RU2558927C1 - Способ специфической детекции microsporum canis в клиническом материале при различных клинических формах заболевания - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области медицины и предназначено для детекции гриба Microsporum canis. Осуществляют выделение тотальной нативной ДНК из образца кожи и волос, проводят полимеразную цепную реакцию и амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Microsporum canis с использованием специфических праймеров. При электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. определяют наличие возбудителя. Изобретение обеспечивает специфическую детекцию Microsporum canis в клиническом материале и может быть использовано для диагностики микроспории. 2 пр.

Description

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, лабораторной микологии и дерматовенерологии, и может быть использовано для диагностики микроспории.

Дерматомикозы относятся к числу наиболее распространенных инфекций человека. Микроспория по распространенности занимает второе место после микозов стоп. Заболеваемость на территории РФ в 2009 году составила 45,2 на 100 тыс. населения, с максимумом среди детского населения (243,6⁰/₀₀₀₀). Имеются региональные отличия, обусловленные в определенной мере, как особенностями среды обитания на конкретных территориях, так и существенными отличиями качества диагностики, зачастую не позволяющими выявить стертые и атипичные их формы, которые являются причиной многочисленных диагностических ошибок [Степанова Ж.В. Клинические особенности и лечение микроспории в современных условиях / Ж.В. Степанова // Вестник дерматологии и венерологии. - 2008. - №6. - С. 85-88; High prevalence of tinea capitis in newly arrived migrants at an English-language school, Melbourne, 2005 / M.E. McPherson [et al.] // Med.J. Aust. - 2008. - Vol. 189, N 1. - P. 13-16.].

Их число в последние десятилетия существенно нарастает, чему способствует низкая чувствительность культурального метода диагностики микроспории и дерматофитий вообще, составляющая лишь 40-70% [Иванова, M.А. Грибковые заболевания кожи в Амурской области и других субъектах Российской Федерации, 2008-2009 гг. [Электронный ресурс] / M.А. Иванова, А.В. Гречко, Н.E. Мельниченко // Социальные аспекты здоровья населения: электронный научный журнал. - 2010. - №15. - Режим доступа: http://vestnik.mednet.ru; Малишевская, Н.П. Современные особенности эпидемиологии, клиники и лечения микроспории / Н.П. Малишевская, С.Н. Нестеров // Лечащий врач. - 2006. - №1. - С.90-92; Щелкунова О.А. Клинико-эпидемиологические особенности микроспории и трихофитии, подходы к лечению: дис. канд. мед. наук: 14.01.10 / О.А. Щелкунова. Новосибирск, гос. медицинский ун-т. - Новосибирск, 2013. - 18 с.; Исаева Т.И. Клинико-эпидемиологические и медико-социальные аспекты микроспории в различных климато-географических условиях: автореф. дис. …канд. мед. наук / Т.И. Исаева// М., 2009. - 25 с.; Иванова Ю.А. Клинико-микологический профиль поверхностных микозов в Алтайском краевом кожно-венерологическом диспансере / Ю.А. Иванова О.В. Райденко // Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т. 14, №3. - С. 38-42.].

При подозрении на микроспорию основным методом лабораторной диагностики, как и при других дерматофитиях, является обнаружение возбудителя в исследуемом материале (частички кожи и волосы) [Микроспория в Краснодарском крае / В.В. Пархоменко [и др.] // Кубанский Научный медицинский вестник - 2011. - №2 (125). - С. 127-130]. Для этого в настоящее время применяются следующие методики [Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие. Том 3.1 Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Лабора, 2009. - 880 с.]:

1. Микроскопия клинического материала - метод предварительной диагностики заболевания. В случаях отсутствия роста возбудителя в культуре положительный результат прямой микроскопии является единственным подтверждением микотической инфекции. Патологический материал изучают в нативных препаратах. Для просветления препаратов, т.е. для растворения роговых масс, используют 20% раствор едкой щелочи (КОН или NaOH).

2. Культуральный метод исследования до сих пор остается предпочтительным методом диагностики микозов. Осуществляется для окончательного уточнения диагноза и выяснения эпидемиологии. Он включает получение культуры гриба с последующим микроскопическим исследованием. По внешнему виду колоний на чашках Петри можно составить представление о роде возбудителя (Microsporum), его виде (Microsporum canis). Окончательное уточнение рода и вида гриба возможно только на основании микроскопического исследования полученной культуры.

3. При отборе материала также используют ультрафиолетовую лампу Вуда. Пораженные волосы светятся в ее лучах голубовато-зеленым цветом. Этот метод позволяет обнаружить волосы, пораженные микроспорумом, причем даже такие отдельные волоски, поражение которых обычно трудно уловить.

Однако все используемые методы имеют ряд существенных недостатков:

1. Микроскопия клинического материала не позволяет идентифицировать грибы в патологическом материале до вида по их морфологии. Кроме того, чувствительность этого метода недостаточна.

2. Культуральный метод исследования является очень трудоемким и занимает от 5 до 14 дней. Несмотря на то, что специфичность этого метода значительно выше, чем при микроскопии клинического материала, чувствительность этого метода тоже недостаточна.

3. Несмотря на то, что метод с использованием ультрафиолетовой лампы Вуда считается эффективным при массовых обследованиях, лечение противогрибковыми мазями приводит к прекращению свечения, которое возобновляется только через 3-4 дня после тщательного мытья волос. Следовательно, использование этого метода приводит к получению большого числа ложноотрицательных результатов.

Эффективность перечисленных методов лабораторной диагностики не в полной мере отражает истинную ситуацию по заболеваемости микроспорией. Следовательно, для формирования наиболее объективных представлений о масштабах ее распространения, необходимо широкое внедрение в практику здравоохранения и ветеринарной службы молекулярно-генетических методов диагностики, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую отличает исключительно высокая чувствительность и специфичность, что позволит выявлять Microsporum canis в клиническом материале при различных формах заболевания и, в особенности, - при стертых и атипичных формах.

Известен способ диагностики дерматомикозов, заключающийся в том, что диагностику дерматомикозов осуществляют путем высева дерматофитов из клинического материала на плотную селективную среду Сабуро с добавлением антибиотика - левомицетина и гидролизата кератина, полученного из куриного пера. Питательная среда для выделения дерматофитов имеет следующий состав, г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар - 18,0-20,0; гидролизат кератина (в пересчете на сухое вещество) - 10,0-20,0; левомицетин - 50000 ЕД; дистиллированная вода - остальное. Посев инкубируют при температуре 22-24°C в течение 4-8 дней с последующей идентификацией вида колоний. Способ наиболее эффективен при выделении из материала от больных культур грибов-дерматофитов, в частности Microsporum canis, Trichophyton vermcosum, Trichophyton mentagrophytes var. gypseum, Trichophyton rubrum [патент RU №2275631, 2006 г.].

Прототипом предлагаемого изобретения является способ диагностики онихомикоза кистей и стоп, сущность которого заключается в том, что грибок Trichophyton rubrum идентифицируют методом ПЦР, для чего выделяют ДНК из образца кожи или ногтевых пластинок, при этом для выделения ДНК образец инкубируют в 2-4 М растворе щелочи не менее 1 ч при температуре 50-65°C, нейтрализуют раствор 30%-ной соляной кислотой, переосаждают образец в 50%-ном растворе этанола при температуре минус 10 - минус 20°C и высушивают при температуре 50-65°C; проводят ПЦР ДНК с применением высокоспецифичных для гена 28 S РНК Trichophyton rubrum синтетических ДНК-зондов, имеющих последовательность: TR-1-F (смысловой): 5' atcgaatctttgaacgcaca 3'; TR-1-R (антисмысловой): 5' tataaagattggggccaggg 3' и при положительном результате диагностируют онихомикоз, вызванный грибком Trichophyton rubrum [патент RU №2319962, 2008 г.].

Задачей изобретения является разработка высокоспецифичного и высокочувствительного способа детекции Microsporum canis при различных формах заболевания и, в особенности, при стертых и атипичных формах.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности лабораторной диагностики микроспории у человека за счет достоверного обнаружения мицелия и спор Microsporum canis вне зависимости от вида исследуемого клинического материала и формы заболевания.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе детекции Microsporum canis, включающем выделение тотальной нативной ДНК из клинического материала, представляющего образец кожи, проведение полимеразной цепной реакции, согласно изобретению в качестве клинического материала дополнительно используют волосы, проводят специфическую амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Microsporum canis с использованием праймеров следующей структуры:

5' TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAA 3',

5' GGTCCTGGAGGCGATGGTATGTC 3' и при электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. определяют наличие возбудителя.

Предлагаемый способ детекции Microsporum canis осуществляется следующим образом. Из клинического материала (частички кожи и волосы) выделяют тотальную нативную ДНК, после чего проводят специфическую амплификацию (ПЦР) фрагмента гена 5.8S рибосомальной РНК (рРНК) Microsporum canis с использованием праймеров следующей структуры:

5' TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAA 3',

5' GGTCCTGGAGGCGATGGTATGTC 3'.

При электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. констатируют факт присутствия возбудителя в клиническом материале и подтверждают соответствующий диагноз.

ДНК выделяют из клинического материала (частички кожи и волосы). Для обеспечения необходимой степени чистоты ДНК и достаточного ее количества используют методику Boom R. [Boom R., et al. 1990. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. J.Clin.Microbiol. 28: 495-503]:

1. В пробирку с 300 мкл лизирующего раствора (5М гуанидинтиоционат, 1% Triton X100) вносится 1 грамм исследуемого материала. Проба тщательно перемешивается на вортексе и прогревается 5 мин при температуре 65°C. Центрифугировали 5 сек при 5 тыс.об/мин на микроцентрифуге. Когда проба растворялась не полностью, пробирку центрифугировали на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс.об/мин. Надосадочная жидкость переносится в новую чистую пробирку.

2. Отдельным наконечником в пробирку вносят 25 мкл ресуспендированного сорбента (силикагель, SiO₂). Перемешивают на вортексе, ставят в штатив на 2 мин, еще раз перемешивают и оставляют в штативе на 5 мин.

3. Сорбент осаждается центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 сек. Надосадочная жидкость удаляется с использованием вакуумного отсасывателя.

4. Далее в пробирку с сорбентом вносится 300 мкл раствора для отмывки (5М гуанидинтиоционат). Образовавшуюся смесь тщательно ресуспендируют на вортексе.

5. Сорбент осаждается центрифугированием при 5 тыс.об/мин на микроцентрифуге в течение 30 сек. Надосадочная жидкость удаляется, с помощью вакуумного отсасывателя и чистого наконечника.

6. Добавляется 950 мкл отмывочного раствора (70% этиловый спирт). Сорбент ресуспендируют на вортексе, центрифугируют 30 сек при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Надосадочную жидкость удаляют, используя вакуумный отсасыватель и чистый наконечник.

7. Пробирку инкубируют при температуре 65°C 5-10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышка пробирки должна быть открыта. В пробирку после подсушки добавляется 50 мкл ТЕ-буфера (1 мМ EDTA, 10 мМ TRIS-HCl рН 8.0) для элюции ДНК. Перемешивается на вортексе. Для лучшей элюции пробирка инкубируется в термостате при температуре 65°C в течение 5 мин с периодическим встряхиванием на вортексе.

8. Далее сорбент осаждается центрифугированием при 12 тыс.об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость, содержащая очищенную ДНК, готова к постановке ПЦР.

Раствор ДНК можно хранить при температуре -18°C в течение 6 месяцев.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и амплификации нужного фрагмента гена 5.8S рРНК выявляемого при помощи подобранных нами праймеров следующей структуры:

5' TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAA 3',

5' GGTCCTGGAGGCGATGGTATGTC 3'.

Амплификацию специфичного фрагмента гена 5.8S рРНК проводят в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 1 мкл тотальной ДНК, 3 мкл 10-кратного буфера для Taq-полимеразы, по 1 мкл каждого праймера, 3 мкл dNTP, и 1 мкл Taq-полимеразы.

Режим амплификации следующий: начальная денатурация при 94°C в течение 2 мин; 25 циклов, включая денатурацию при 94°C - 20 сек, отжиг праймеров и синтез ДНК при 64°C - 20 сек.; элонгация при 72°C - 10 сек; терминальная элонгация - 1 мин.

Амплифицированные фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и после окрашивания геля бромидом этидия идентифицируют в ультрафиолетовом свете. В качестве электролита для электрофореза применяют 0,5 X боратный буфер (0,089 М трис-HCl, рН=7,9; 0,089 М борная кислота, 0,002 ЭДТА, рН=8,0).

Электрофорез проводят при постоянном напряжении 100 В. Детекцию результатов проводят путем окрашивания агарозного геля бромистым этидием в течение 10-15 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Продукт амплификации размером 182 п.н. обнаруживается в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Больной А., 5 лет, поступил с жалобами на высыпания на волосистой части головы, сопровождающиеся зудом.

Анамнез: Заболевание заметили родители 10 дней назад. Лечился самостоятельно йодом, без улучшения. Заразился от котенка.

Status localis: На коже волосистой части головы на гиперемированном и инфильтрированном фоне имеется крупный очаг размером 6×5,5 см в диаметре, округлой формы, четко отграниченный от здоровой кожи, розовато-красного цвета, покрытый толстым слоем серозно-гнойных чешуек и корок, масса пустул. В пределах пораженного участка волосы обломаны на уровне 5-6 мм.

Результаты лабораторных исследований:

OAK лейкоциты - 6,0×10⁹/л, СОЭ 15 мм/ч.

Микроскопия: Microsporum ectothrix.

Тест с использованием ультрафиолетовой лампы Вуда: голубовато-зеленое свечение обломков волос.

Посев: нет роста.

Результаты ПЦР: в клиническом материале (частички кожи и волосы) методом полимеразной цепной реакции обнаружены и идентифицированы специфичные для Microsporum canis фрагменты гена 5.8S рРНК.

Окончательный диагноз: Микроспория волосистой части головы (1 очаг).

Пример 2.

Больной Т., 16 лет, поступил с жалобами на высыпания на предплечьях, сопровождающиеся зудом.

Анамнез: Болен около 3 недель. Лечился самостоятельно йодом и 3% серной мазью, без улучшения. Заразился от кошки.

Status localis: Процесс поражения локализовался на предплечьях, где имелось 15 очагов, округлой формы, красновато-розового цвета, различной величины со склонностью к слиянию. Кожа очагов умеренно инфильтрирована, отечна, со значительной пустулизацией на поверхности, покрыта гнойными корками.

Результаты лабораторных исследований:

Микроскопия: С гладкой кожи споры не обнаружены. В пушковых волосах мицелий не обнаружен.

Тест с использованием ультрафиолетовой лампы Вуда: свечение отсутствует.

Посев: Microsporum canis.

Результаты ПЦР: в клиническом материале (частички кожи и волосы) методом полимеразной цепной реакции обнаружены и идентифицированы специфичные для Microsporum canis фрагменты гена 5.8S рРНК.

Окончательный диагноз: Распространенная микроспория гладкой кожи предплечий (15 очагов).

Таким образом, предлагаемый способ специфической детекции Microsporum canis в клиническом материале при различных формах заболевания, в отличие от микроскопического, культурального методов и теста с использованием ультрафиолетовой лампы Вуда позволяет выявлять и идентифицировать мицелий и споры Microsporum canis в доступном клиническом материале при различных формах заболевания (в особенности, при стертых и атипичных формах), что надежно коррелирует с результатами других исследований и, соответственно, обеспечивает единую интерпретацию данных.

Claims (1)

1. Способ детекции Microsporum canis, включающий выделение тотальной нативной ДНК из клинического материала, представляющего образец кожи, проведение полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что в качестве клинического материала дополнительно используют волосы, проводят специфическую амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Microsporum canis с использованием праймеров следующей структуры:
   5' TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAA 3',
   5' GGTCCTGGAGGCGATGGTATGTC 3' и при электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. определяют наличие возбудителя.