CN111117999A - 一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法 - Google Patents
一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，包括如下步骤：步骤S1，利用适用于血浆exRNA保存和提取的采血管进行血液采集，并混合均匀,所述采血管中预装有血浆exRNA保存液；步骤S2，将血液样本保存在预装有血浆exRNA保存液的采血管中，低温保存运输；步骤S3，采用柱抽提法进对血液样本中exRNA进行提取，以对血液样本中的血浆exRNA进行分离，本发明可实现一种有效地、适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存技术，能够同时保护体液内细胞外囊泡，脂蛋白和蛋白复合物内的RNA。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法。
背景技术
核糖核酸(RNA)是存在于生物细胞和部分病毒类病毒中的一种由核糖核酸苷通过磷酸二酯键缩合而成的链状遗传分子，可能参与细胞的各种功能，是生物医学的一种重要的研究对象。RNA曾经被认为只能稳定存在于细胞内，根据中心法则它是从DNA转化为蛋白质的中间产物。但是最近的研究表明，RNA可能在多种复杂的细胞功能中发挥重要作用。
细胞外游离核酸(cfNAs)由DNA、RNA、microRNA等组成，已经被广泛应用于各种疾病检测及诊断中。很多研究表明，在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等患者的肿瘤相关基因的表达与体液中游离肿瘤相关性基因RNA的表达密切相关，游离RNA可以作为肿瘤标志物，对鉴别良恶性病变有较好的特异性和敏感性。尽管如此，相对于血浆游离DNA已经被广泛应用疾病的鉴别诊断，RNA因其单链结构极其不稳定，以及从全血中提取和保存相对困难，应用相对滞后。近年来，根据一系列研究发展出来的新的概念，细胞外RNA的相关研究，给新的诊断指标的出现带来了新的希望。
细胞外RNA(extracellular RNA，exRNA)是指被分泌到细胞外的RNA，早在九十年代就已发现它们的存在，可是当时人们普遍认为细胞外间隙和体液中存在大量的RNA酶，exRNA无法稳定存在而没有引起注意。直到有研究证实RNA可通过微囊泡和外泌体中而被分泌到细胞外，可能作为信号分子对邻近细胞或者远距离细胞进行调控。随后的研究在几乎所有生物体中发现了exRNA的存在，包括血液、唾液、尿液、母乳、脑脊液、羊水、腹水、胆汁以及胸腔积液中，exRNA除了mRNA以外，还包括多种非编码RNA类型，如miRNA、piRNA、tRNA、lncRNA、核仁小RNA等。exRNA在体液内被细胞外囊泡(包括外泌体)，脂蛋白和蛋白复合物包裹而免于体液中RNA酶的降解，大多数生物体液中均含有大量的来自多种组织和多种器官的exRNAs，而诸如个体器官的年龄状态等都会影响exRNAs谱。exRNAs有可能和多种载体结构相关，如核蛋白复合体(RNPs)，至蛋白复合体(LPPs)和胞外囊泡(EVs)，因此是一个相对于游离RNA包含内容更加广泛的一个概念。
exRNA可以作为细胞间信号通讯的介质，改变了以往人们对RNA生物学意义的认识，提示了其作为生物标志物而应用于多种疾病的早期筛查和随访。相对于已被广泛应用于各种临床检测的exDNA，exRNA的应用具有多方面的优势：一、每个细胞有多个mRNA拷贝，而DNA仅有2个拷贝，因此进入细胞外的mRNA拷贝数多于DNA，可以提高检测敏感性；二、mRNA反应基因表达水平，DNA反应遗传水平，因此exRNA的变化可能发生在早于基因本身突变或者甲基化等修饰发生改变的时期，可以用作早筛诊断；三、exRNA不仅可以反映肿瘤存在，而且具有组织特异性可能反映出组织定位，可以提供更多的信息；四、exRNA可以参与细胞间调控，可能有机会建立全新的细胞间和物种间信息交流模式。
exRNA可能存在于多种生物液态样本中，极易被生物样品中广泛存在着酶活稳定的核糖核酸酶(RNase)降解，体液冻融过程也会导致其断裂，给exRNA的纯化，储存，运输都带来极大的困难。如果样品没有被正确处理，exRNA可能几分钟内就会被完全不可逆损坏，因此为了让exRNA能更好地应用于检测分析技术，需要一种适用于液态活检技术的体液exRNA保存技术。
发明内容
为克服上述现有技术存在的不足，本发明之目的在于提供一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，以提供一种有效地、适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存技术，以能够同时保护体液内细胞外囊泡(包括外泌体)，脂蛋白和蛋白复合物内的RNA。
为达上述目的，本发明提出一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，包括如下步骤：
步骤S1，利用适用于血浆ex核酸保存和提取的采血管进行血液采集，并混合均匀,所述采血管中预装有血浆exRNA保存液；
步骤S2，将血液样本保存在预装有血浆exRNA保存液的采血管中，低温保存运输；
步骤S3，采用柱抽提法对血液样本中exRNA进行提取，分离血液样本中的血浆exRNA。
优选地，所述血浆exRNA保存液包括但不限于：
A)防腐剂；
B)核酸酶抑制剂；
C)还原剂；
D)蛋白酶抑制剂；
E)磷酸盐抑制剂；
F)代谢抑制剂；
G)溶剂。
优选地，所述溶剂为一种缓冲剂，所述缓冲剂包括Tris-HCL、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中的一种或多种,其pH值为3.0-9.0。
优选地，所述核酸酶抑制剂包括RNase抑制因子，所述RNase抑制因子的量按体积来算为1：(100-1000)。
优选地，所述蛋白酶抑制剂包括但不限于本甲基磺酰氟(PMSF)、胰蛋白酶抑制剂中的一个或多个，所述蛋白抑制剂的用量为0.5-10μg/mL。
优选地，所述磷酸酶抑制剂包括但不限于氟化钠、原钒酸钠、β-甘油磷酸盐、焦磷酸钠中的一种或几种，所述磷酸酶抑制剂的用量为5-10mM。
优选地，所述代谢抑制剂包括但不限于甘油醛和金精三羧酸(ATA)中的一种或多种，所述代谢抑制剂的用量为5-10mg/ml。
优选地，所述还原剂包括但不限于β-巯基乙醇和三(2-羧乙基)膦(TCEP)中的一种或多种，所述还原剂的用量为5-50mM。
优选地，所述防腐剂包括但不限于甲醛、甜菜碱、氯化胆碱中的一种或多种，所述防腐剂的用量为溶液总量的1％-10％。
优选地，于步骤S3中，所述对血液样本中ex核酸提取的步骤包括：
A)上下翻转血液样本，使得样本均匀，取若干样本经离心处理后加入到Buffer L中，加入蛋白酶K温育后，加入Buffer R冷却静置若干时间，加入氯仿，涡旋混匀，室温孵育若干时间，离心；
B)将上清液转移到新的离心柱中，离心，加入异丙醇离心；
C)加入乙醇清洗膜，数次晾干，加入RNA样本保存液洗脱得到血浆exRNA。
优选地，所述Buffer L含有SDS、Tris-HCl、β-巯基乙醇和EDTA，所述Buffer R中含有异硫氰酸胍、SDS、柠檬酸钠和苯酚，所述蛋白酶K的浓度为1-5μg/mL，温育时间为10-30min，温育温度为56-60℃，所述离心柱中为可吸附核酸分子的硅胶膜。
优选地，所述方法还包括：
利用RNA样本保存液对提取出的exRNA进行溶解保存，并对RNA的纯度浓度进行初步检测、精确检测以及分析纯化RNA的状态和片段分布。
优选地，所述RNA样本保存液含有Tris-HCl、EDTA、柠檬酸钠、叠氮钠、甲酰胺、RNase抑制剂中的一种或多种，主要用于纯化后exRNA样本的保存。
与现有技术相比，本发明一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法通过利用适用于血浆ex核酸保存和提取、预装有血浆exRNA保存液的采血管进行负压采血的采血管进行血液采集并混合均匀，以将血液样本保存在预装有血浆exRNA保存液的采血管中，低温保存运输，并采用酚氯仿法进对血液样本中exRNA进行提取，对血液样本中的血浆exRNA进行分离，实现了一种有效的、适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存技术，通过本发明，不但可以提高血浆exRNA保存的稳定性和提取率，同时可以方便在复杂的取样环境进行简化预处理。
附图说明
图1为本发明一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法的步骤流程图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例并结合附图说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明亦可通过其它不同的具体实例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不背离本发明的精神下进行各种修饰与变更。
图1为本发明一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法的步骤流程图。如图1所示，本发明一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，所述血浆exRNA包括存在于血浆中游离的、外泌体中的、脂蛋白包裹的所有类型RNA，其包括但不限于：mRNA片段，miRNA,licRNA，ceRNA，所述方法包括如下步骤：
步骤S1，利用适用于血浆exRNA保存和提取的采血管进行血液采集，并混合均匀,所述采血管中预装有血浆exRNA保存液。在本发明具体实施例中，利用适用于血浆exRNA保存和提取、预装有血浆exRNA保存液的采血管进行负压采血，并手动混匀10-15s，血液在预装有血浆exRNA保存液的采血管中，可以低温稳定运输或保存7天左右，再用于后续血浆中所有RNA分离。
在本发明具体实施例中，所述血浆exRNA保存液包括但不限于：
A)防腐剂；
B)核酸酶抑制剂；
C)还原剂；
D)蛋白酶抑制剂；
E)磷酸盐抑制剂；
F)代谢抑制剂；
G)溶剂。
优选地，所述溶剂为一种缓冲剂,所述缓冲剂包括Tris-HCL、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中的一种或多种,所述缓冲剂的pH为3.0-9.0。
优选地，所述核酸酶抑制剂包括RNase抑制因子，所述RNase抑制因子的量按体积来算大约为1：(100-1000)，即占总体积1％或者0.1％。
优选地，所述蛋白酶抑制剂包括但不限于本甲基磺酰氟(PMSF)、胰蛋白酶抑制剂中的一个或多个，所述蛋白抑制剂的用量为0.5-10μg/mL。
优选地，所述磷酸酶抑制剂包括但不限于氟化钠、原钒酸钠、β-甘油磷酸盐、焦磷酸钠中的一种或几种，所述磷酸酶抑制剂的用量为5-10mM。
优选地，所述代谢抑制剂包括但不限于甘油醛和金精三羧酸(ATA)中的一种或多种，所述代谢抑制剂的用量为5-10mg/ml。
优选地，所述还原剂包括但不限于β-巯基乙醇和三(2-羧乙基)膦(TCEP)中的一种或多种，所述还原剂的用量为5-50mM。。
优选地，所述防腐剂包括但不限于甲醛、甜菜碱、氯化胆碱中的一种或多种，在本发明具体实施例中，，所述防腐剂的用量为溶液总量的1％-10％。
步骤S2，将血液样本保存在该预装有血浆exRNA保存液的采血管中，低温保存运输。在本发明中，血液在预装有RNA保存液的采血管中，可以低温稳定运输或保存7天左右，再用于后续血浆中所有RNA分离。
步骤S3，采用柱抽提法进对血液样本中exRNA进行提取，以对血液样本中的exRNA进行分离。
具体地，于步骤S3中，所述对血液样本中ex核酸提取的步骤包括：
A)上下翻转血液样本，使得样本均匀，取若干样本经离心处理后加入到Buffer L中，加入蛋白酶K温育后，加入Buffer R冷却静置若干时间，加入氯仿，涡旋混匀，室温孵育若干时间，离心；
B)将上清液转移到新的离心柱中，离心，加入异丙醇离心；
C)加入乙醇清洗膜，数次晾干，加入RNA样本保存液洗脱得到血浆exRNA。
优选地，所述Buffer L含有SDS、Tris-HCl、β-巯基乙醇和EDTA，所述Buffer R中含有异硫氰酸胍、SDS、柠檬酸钠和苯酚，所述蛋白酶K的浓度为1-5ug/mL，温育时间为10-30min，温育温度为56-60℃，所述离心柱中为可吸附核酸分子的硅胶膜。exRNA除了游离RNA之外还有包裹在蛋白和脂蛋白中的RNA分子，因此采用蛋白酶K在Buffer L中56-60℃消化，释放RNA并消除各种酶类的影响，再以异硫氰酸胍苯酚和氯仿体系在离心柱中纯化RNA。
优选地，利用RNA样本保存液对提取出的exRNA(exRNA)进行溶解保存，并通过Nanodrop分光光度计首先对exRNA的浓度纯度进行初步的检测，判断是否可以进行后续试验，用赛默飞世尔Qbit3.0进行浓度精确检测和安捷伦2100分析纯化RNA的状态(包括浓度、质量、片段分布及RIN值等参数)。所述RNA样本保存液可用于纯化后的exRNA样本的溶解和保存，不仅可防止微生物生长，同时也可防止反复冻融对RNA造成的损伤，在本发明具体实施例中，所述RNA样本保存液含有Tris-HCl、EDTA、柠檬酸钠、叠氮钠、甲酰胺、RNase抑制剂中的一种或多种，所述RNA样本保存液可在-80℃长期保存血浆exRNA。
可见，本发明设计合理，操作简便，根据本发明提供的采血管及血浆exRNA保存液可以方便的将临床生物样本进行有效的保存7天，直至进行纯化试验提取血浆exRNA进行后续质控及检测，本发明不但可以提高血浆exRNA保存的稳定性和提取率，同时可以方便在复杂的取样环境进行简化预处理，适用于各种条件。
综上所述，本发明一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法通过利用适用于血浆ex核酸保存和提取、预装有血浆exRNA保存液的采血管进行负压采血的采血管进行血液采集并混合均匀，以将血液样本保存在预装有血浆exRNA保存液的采血管中，低温保存运输，并采用酚氯仿法进对血液样本中exRNA进行提取，对血液样本中的血浆exRNA进行分离，实现了一种有效的、适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存技术，通过本发明，不但可以提高血浆exexRNA保存的稳定性和提取率，同时可以方便在复杂的取样环境进行简化预处理。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围，应如权利要求书所列。
Claims (13)
1.一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，包括如下步骤：
步骤S1，利用适用于血浆exRNA保存和提取的采血管进行血液采集，并混合均匀,所述采血管中预装有血浆exRNA保存液；
步骤S2，将血液样本保存在预装有血浆exRNA保存液的采血管中，低温保存运输；
步骤S3，采用柱抽提法对血液样本中exRNA进行提取，分离血液样本中的血浆exRNA。
2.如权利要求1所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于，所述血浆exRNA保存液包括但不限于：
A)防腐剂；
B)核酸酶抑制剂；
C)还原剂；
D)蛋白酶抑制剂；
E)磷酸盐抑制剂；
F)代谢抑制剂；
G)溶剂。
3.如权利要求2所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于：所述溶剂为一种缓冲剂，所述缓冲剂包括Tris-HCL、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中的一种或多种,其pH值为3.0-9.0。
4.如权利要求2所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于：所述核酸酶抑制剂包括RNase抑制因子，所述RNase抑制因子的量按体积来算为1：(100-1000)。
5.如权利要求2所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于：所述蛋白酶抑制剂包括但不限于本甲基磺酰氟(PMSF)、胰蛋白酶抑制剂中的一个或多个，所述蛋白抑制剂的用量为0.5-10μg/mL。
6.如权利要求2所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于：所述磷酸酶抑制剂包括但不限于氟化钠、原钒酸钠、β-甘油磷酸盐、焦磷酸钠中的一种或几种，所述磷酸酶抑制剂的用量为5-10mM。
7.如权利要求2所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于：所述代谢抑制剂包括但不限于甘油醛和金精三羧酸中的一种或多种，所述代谢抑制剂的用量为5-10mg/ml。
8.如权利要求2所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于：所述还原剂包括但不限于β-巯基乙醇和三(2-羧乙基)膦中的一种或多种，所述还原剂的用量为5-50mM。
9.如权利要求2所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于：所述防腐剂包括但不限于甲醛、甜菜碱、氯化胆碱中的一种或多种，所述防腐剂的用量为溶液总量的1％-10％。
10.如权利要求2所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于，于步骤S3中，所述对血液样本中ex核酸提取的步骤包括：
A)上下翻转血液样本，使得样本均匀，取若干样本经离心处理后加入到Buffer L中，加入蛋白酶K温育后，加入Buffer R冷却静置若干时间，加入氯仿，涡旋混匀，室温孵育若干时间，离心；
B)将上清液转移到新的离心柱中，离心，加入异丙醇离心；
C)加入乙醇清洗膜，数次晾干，加入RNA样本保存液洗脱得到血浆exRNA。
11.如权利要求10所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于，所述Buffer L含有SDS、Tris-HCl、β-巯基乙醇和EDTA，所述Buffer R中含有异硫氰酸胍、SDS、柠檬酸钠和苯酚，所述蛋白酶K的浓度为1-5μg/mL，温育时间为10-30min，温育温度为56-60℃，所述离心柱中为可吸附核酸分子的硅胶膜。
12.如权利要求11所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于，所述方法还包括：
利用RNA样本保存液对提取出的exRNA进行溶解保存，并对exRNA的纯度浓度进行初步检测，精确检测以及分析纯化RNA的状态和片段分布。
13.如权利要求11所述的一种适用于液态活检技术的血浆exRNA提取保存方法，其特征在于：所述RNA样本保存液含有Tris-HCl、EDTA、柠檬酸钠、叠氮钠、甲酰胺、RNase抑制剂中的一种或多种。
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