样本保存液，其特征在于，所述聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基化物是0.2重量％至1.0重量％的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的样本保存液，其特征在于，
所述硫氰酸胍的浓度是0.1M至5M，
所述Tris-HCl(pH7至9)的浓度是40mM至150mM，以及
所述EDTA的浓度是1mM至50mM。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的样本保存液，其特征在于，所述样本是粪便。
6.一种分析用装置，其特征在于，所述分析用装置具有：
保存所述样本的保存容器，和
根据权利要求1-5中任一项所述的样本保存液；
所述分析用装置被构成为，使所述样本以浸渍或悬浮在所述样本保存液中的状态保存在所述保存容器中。
7.根据权利要求6所述的分析用装置，其特征在于，所述分析用装置被构成为，相对于所述样本的所述样本保存液的量以容量比计为样本：样本保存液＝1：3以上。
8.一种分析方法，其特征在于，
对所述样本添加根据权利要求1-5中任一项所述的样本保存液以保存所述样本，
分析至少保存7天后的所述样本中含有的由胆汁酸、酚类和吲哚类以及有机酸组成的组中选择的至少一种成分。
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