CN107156106A - 液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂及其采血管 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂及其采血管。以重量份计，该稳定剂包括20‑100份的防腐剂、5‑50份的抗氧化剂、1‑35份的抗凝剂、5‑20份的pH稳定剂、5‑20份的酶抑制剂、0.1‑10份的细胞凋亡抑制剂、5‑25份的自由基捕获剂和1‑10份的代谢抑制剂。本发明提供的液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂及其采血管，能够运用一步法进行相关样品的快速分离，能够有效保存胎儿游离核酸，防止循环肿瘤核酸交联性损伤并保证野生型基因的完整性，防止细胞裂解及其血液基因组核酸的释放，实现癌症患者的血样中的循环肿瘤细胞、淋巴细胞以及循环肿瘤核酸的常温保存与运输。

Description

液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂及其采血管
技术领域
本发明属于液体活检技术领域，具体涉及一种液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂及其采血管。
背景技术
液体活检，既有极高的科研价值，又具备助力推进精准医疗临床实践的巨大潜能。它可用于癌症早期筛查、诊断、监控、治疗方案指导和疗效评估等众多领域，液体活检的优势使其成为最具发展潜力的肿瘤诊疗手段。游离核酸作为新型的医疗诊断标志物，与肿瘤学、产前遗传学诊断的发展有着非常密切的联系，循环肿瘤主要来源于实体肿瘤的原发病灶从肿瘤组织中脱落进入到血液循环中，并最终称为肿瘤的早期诊断、个性化治疗、疗效检测的标志性检测物质。恶性肿瘤的高度异质性使不同个体之间存在药效的差异，肿瘤不断进化，在不同阶段表现出不一样的生物学特征，给临床诊治造成了很大困扰。侵袭与转移能力高的肿瘤细胞扩散至循环血后，在特定的阶段及环境中种植于身体某些部位，不断增殖形成转移瘤，且表现出与原发肿瘤不一样的生物学特征。在抗肿瘤治疗中，转移瘤克隆进化持续发生，抗肿瘤治疗失败继而重演。相关研究表明游离DNA与肿瘤细胞DNA具有一致性，能全面的反应肿瘤细胞中遗传信息的变化，利用液体活检技术能克服常规肿瘤组织活检所无法突破的肿瘤异质性问题。通过循环肿瘤核酸检测，能帮助实时动态监测肿瘤原发灶及转移复发灶基因组信息，协助早期诊断、疗效监测和预后判断，也有助于靶向治疗适应证的评估。在遗传诊断领域，通过采集孕妇外周血，并提取血液中游离脱氧核糖核酸(cfDNA)并进一步分离出游离的胎儿脱氧核糖核酸(cffDNA)，结合下一代测序技术(NGS)，结合相关生物信息分析，对胎儿的遗传信息进行分析达到无创产前诊断的目的。
然而由于相关标记物在血液中的含量极低并且其在常温情况下降解速度快等特点加大了相关标记物获取的困难，并且相关血样在保存及运输的过程中都受到外界条件如地理、时间、空间、温度等条件的扰动，对血样造成了一定的破坏，加大了液体活检实施的困难。由此可见，液体活检的实施的关键在于相关生物样品的获取与保存的实现。
常规血样进行保存的稳定剂一般采用咪唑烷基脲等防腐剂，该类物质虽然能起到防腐功效，但会释放出甲醛等有害成分，容易攻击游离核酸，引起游离核糖核酸(cfRNA)交连成双键结构无法检测，游离脱氧核糖核酸(cfDNA)化学键被破坏，双链结构无法打开，无法进行扩增、诊断，不能够制成医学用采血管，无医学上的使用价值。
再者，在进行于癌症相关的液体活检测应用中，关键在于保证血样中游离脱氧核糖核酸(cfDNA)、循环肿瘤DNA(cfDNA)及野生型基因组的完整性，而现有液体活检中对血样进行保存的稳定剂，一般难以保证游离核酸不降解，在进行下游分析时，难以提供足量游离核酸用于分析；同时血样保存的常规稳定剂中自由基的存在，加速了核酸降解，而且能够杀死血液中的白细胞及癌细胞，无法满足液体活检的需求。
发明内容
为了解决现有血样保存稳定剂难以满足液体活检中游离脱氧核糖核酸(cfDNA)、循环肿瘤DNA(cfDNA)及野生型基因组的完整性及容易产生甲醛等有害成分等问题，本发明的目的在于提供一种符合医学标准的不含有甲醛等有害物质且能够用于液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞保存的稳定剂及其采血管。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
本发明提供一种液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂，以重量份计，该稳定剂包括20-100份的防腐剂、5-50份的抗氧化剂、1-35份的抗凝剂、5-20份的pH稳定剂、5-20份的酶抑制剂、0.1-10份的细胞凋亡抑制剂、5-25份的自由基捕获剂和1-10份的代谢抑制剂。
上述稳定剂中，优选地，所述防腐剂可以包括利福平、鱼精蛋白、壳聚糖、果胶分解物、三氯叔丁醇、羧甲纤维素、聚山梨酯、山梨酸、羟苯乙酯和石墨烯纳米抗菌材料等中的一种或多种的组合。
上述稳定剂中，优选地，所述防腐剂为由利福平、鱼精蛋白、壳聚糖和羟苯乙酯所组成的组合物，其中利福平、鱼精蛋白、壳聚糖和羟苯乙酯质量比为(1-2)：(3-5)：(2-10)：(5-10)。
上述稳定剂中，优选地，所述石墨烯纳米抗菌材料制备方法为：所述石墨烯纳米抗菌材料制备方法为：利用水热法培养石墨烯纳米材料，并将1g石墨烯纳米材料溶于50mL超纯水中并超声分散，得到分散液；然后向分散液中加入20g-50g的十八烷基二甲基三甲氧基硅烷基丙基氯化铵，超声震荡48h、水浴5h、搅拌反应10h、过滤、洗涤、干燥得到石墨烯纳米抗菌材料。
上述石墨烯纳米抗菌材料制备方法中，水热法培养、超声分散、超声震荡、水浴、搅拌、过滤、洗涤、干燥等工艺条件均为本领域技术人员根据实际操作进行合理调整。
上述稳定剂中，优选地，所述抗氧化剂可以包括维生素C、虾青素、类胡萝卜素、特丁基对苯二酚、二丁基羟基甲苯、二叔丁基羟基甲苯和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯等中的一种或多种的组合。
上述稳定剂中，优选地，所述抗氧化剂为由维生素C、虾青素、类胡萝卜素和特丁基对苯二酚所组成的组合物，其中：维生素C、虾青素、类胡萝卜素和特丁基对苯二酚质量比为(1-5)：(2-5)：(3-10)：(1-5)。
上述稳定剂中，优选地，所述抗凝剂可以包括草酸钾、肝素、氯化钠、二乙胺四乙酸钾盐和枸橼酸钠等中的一种或多种的组合。
上述稳定剂中，优选地，所述抗凝剂为二乙胺四乙酸钾盐。
上述稳定剂中，优选地，所述pH稳定剂可以包括Tris-HCl缓冲液和/或柠檬酸。
上述稳定剂中，优选地，所述酶抑制剂可以包括二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、巯基乙醇和亚硫酸氢钠等中的一种或多种的组合。
上述稳定剂中，优选地，所述细胞凋亡抑制剂可以包括Q-VD-OPh。
上述稳定剂中，优选地，所述自由基捕获剂的制备方法包括以下步骤：
以多元胺作为引发剂，加入有机溶剂、催化剂和开环材料，进行开环聚合，得到产物A；
将产物A用乙醚提纯，然后用反向硅胶柱进一步提纯，得到产物B；
将产物B溶于有机溶剂中，加入催化剂和开环材料，进行开环聚合，并采用乙醚和反向硅胶柱依次提纯产物，得到两亲性多臂星形聚合物；
将纳米材料溶于超纯水中超声，然后加入氨水及硅化剂进行硅基化修饰，分离得到产物C，将产物C用氨基酸进行包被，得到产物D；
取产物D、两亲性多臂星形聚合物，加入N-羟基琥珀酰亚胺进行端基修饰反应，得到自由基捕获剂。
上述自由基捕获剂的制备方法中，各物质用量、开环聚合反应条件、产物提纯条件等均为本领域技术人员根据实际操作进行合理调整。
上述稳定剂中，优选地，所述开环材料包括己内酯、丙交酯、乙烯亚胺、环氧乙烷、谷氨酸和赖氨酸中的一种或多种的组合。
上述稳定剂中，优选地，所述催化剂可以包括辛酸亚锡和/或氯化锌。
上述稳定剂中，优选地，所述多元胺可以包括三乙烯四胺、乙二胺、二乙烯三胺和四亚乙基五胺等中的一种或多种的组合。
上述稳定剂中，优选地，所述有机溶剂可以包括二氯甲烷或二甲基亚砜。
上述稳定剂中，优选地，所述氨基酸可以包括赖氨酸、丝氨酸和异亮氨酸等中的一种或多种的组合。
上述稳定剂中，优选地，所述两亲性多臂星形聚合物结构式包括-N-(PLGA-PCL-)n、-N-(PGA-PCL)n-、-N-(PEI-PCL)n-和-N-(DPHAL-PLGA)n-中的一种或多种的组合；其中，n取值2,4,6或8，DPHAL为多聚赖氨酸。
上述稳定剂中，优选地，所述纳米材料可以包括羟基磷灰石纳米颗粒、中孔硅纳米颗粒和金纳米颗粒等中的一种或多种的组合。
上述稳定剂中，优选地，所述纳米材料粒径为20nm-1000nm。
上述稳定剂中，优选地，所述代谢抑制剂可以包括氨基葡萄糖盐酸盐、甘油醛、金精三羧酸、腺嘌呤、腺苷和磷酸二氢钠等中的一种或多种的组合。
上述稳定剂中，优选地，所述代谢抑制剂为氨基葡萄糖盐酸盐、甘油醛和金精三羧酸的组合。
本发明还提供一种真空采血管，其管中装载有上述的稳定剂。
上述稳定剂中，防腐剂选用石墨烯纳米抗菌材料等，能够解决现有血样稳定剂在保存过程中释放出甲醛等有害成分，从而保护游离核酸。
上述稳定剂中，制备的自由基捕获剂中，纳米材料能够与核酸进行可逆性的结合，捕获自由基。在效果上可以在2mL的血液中提取足量的游离核酸进行下游分析。对于cfDNA的保存可以长达18天，cfRNA的保存可以长达9天(37℃情况)，做到真正的常温保存，满足液体活检的需要。制备的两亲性多臂星形聚合物利用其氮上的活泼氢进行多臂化处理，增强纳米材料的生物活性，并且修饰后的纳米材料不会影响环境的渗透压，避免了血细胞的破裂。
本发明提供的液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂及其采血管，能够运用一步法进行相关样品的快速分离，能够有效保存胎儿游离核酸，防止循环肿瘤核酸交联性损伤并保证野生型基因的完整性，防止细胞裂解及其血液基因组核酸的释放，实现癌症患者的血样中的循环肿瘤细胞、淋巴细胞以及循环肿瘤核酸的常温保存与运输。
附图说明
图1为本发明实施例4中单离心体系和双离心体系对应β-actin拷贝数结果数据图；
图2为本发明实施例5中室温条件下荧光PCR扩增β-actin及SRY进行扩增测定cfDNA和cffDNA浓度对比实验图；
图3为本发明实施例5中35℃条件下荧光PCR扩增β-actin及SRY进行扩增测定cfDNA和cffDNA浓度对比实验图；
图4为本发明实施例6中健康自愿者血样中cfDNA突变率分布图；
图5为本发明实施例6中直肠癌患者血样中cfDNA突变率分布图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1
本实施例提供一种液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂，以重量份计，该稳定剂包括50mg的防腐剂(石墨烯纳米抗菌材料)、25mg的二叔丁基羟基甲苯、10mg的二乙胺四乙酸二钾、15mg的巯基乙醇、2mg的细胞凋亡抑制剂Q-VD-OPh、20mg的自由基捕获剂和10mg的金精三羧酸，通过改变pH稳定剂柠檬酸的含量，使稳定剂最终pH值在4-5之间。
本实施例的稳定剂中，所述石墨烯纳米抗菌材料制备方法为：利用水热法培养石墨烯纳米材料，并将1g石墨烯纳米材料溶于50mL超纯水中并超声分散，得到分散液；然后向分散液中加入20-50g的十八烷基二甲基三甲氧基硅烷基丙基氯化铵超声震荡48小时、水浴5小、搅拌反应10小时、过滤洗涤、干燥得到石墨烯纳米抗菌材料。
本实施例的稳定剂中，所述自由基捕获剂的制备方法为：
以乙二胺作为引发剂，溶于50mL二氯甲烷中以辛酸亚锡为催化剂、引发赖氨酸发生开的开环聚合，得到产物A；其中乙二胺与赖氧酸的摩尔比为1:20；
将产物A用乙醚提纯，然后用反向硅胶柱进一步提纯，得到产物B；
将产物B溶于50mL二氯甲烷中，以氯化锌为催化剂、引发丙交酯发生开环聚合，并提纯产物，得到两亲性多臂星形聚合物-N-(DPHAL-PLGA)2-，其中产物B与丙交酯的摩尔比为1:20。
将纳米材料1g羟基磷灰石纳米颗粒(粒径为50nm)溶于超纯水中超声，然后加入50mL氨水及80-100g氨丙基三乙氧基硅烷进行硅基化修饰，分离得到产物C，将产物C用赖氨酸进行包被，得到产物D。
取产物D、两亲性多臂星形聚合物-N-(DPHAL-PLGA)2-，加入过量的N-羟基琥珀酰亚胺进行端基修饰反应，得到自由基捕获剂。
本实施例还提供一种真空采血管，其装载有本实施例制备的稳定剂。
实施例2
本实施例提供一种液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂，以重量份计，该稳定剂包括35mg的石墨烯纳米抗菌材料20mg的特丁基对苯二酚、35mg的二乙胺四乙酸二钾、10mg的二硫苏糖醇、5mg的细胞凋亡抑制剂Q-VD-OPh、25mg的自由基捕获剂和5mg的氨基葡萄糖盐酸盐，通过改变pH稳定剂柠檬酸的含量，使稳定剂最终pH值在4-5之间。
本实施例的稳定剂中，所述石墨烯纳米抗菌材料制备方法为：利用水热法培养石墨烯纳米材料，并将1g石墨烯纳米材料溶于50mL超纯水中并超声分散，得到到分散液；然后向分散液中加入20-50g十八烷基二甲基三甲氧基硅烷基丙基氯化铵超声震荡48小时、水浴5小、搅拌反应10小时、过滤洗涤、干燥得到石墨烯纳米抗菌材料。
本实施例的稳定剂中，所述自由基捕获剂的制备方法为：
以二乙烯三胺作为引发剂，溶解到50mL二氯甲烷溶液中、在酸性条件下引发乙烯亚胺的聚合开环反应，得到产物A，其中，二乙烯三胺与乙烯亚胺的摩尔比为1:3；
将产物A用乙醚提纯，然后用反向硅胶柱进一步提纯，得到产物B；
将产物B溶于50mL二氯甲烷中，加入辛酸亚锡作为催发剂、引发己内酯的聚合开环反应，并提纯产物，得到两亲性多臂星形聚合物-N-(PEI-PCL)6-，其中，产物B与己内酯摩尔比为1:60。
将2g纳米金材料(粒径为100nm)溶于超纯水中超声，然后加入50mL氨水及35g硅化剂进行硅基化修饰，分离得到产物C，将产物C用10g赖氨酸进行包被，得到产物D；
取产物D、两亲性多臂星形聚合物-N-(PEI-PCL)6-，加入过量的N-羟基琥珀酰亚胺进行端基修饰反应，得到自由基捕获剂。
本实施例还提供一种真空采血管，其装载有本实施例制备的稳定剂。
实施例3
本实施例提供一种液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂，以重量份计，该稳定剂包括25mg的防腐剂(由利福平、鱼精蛋白、壳聚糖和羟苯乙酯所组成的组合物，其中：利福平、鱼精蛋白、壳聚糖和羟苯乙酯质量比为1:5:2:5)、25mg的2,3,6,7,10,11-六羟基三苯、25mg的二乙胺四乙酸二钾、15mg的亚硫酸氢钠、10mg的细胞凋亡抑制剂Q-VD-OPh、25mg的自由基捕获剂和5mg的氨基葡萄糖盐酸盐，通过改变pH稳定剂柠檬酸的含量，使稳定剂最终pH值在4-5之间。
本实施例的稳定剂中，所述自由基捕获剂的制备方法为：
以乙二胺作为引发剂，溶解到50mL二氯甲烷溶液中、以辛酸亚锡为催化剂、引发谷氨酸的聚合开环反应，得到产物A，其中，乙二胺与谷氨酸的摩尔比为1:10；
将产物A用乙醚提纯，然后用反向硅胶柱进一步提纯，得到产物B；
将产物B溶于50mL二氯甲烷中，加入辛酸亚锡作为催发剂、引发己内酯的聚合开环反应，并提纯产物，得到两亲性多臂星形聚合物-N-(PGA-PCL)2-，其中，产物B与己内酯摩尔比为1:60。
将2g纳米材料中孔硅纳米颗粒(粒径为50nm)溶于超纯水中超声，然后加入50ml氨水及35g硅化剂进行硅基化修饰，分离得到产物C，将产物C用10g异亮氨酸进行包被，得到产物D；
取产物D、两亲性多臂星形聚合物-N-(PGA-PCL)2-，加入过量的N-羟基琥珀酰亚胺进行端基修饰反应，得到自由基捕获剂。
本实施例还提供一种真空采血管，其装载有本实施例制备的稳定剂。
实施例4游离核酸快速分离实验
本实施例1的采血管除了利用的双离心体系之外，还可利用单离心体系进行快速分离，操作更加便捷。通过收集分为3组样品即为一组单离心体系(即，1600×G为15分钟)和两组双离心体系(即，300×g为20分钟随后由5000×10分钟或1600×g为10分钟，其次为16000×g 10分钟)，分别并利用本实施例1采血管采取并保存血液样品在25度温度下静置保存0天，7天和14天。并提取游离DNA。并利用ddPCR测定β-actin的拷贝数，其结果如图1所示，其结果证明快速分离法与二步分离法没有明显的差别。因此本实施例提供的采血管利用单离心体系进行快速分离，相比二步分离法操作更加便捷。
实施例5胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)的存储和运输对比试验
对22名经羊水穿刺诊断表明其具有胎儿Y染色体异常的孕妇志愿者进行采血取样，每名孕妇采取20mL血样，分别用二支5mL普通K2EDTA抗凝管及二支本实施例1的采血管进行取样。将各组第一支血样立即处理，将第二血进行如下处理：将K2EDTA抗凝管中的血样置于泡沫箱中并加入足够量的干冰，密封。将二组样品均放置于摇床上，置于室温条件下，其转速为100转/分钟，放置7天，用以模拟血样的运输过程。使用两步法进行样品的分离并利用QIAmp试剂盒提取样品中的游离核酸，进而利用Roche LightCycler 480对β-actin及SRY进行扩增，用以测定其cfDNA及cffDNA的浓度，其结果如图2所示。
由图2实验结果可知：本实施例通过实时荧光PCR扩增β-actin基因片段来表征cfDNA浓度，并通过扩增SRY基因片段用来表征cffDNA。如图2所示，在加入大量的干冰的情况下K2EDTA抗凝管中的SRY浓度经过7天运输，其中位数为25.9copys/mL(P＜0.01)；在不加干冰的情况下，本采血管可以稳定胎儿游离DNA其浓度为33.4copys/mL。此外，我们还可明显的观察到，在采用K2EDTA抗凝管运输的过程中，血液中总游离核酸含量产生了明显的增加，这是由于其血液发生了溶血现象，引起血细胞破裂，导致其含量上升。而经本采血管保存的血样没有发生上述问题，说明本采血管中的稳定剂能够有效保存胎儿游离核酸。
用相同的方法对18名志愿者进行采血取样，每名孕妇采取20mL血样，分别用二支5mL普通K2EDTA抗凝管及二支本实施例采血管进行取样。将各组第一支血样立即处理，将第二血进行如下处理：将K2EDTA抗凝管中的血样置于泡沫箱中并加入足够量的干冰密封，将二组样品均放置于35℃条件下3天。利用QIAmp试剂盒提取样品中的游离核酸，并利用RocheLightCycler 480对β-actin及SRY进行扩增，用以测定其cfDNA及cffDNA的浓度，其结果如图3所示。
由图3实验结果可知：在室温高于30℃的情况下，样品中的SRY浓度经过没有明显的变化。然而，在采用K2EDTA抗凝管保存的过程中，血液中总游离核酸含量产生了明显的增加，血液发生了较为明显的溶血现象。
实施例6循环肿瘤DNA(ctDNA)突变检测对比试验
血浆基因分型在临床测试中具有不可估量的应用潜力，这种癌症常规基因标志的快速与无创筛查可以避免传统侵入性的活组织检查。与癌征相关的液体活检测应用的关键是保证所采取的血样中的游离脱氧核糖核酸(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)及野生型基因组的完整性，但很多细胞稳定剂中含有可引起游离DNA交联性损伤，在使用PCR扩增检测时会导致野生型DNA突变率的增加，针对这一现象本案例对本产品在突变率及野生型基因组的完整性的应用进行详细的评估。
抽取30个健康志愿者的静脉血保存分别保存至普通K2EDTA抗凝管、本实施例1采血管并加入一定量的突变核酸片段有以模拟典型癌征病人的血液特征。将所采集的样品进行如下处理：将K2EDTA抗凝管中的血样置于泡沫箱中并加入足够量的干冰，密封、静置保存；对本采血管采取到的血液不做作任何特殊处理，直接放入摇床中，其转速为100转/分钟，用以模型运输过对血样造成的影响。所有样品均置于室温条件下。采用二步离心法进行离心，利用QIAmp试剂盒提取样品中的游离核酸，K2EDTA抗凝管利用BEAMing技术检测技术，检测其K2EDTA抗凝管2h以及本采血管中的血样在2h、3d、5d及7d的血样中游离核酸变异情况，检测结果如图4所示。
由图4实验结果可知：本采血管在采集的过程中对血液中的核酸分布情况没有影响，与传统的采集方法相比，经统计学分析表明本方法与标准方法所采到的血液样品没有显著差别(见图4第一组及第二组数据)。另外本采血管可以用于常温运输与保存血液中循环肿瘤核酸样品，其模拟血样在2h、3d、5d及7d的血样中循环肿瘤核酸均未发现变异情况。这说明本采血管中的稳定剂具有稳定血液细胞，防止cfDNA交联性损伤，保证野生型基因的完整性作用。
为了进一步验证上述结论，我们进一步抽取1名患有直肠癌患者的静脉血10mL，分别用二支5mL本采血管进行取样，并做如下处理：将其中一个样本室温下静置保存2h；另一个样品直接放入摇床中，其转速为100转/分钟，运行5天，用以模型运输过对血样造成的影响。，采用二步法进行样品的分离，并利用QIAmp试剂盒提取样品中的ctDNA，利用BEAMing技术分析自愿者血样中游离核酸的突变率，检测结果如图5所示。
由图5实验结果可知：直肠癌患者血液中的ctDNA在2h和3d内突变率未见明显增加，由些可见，本采血管中稳定剂可保存循环肿瘤DNA的完整性，可以运用于癌症的诊断。
实施例7癌症患者血样的常温保存对比实验
循环肿瘤DNA(ctDNA)被越来越多地用于生物医学和临床研究遗传试验标记物。然而，血液收集引起的血细胞破裂，会导致污染的血浆中的DNA的增加，进而影响ctDNA的分析与诊断。本申请提供的稳定剂可以防止血细胞破裂达数周之久，并拥有保存循环肿瘤DNA的能力，便于血液采集及分析样品制备，提高结果的准确度。
本实施方法选取经诊断患有乳腺癌并且均发现PIK3CA基因突变的志愿者6名，每名病人收集4支血样各5mL，分别用二支普通K2EDTA抗凝管及二支本申请实施例1的采血管进行取样及保存。将各组第一支血样立即处理，将第二血进行如下处理：将K2EDTA抗凝管中的血样置于泡沫箱中并加入足够量的干冰，密封。将二组样品均放置于摇床上，置于室温条件下，其转速为100转/分钟，放置7天，用以模拟血样的运输过程。使用两步法进行样品的分离并利用QIAmp试剂盒提取样品中的游离核酸，进而利用ddPCR对E545K及H1047R位点进行检测进而对PIK3CA基因突变进行识别以及对其野生型等位基因进行别识，其结果如下表1所示。
表1
由表1实验结果可知，通过对比野生型PIK3CA基因和检测两PIK3CA基因的二个突变位点，研究发现，储存在本申请采血管中的血样7天没有发现明显的细胞破解现象，而保存在抗凝管中的基因组基因的量明显增加，说明大量的血细胞发生破裂。由于可见，本申请采血管中的稳定剂能够防止细胞裂解及其血液基因组DNA的释放，实现癌症患者的血样的常温保存。
实施例8游离核糖核酸(cfRNA)的保存
本实施方法选取身体健康的志愿者8名，每名志愿者收集8支血样各5mL，分别用4支普通K2EDTA抗凝管及4支实施例1采血管进行取样及保存。将各组其中一支血样立即处理，将第余下血样进行如下处理：将K2EDTA抗凝管中的血样置于泡沫箱中并加入足够量的干冰，密封。将二组样品均放置于摇床上，置于室温条件下，其转速为100转/分钟，分别放置1天、3天、7天，用以模拟血样的运输过程。使用两步法进行样品的分离并利用QIAmp试剂盒提取样品中的游离核酸。将提取到的RNA采用RT-qPCR检测18S rRNA，其上下游引物序列分别为：
上游引物(如SEQ ID NO：1所示)5’-CGAATGTCTGCCCTATCAAC-3’；
下游引物(如SEQ ID NO：2所示)5’-GTTTCTCAGGCCCCTCTCC-3’。
其结果如下表2所示。
表2
由上表2实验数据可知，本发明采血管中稳定剂可以在长达7天的时间里稳定血液中的cfRNA，而在相同的条件下，即使加入的大量的干冰，K2EDTA抗凝管也无法顺利保存及稳定血液中的cfRNA。
综上所述，本发明提供的液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂及其采血管，能够运用一步法进行相关样品的快速分离，能够有效保存胎儿游离核酸，防止循环肿瘤核酸交联性损伤并保证野生型基因的完整性，防止细胞裂解及其血液基因组核酸的释放，实现癌症患者的血样中的循环肿瘤细胞、淋巴细胞以及循环肿瘤核酸的常温保存与运输。
序列表
<110> 云南仁桥医疗科技有限公司
<120> 液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂及其采血管
<130> GAI17CN0491
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
cgaatgtctg ccctatcaac 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gtttctcagg cccctctcc 19

Claims (10)

1.一种液体活检血液中循环肿瘤核酸和细胞的稳定剂，以重量份计，该稳定剂包括20-100份的防腐剂、5-50份的抗氧化剂、1-35份的抗凝剂、5-20份的pH稳定剂、5-20份的酶抑制剂、0.1-10份的细胞凋亡抑制剂、5-25份的自由基捕获剂和1-10份的代谢抑制剂。
2.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于：所述防腐剂包括利福平、鱼精蛋白、壳聚糖、果胶分解物、三氯叔丁醇、羧甲纤维素、聚山梨酯、山梨酸、羟苯乙酯和石墨烯纳米抗菌材料中的一种或多种的组合；
优选地，所述防腐剂为由利福平、鱼精蛋白、壳聚糖和羟苯乙酯所组成的组合物，其中：利福平、鱼精蛋白、壳聚糖和羟苯乙酯质量比为(1-2)：(3-5)：(2-10)：(5-10)；
优选地，所述石墨烯纳米抗菌材料制备方法为：利用水热法培养石墨烯纳米材料，并将1g石墨烯纳米材料溶于50mL超纯水中并超声分散，得到分散液；然后向分散液中加入20g-50g的十八烷基二甲基三甲氧基硅烷基丙基氯化铵，超声震荡48h、水浴5h、搅拌反应10h、过滤、洗涤、干燥得到石墨烯纳米抗菌材料。
3.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于：所述抗氧化剂包括维生素C、虾青素、类胡萝卜素、特丁基对苯二酚、二丁基羟基甲苯、二叔丁基羟基甲苯和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯中的一种或多种的组合；
优选地，所述抗氧化剂为由维生素C、虾青素、类胡萝卜素和特丁基对苯二酚所组成的组合物，其中：维生素C、虾青素、类胡萝卜素和特丁基对苯二酚质量比为(1-5)：(2-5)：(3-10)：(1-5)。
4.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于：所述抗凝剂包括草酸钾、肝素、氯化钠、二乙胺四乙酸钾盐和枸橼酸钠中的一种或多种的组合；
优选地，所述抗凝剂为二乙胺四乙酸钾盐。
5.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于：所述pH稳定剂包括Tris-HCl缓冲液和/或柠檬酸。
6.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于：所述酶抑制剂包括二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、巯基乙醇和亚硫酸氢钠中的一种或多种的组合。
7.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于：所述细胞凋亡抑制剂包括Q-VD-OPh。
8.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于，所述自由基捕获剂的制备方法包括以下步骤：
以多元胺作为引发剂，加入有机溶剂、催化剂和开环材料，进行开环聚合，得到产物A；
将产物A用乙醚提纯，然后用反向硅胶柱进一步提纯，得到产物B；
将产物B溶于有机溶剂中，加入催化剂和开环材料，进行开环聚合，并采用乙醚和反向硅胶柱依次提纯产物，得到两亲性多臂星形聚合物；
将纳米材料溶于超纯水中超声，然后加入氨水及硅化剂进行硅基化修饰，分离得到产物C，将产物C用氨基酸进行包被，得到产物D；
取产物D、两亲性多臂星形聚合物，加入N-羟基琥珀酰亚胺进行端基修饰反应，得到自由基捕获剂；
优选地，所述开环材料包括己内酯、丙交酯、乙烯亚胺、环氧乙烷、谷氨酸和赖氨酸中的一种或多种的组合；
优选地，所述催化剂包括辛酸亚锡和/或氯化锌；
优选地，所述多元胺包括三乙烯四胺、乙二胺、二乙烯三胺和四亚乙基五胺中的一种或多种的组合；
优选地，所述有机溶剂包括二氯甲烷或二甲基亚砜；
优选地，所述氨基酸包括赖氨酸、丝氨酸和异亮氨酸中的一种或多种的组合；
优选地，所述两亲性多臂星形聚合物结构式包括-N-(PLGA-PCL)n-、-N-(PGA-PCL)n-、-N-(PEI-PCL)n-和-N-(DPHAL-PLGA)n-中的一种或多种的组合；其中，n取值2,4,6或8，DPHAL为多聚赖氨酸；
优选地，所述纳米材料包括羟基磷灰石纳米颗粒、中孔硅纳米颗粒和金纳米颗粒中的一种或多种的组合；
优选地，所述纳米材料粒径为20nm-1000nm。
9.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于：所述代谢抑制剂包括氨基葡萄糖盐酸盐、甘油醛、金精三羧酸、腺嘌呤、腺苷和磷酸二氢钠中的一种或多种的组合；
优选地，所述代谢抑制剂为氨基葡萄糖盐酸盐、甘油醛和金精三羧酸的组合。
10.一种真空采血管，其特征在于：所述真空采血管中装载有权利要求1-9任一项所述的稳定剂。
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