RU2695675C1 - Питательная среда для культивирования Microsporum canis - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для детекции гриба Microsporum canis, являющегося возбудителем микроспории. Предлагаемая питательная среда содержит глюкозу, пептон, агар, хитозан низкомолекулярный пищевой водорастворимый и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки выделения культуры М. canis из клинического материала от больных. 3 табл., 4 пр.

Description

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микологии, дерматовенерологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для выделения гриба Microsporum canis, являющегося возбудителем микроспории.

Микроспория - высококонтагиозное заболевание грибковой природы, наиболее распространенное в педиатрической практике, поражающее кожу и волосы [Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Грибковые инфекции. Руководство для врачей. 2 изд. - М.: Изд-во БИНОМ, 2008. - 480 с].

Известны питательные среды для выделения М. canis: сусло-агар, мясопептонно-глицериновый агар, среда Сабуро (с добавлением антибиотиков различных групп, пищевых и растительных ингредиентов) [Медицинская микология: руководство / В.А. Андреев, А.В. Зачиняева, А.В. Москалев, В.Б. Сбойчаков; под ред. В.Б. Сбойчакова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 208 с]. Ввиду содержания множества компонентов эти среды сложны в приготовлении.

Традиционным методом диагностики дерматомикозов, позволяющим определить вид гриба, остается культуральный посев на среду Сабуро. Среда Сабуро включает в себя: пептон - 10 г, глюкоза или мальтоза 40 г, агар - 18-20 г, дистиллированная вода - 1 л. Инкубация посевов проводится в течение 30 дней при температуре 28-30°С [Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. - Л.: Медицина, 1983. - 190 с].

Недостатком данной среды является то, что через 18-24 часа в ней происходит рост микрофлоры, чаще всего это бактерии рода Bacillus, которые образуют большие колонии, препятствующие росту грибов, что обуславливает добавление антибактериальных средств [Лещенко В.М. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний. - Медицина, 1982].

Наиболее близким аналогом изобретения является питательная среда для выделения дерматофитов, имеющая следующий состав, г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар - 18,0-20,0; гидролизат кератина (в пересчете на сухое вещество) - 10,0-20,0; левомицетин - 50000 ЕД; дистиллированная вода - остальное [патент RU 2275631, 2006 г.]. Недостатками прототипа являются трудоемкость получения гидролизата казеина и необходимость добавления антибиотика.

Задачей изобретения является создание эффективной и простой в приготовлении питательной среды для выделения культуры М. canis из материла больного.

Технический результат при использовании изобретения - сокращение сроков выделения культуры М. canis из клинического материала от больных.

Предлагаемая среда для выделения гриба Microsporum canis содержит: глюкоза - 40,0 г, пептон - 10,0 г, агар - 20,0 г, хитозан низкомолекулярный пищевой водорастворимый - 0,2 г и дистиллированная вода - 1 л.

В настоящее время известно более 70 направлений практического применения хитозана: в пищевой промышленности, виноделии, сельском хозяйстве, в фармакологии и медицине, в производстве косметических препаратов для ухода за кожей, средств для очистки и стабилизации воды [Чермит З.М., Агеева Н.М. О применении препаратов хитозана в пищевой промышленности // Плодоводство и виноградарство Юга России. - 2016. - №.39. - С. 192-208.].

Имеется ряд исследований, в которых хитозан добавляется в питательные среды с антибактериальной целью, в частности высокое антибактериальное действие оказывает на культуры бактерий Bacillus [Ильина А.В. и др. Получение и исследование моносахаридных производных низкомолекулярного хитозана // Прикладная биохимия и микробиология. - 2008. - Т. 44. - №.5. - С. 606-614], Pseudomonas aureofaciens, Enterobacter agglomerans, Bifidobacterium bifidum [Герасименко Д.В. и др. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40. - №.3. - С. 301-306], Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis [Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Хайруллин Р.З. Антибактериальная активность хитозана в отношении энтеробактерий и стафилококков, выделенных у пациентов с дисбактериозом кишечника // Казанский медицинский журнал. - 2010. - Т. 91. - №.5].

В литературе имеются данные о том, что именно низкомолекулярные образцы хитозана обладают наиболее выраженной антибактериальной активностью [Kumar В.A., Varadaraj М.С, Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosan-preparation with the aid of pepsin, characterization, and its bactericidal activity // Biomacromolecules. - 2007. - T. 8. - №.2. - C. 566-572].

Также хитозан обладет противогрибковым действием в концентрации 500 мкг/мл, практически полностью ингибируя рост некоторых мицелиальных грибов, в частности Penicillium tardum, Penicillium chrizogenum, Aspergillus flavus, Phoma betae, Cladosporium herbarum [Куликов С.H. и др. Фунгицидная активность хитозана в отношении мицелиальных грибов // Практическая медицина. - 2010. - №.1. - С. 119].

В доступной научно-медицинской и патентной литературе сведений об известности использования хитозана в питательной среде для выделения культуры М. Canis не обнаружено.

Обоснованием использования хитозана в предлагаемой питательной среде является то, что для грибов - дерматофитов кератин, содержащийся в коже и ее придатках, служит субстратом для питания [Воржева И.И., Черняк Б.А. Аллергия к дерматофитным грибам // аллергология. - 2004. - №.4. - С. 42-47]. В свою очередь, хитозан - аминополисахарид, близкий по своим функциональным свойствам к компонентам эпидермиса, в частности кератина, и дермы кожи [Бузинова Д.А. и др. Культивирование эпителиоподобных клеток на пленочных матриксах из хитозана // Гены и клетки. - 2011. - Т. 6. - №.1].

Способ получения предлагаемой питательной культуральной среды следующий: в 800 мл дистиллированной воды растворяли 20 г бактериологического агара. Через 30 минут добавляли 40 г глюкозы, 10 г мясного пептона и доводили смесь до кипения. Далее полученную смесь фильтровали. Затем добавляли 0,2 г хитозана низкомолекулярного пищевого водорастворимого, доливали 200 мл воды и тщательно перемешивали. Полученную среду стерилизовали 30 минут при 120°С. После стерилизации слегка остуженный субстрат разливали по пробиркам.

В исследовании использовали хитозан низкомолекулярный пищевой водорастворимый (ООО «Биопрогресс» г. Щелково), полученный из хитозана краба путем взаимодействия с янтарным ангидридом по запатентованной технологии.

В этот же день проводили посев исследуемого материала. Полученную питательную среду сравнивали с питательной средой с добавлением гидролизата кератина по скорости роста культуры.

Пример 1. Клинический материал (волосы из очага поражения) от больного микроспорией высевали в чашки Петри на питательную среду с гидролизатом кератина и в предлагаемую среду (табл. 1). В исследование включались больные микроспорией волосистой части головы, подтвержденной положительным результатом микроскопического исследования. Посевы выдерживали в термостате при температуре 20°С. Появление колоний и их развитие оценивали каждые 24 часа.

На предлагаемой культуральной среде рост М. canis отмечался на 1-2 сутки, идентифицировать культуру было возможно на 3-4 сутки. На питательной среде с гидролизатом кератина рост М. canis отмечался на 2-3 сутки, идентификация была возможна на 5-6 день.

Пример 2. Материал (волосы из очага поражения) от больного микроспорией высевали в чашки Петри на питательную среду с гидролизатом кератина и в предлагаемую культуральную среду. Культуральные посевы выдерживали в термостате при температуре 20°С. Появление колоний и их рост на предлагаемой культуральной среде происходило быстрее, чем на среде с гидролизатом кератина (табл. 2).

Пример 3. Клинический материал (волосы из очага поражения) от больных микроспорией высевали в чашки Петри на питательную среду с гидролизатом кератина и в предлагаемую среду. После посева 15 клинических образцов на предлагаемую среду, рост культуры М. canis был выявлен на седьмые сутки в 60% (9 образцов), в то время как после посева на среду с гидролизатом кератина 15 клинических образцов, рост наблюдался в 40% (6 образцов).

Пример 4. Клинический материал (волосы из очага поражения) от больных микроспорией высевали в чашки Петри на предлагаемую питательную среду с хитозаном низкомолекулярным пищевым водорастворимым в следующих концентрациях (мкг/мл): 100,0; 150,0; 200,0; 250,0; 300,0. Культуральные посевы выдерживали в термостате при температуре 20°С. Появление и развитие грибов оценивали каждые 24 часа. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее оптимальная концентрация хитозана низкомолекулярного пищевого водорастворимого в питательной среде должна быть 200 мкг/мл (табл. 3).

Таким образом, заявляемая питательная среда обладает следующими преимуществами: сокращение сроков выделения культуры М. canis, простота приготовления. Во всех случаях был достигнут указанный технический результат.

Claims (1)

1. Питательная среда для выделения гриба Microsporum canis из клинического материала от больных, содержащая глюкозу - 40,0 г; агар - 20,0 г; пептон - 10,0 г; дистиллированную воду - 1000 мл и источник кератина, отличающаяся тем, что в качестве источника кератина содержит хитозан низкомолекулярный пищевой водорастворимый в количестве 0,2 г.