CN110564864A - miR-6090作为γ射线辐射标志物的应用 - Google Patents

miR-6090作为γ射线辐射标志物的应用 Download PDF

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宋曼
周平坤
谢达菲
刘晓丹
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Abstract

本发明公开了miR‑6090作为γ射线辐射标志物的应用。本发明首先公开了检测miR‑6090表达量或相对表达量的系统在制备检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的产品中应用。本发明进一步公开了检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的产品。本发明对离体细胞和血液辐照后可检测到miR‑6090的表达增加，进一步通过实时荧光定量PCR法建立检测miR‑6090表达量或相对表达量的系统，与正常人进行比较，能检测到待测对象是否遭受γ射线辐射，及时进行事故救援和伤员处理，对γ射线辐射处理具有重要的意义。

Description

miR-6090作为γ射线辐射标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及miR-6090作为γ射线辐射标志物的应用。
背景技术
核灾难和核辐射事故中放射伤员的快速、准确诊断是事故救援和伤员正确后续处理的关键。目前，可用于检测是否遭受γ射线辐射的方法，包括细胞遗传学方法、生物物理学方法和分子生物学方法，其中遗传学方法中的外周血淋巴细胞非稳定性染色体畸形分析被公认为事故估算的“金标准”，在国内外的核事故处理中发挥了重要作用，但是这些方法因周期较长、工作量大以及对分析技术的要求较高，难以满足较大人群的突发事件快速估算。
因此，急需一种稳定、实验周期短、易于操作和分析的系统检测否遭受γ射线辐射。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何更精确、迅速和灵敏的检测或辅助检测待测对象是否遭受了γ射线的辐照。
本发明还提供了检测miR-6090表达量或相对表达量的系统在制备检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的产品中应用。
上述应用中，所述miR-6090是序列1所示的RNA。
上述应用中，所述检测miR-6090表达量或相对表达量的系统为下述任一种：
1)利用miRNA芯片技术检测所述miR-6090表达量或相对表达量的系统。
2)利用定量PCR检测所述miR-6090表达量或相对表达量的系统。
上述应用中，所述系统可包括引物和/或试剂和/或试剂盒和/或仪器。
具体的，所述利用定量PCR检测所述miR-6090的表达量或相对表达量的系统包括引物、探针、试剂盒和/或进行定量PCR所需的其他试剂和/或仪器。
通过定量PCR检测miR-6090的表达量或相对表达量的系统可包括扩增miR-6090的引物、探针、试剂盒和/或进行定量PCR所需的其他试剂和/或仪器。其中，所述扩增miR-6090的引物由序列2所示的单链DNA分子与序列3所述的单链DNA分子组成；所述探针如序列4所示的单链DNA分子。所述用于扩增miR-6090的引物、探针和进行定量PCR所需要的其它试剂均可独立包装。
上述应用中，所述检测miR-6090的表达量或相对表达量的系统还包括数据处理装置，所述数据处理装置用于将来自待测对象的所述miR-6090表达量或相对表达量转换为所述待测对象的检测结果。
上述应用中，所述数据处理装置包括数据输入模块、数据比较模块和结论输出模块；所述数据输入模块用于将待测对象的所述miR-6090表达量或相对表达量值输入；所述数据比较模块用于将待测对象的所述miR-6090表达量或相对表达量值与未遭受γ射线辐射的正常人进行比较；结论输出模块用于输出结论：若待测对象的miR-6090表达量或相对表达量大于未遭受γ射线辐射正常人的miR-6090表达量或相对表达量，则结论是待测对象遭受了γ射线辐射；若待测对象的miR-6090表达量或相对表达量小于或等于未遭受γ射线辐射正常人的miR-6090表达量或相对表达量，则结论是待测对象未遭受γ射线辐射。
上述应用中，所述miR-6090表达量或相对表达量为细胞或血液中miR-6090的表达量或相对表达量。具体的，所述miR-6090表达量或相对表达量为离体的外周血或淋巴母细胞或脐静脉内皮细胞中miR-6090的表达量或相对表达量。
以上述miR-6090作为标志物的检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的系统在制备检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的产品中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述应用中，所述检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的系统为上述检测miR-6090的表达量或相对表达量的系统。
本发明进一步提供了检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的产品。
本发明检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的产品为上述检测miR-6090表达量或相对表达量的系统。
本发明中，所述miR-6090的相对表达量值是所述miR-6090相对于U6的表达量。
在本发明中所述遭受γ射线辐射是指遭受钴60-γ射线辐射。
本发明对离体的外周血或淋巴母细胞或脐静脉内皮细胞辐射后，可检测到miR-6090的表达量增加，进一步通过实时荧光定量PCR法建立检测miR-6090表达量或相对表达量的系统，对待测对象的miR-6090表达量或相对表达量与未遭受γ射线辐射的正常人进行比较，能检测到待测对象是否遭受γ射线辐射，及时进行事故救援和伤员处理，对辐射处理具有重要的意义。
附图说明
图1为不同批次处理的人淋巴母细胞后检测miR-6090的相对表达量结果；其中，A为小剂量照射后miR-6090的相对表达量，各组不同照射时间的miRNA相对表达量都与0Gy比较，*p＜0.05，B为大剂量照射后miR-6090的相对表达量，各组不同照射时间的miRNA相对表达量都与0Gy比较，*p＜0.05。
图2为不同批次处理的人离体外周血后检测miR-6090的相对表达量，其中，A为小剂量照射后miR-6090的相对表达量，各组不同照射时间的miRNA相对表达量都与0Gy比较，*p＜0.05，B为大剂量照射后miR-6090的相对表达量，各组不同照射时间的miRNA相对表达量都与0Gy比较，*p＜0.05。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中用到的材料、试剂和试验技术的来源如下：
人的LC Sciences microRNA Microarray-Single基因表达谱芯片为杭州联川生物信息技术有限公司提供。
miRNA荧光定量检测试剂盒(Hairpin-itTMmicroRNA，探针法)为吉玛公司产品，货号为：E22007。
实施例1、用于辐射估算的miR-6090表达的发现
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)来源于ATCC细胞库，生长状态良好的HUVEC细胞给予4Gy钴60-γ射线照射后，在不同的时间点(0h，0.5h和2h)收获细胞，共3组总RNA样品进行miRNA芯片实验。miRNA芯片实验采用人的LC Sciences microRNA Microarray-Single基因表达谱芯片完成。
利用人的LC Sciences microRNA Microarray-Single基因表达谱芯片检测照射后的HUVEC细胞的总RNA，经检测后发现RNA质量完好，进行标记杂交试验。杂交芯片经扫描仪扫描，数据信号提取，LOWESS过滤进行归一化处理以及差异表达分析，比较照射前后miRNA的表达变化，结果显示表达上调的miRNA有82个，表达下调的miRNA有41个，经过比较筛选出上调比较明显的miR-6090(如表1所示)，即将miR-6090作为γ射线辐射检测的miRNA分子，miR-6090的核苷酸序列：5’-GGGGAGCGAGGGGCGGGGC-3’，通过检测miR-6090的表达量或相对表达量可以检测或辅助检测待测对象是否遭受γ射线辐射。
表1 HUVEC细胞照射后miRNA芯片分析结果
实施例2、在人淋巴母细胞(AHH-1)中进行miR-6090表达的验证
1、细胞培养：
AHH-1细胞为永生化的正常人淋巴母细胞，培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，置37℃、5％CO2培养箱中传代培养。
2、采用钴60γ射线照射：
传代培养后的AHH-1细胞给予钴60γ射线照射。
其中，所述钴60γ射线照射的照射条件为室温，小计剂量照射为0.5Gy和1Gy，大剂量照射为2Gy，4Gy，6Gy和8Gy，照射距离为4米，剂量率为66.66cGy/min。收取对照组(不照射组)细胞(标记为0Gy)，依次收取辐照后4、12和24小时的细胞(标记为4h、12h和24h)。
3、AHH-1细胞RNA的提取：
采用Trizol法提取细胞RNA，具体步骤如下：
1)收取10ml细胞混悬液，900g，离心3分钟，倒掉上清，4℃PBS缓冲液清洗细胞3遍。弃上清，加1ml Trizol，室温放置5分钟，使其充分裂解，吹打细胞至拉丝状，吸至1.5ml EP管中。
2)加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温放置5分钟。
3)4℃，12000g离心15分钟。
4)吸取上层水相至另一1.5ml无RNA酶EP管中。
5)再加入500μl异丙醇(沉淀RNA)，颠倒混匀，室温放置10分钟。
6)4℃，12000g离心10分钟，倒掉上清，RNA沉于管底。
7)加入1ml 75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀。
8)4℃，12000g离心5分钟，倒掉上清，吸干残留，扣在位置上。
9)室温晾干10分钟。
10)用20μl无RNA酶水溶解沉淀。
11)测OD值，用超微量分光光度计测定总RNA浓度，以A260nm/A280nm比值评估纯度，定量RNA浓度。
12)将RNA浓度调整到500ng/μl，按10ul每EP管分装，冻于-80℃冰箱。
4、AHH-1细胞总RNA逆转录为cDNA：
逆转录所用的试剂盒为Hairpin-itTMmicroRNA，具体步骤如下：
1)从试剂盒中取出各组分放于冰上溶化，混匀溶化后的各组分并短暂离心后放于冰上备用。
2)在200μl无RNase的进口PCR管中配制，逆转录反应体系如表2所示；miR-6090和内参U6的逆转录引物序列如表3所示。
表2 逆转录反应体系(20μl)
表3 逆转录引物序列
3)逆转录反应，逆转录的反应程序如表4所示：
表4 逆转录的反应程序
4)逆转录反应85℃5分钟结束后立即将cDNA产物取出，快速置冰上冷却，后续所有步骤都在冰上进行，不要将cDNA产物随便从冰上移走。
5、实时荧光定量PCR反应
为了确定提取出的总RNA中有miRNA存在，选用U6snRNA为内参，利用实时荧光定量PCR的方法对总RNA中的miRNA进行检测，实时定量PCR所用的试剂盒为miRNA荧光定量检测试剂盒(Hairpin-itTMmicroRNA，探针法)。
具体步骤如下：
1)将试剂盒中各组分从-20℃冰箱取出，放于冰上解冻，待融化后确保2×MasterMix、引物、模板完全溶解，所有试剂都在管底底部，使用前混匀并低速离心。
2)分别配制miR-6090和内参U6 snRNA的荧光定量PCR反应体系，所述实时定量PCR反应体系如表5所示，miR-6090及内参U6的实时定量PCR的探针如表6所示；
表5 实时定量PCR反应体系(20μl)
表6 实时荧光定量PCR引物序列
3)每个样品的每一种miRNA做三个重复的反应体系，即三组平行试验，将配置好的qPCR反应体系均匀分装于白色的八连管中，反应体系配制的过程中需在冰上进行，并关闭实验台中的日光灯以避光；
4)将分装到八连管中的反应体系轻轻混匀，短暂离心后，放置于PCR仪中，反应程序的如表7所示；
表7 实时定量PCR的反应程序
5)实时定量PCR反应完成后，保存实验数据进行分析，以2-ΔΔCt法计算出目的miR-6090的相对表达量。miR-6090在不同批次的AHH-1细胞中三次平均数据如图1所示，miR-6090在不同照射时间点(4h，12h，24h)以及不同的照射剂量(图1中A小剂量(0.5Gy和1Gy)；图1中B大剂量(2Gy，4Gy，6Gy和8Gy))分别与不照射(0Gy)比较均存在显著性的差异，说明通过检测AHH-1细胞中miR-6090的表达量或相对表达量可检测待测对象是否遭受γ射线的辐射，当待测对象的AHH-1细胞中miR-6090的表达量或相对表达量相对于未遭受γ射线辐射的正常人增加表明待测对象遭受γ射线的辐射。
实施例3、在人离体外周血中进行miR-6090表达的验证
1、人外周血采集与培养：6名正常青年志愿者(均在实验前签署知情同意书)，年龄20-30岁，近期无急性疾病感染史，无高血压、糖尿病、等慢性疾病史，无吸烟史，无化学毒物接触史，非从事放射相关工作的人员，一次抽取2管共20ml的外周血于抗凝管中。
2、钴60-γ射线照射：
给予外周血不同剂量的钴60-γ射线照射，把照射后的外周血转移至含有等体积血清培养基的25cm培养瓶中继续培养，倾斜45℃放置培养瓶，置于37℃、5％CO培养箱中继续培养直至收获。
其中，所述钴60γ射线照射的照射条件为室温，小计剂量照射为0.5Gy和1Gy，大剂量照射为2Gy，4Gy，6Gy和8Gy，照射距离为4米，剂量率为66.66cGy/min。收取对照组(不照射人群)血液(标记为0Gy)，依次收取辐照后4、12和24小时的细胞(标记为4h、12h和24h)。
3、人外周血RNA的提取：
采用QIAamp RNA Blood Mini Kit试剂盒提取外周血RNA，具体步骤如下：
1)将人抗凝外周血混匀，取1份的抗凝血液加入其体积5倍的Buffer EL混合，混合液体积应小于自备管体积的3/4；
2)将混合液混匀，冰上孵育10-15分钟，孵育过程中混匀2次，此过程中混合液会逐渐变清亮，显示红细胞被溶解，若有需要可延长孵育时间至20分钟；
3)4℃400g、离心10分钟，此时在离心管底可见细胞团形成，完全去除上清；
4)按照提取抗凝血量的2倍加入Buffer EL，垂悬细胞；
5)4℃、400g、离心10分钟，完全去除上清；
6)加入600μl的Buffer RLT垂悬上述沉淀物至无可见细胞团块，(使用前确保已加入β-Mercaptoethanol，1ml的Buffer RLT加入β-Mercaptoethano的量为10μl，混匀待用，室温可保存1个月)，此过程后，可将混合物保存于-70℃冰箱，解冻时于37℃水浴融化；
7)将上述混合物加入QIAshredder Spin column柱中，调整移液枪≥750μl，确保一步完成，以14000g离心2分钟，弃掉QIAshredder Spin column，保留均质化的混合液；
8)加入与Buffer RLT加入量等量的70％乙醇于均质化的混合液中，混匀，可见絮状沉淀形成；
9)小心吸出混合液，包括形成的沉淀，加至QIAamp Spin column柱中，≥10000g离心15秒，弃废液；
10)将QIAamp Spin column放置于一新的收集管中，加700μl Buffer RW1于QIAamp Spin column柱中，≥10000g离心15秒，洗涤，弃废液；
11)将QIAamp Spin column转移至一个新的收集管中，加500μl Buffer RPE(RPE使用前加4倍体积的无水乙醇)于柱中，≥10000g离心15秒，弃废液；
12)在QIAamp Spin column柱中，再次加入500μl Buffer RPE，14000g离心3分钟；
13)将QIAamp Spin column放于自备的1.5EP管中(无RNase、无菌处理)，14000g离心3分钟；
14)将QIAamp Spin column放于1.5EP管(已提供)中，30-50μl RNase-free水于QIAamp膜上，≥10000g离心1分钟，若提取RNA血量＞0.5ml，可将获得的RNA溶液再次加至柱上离心，以提高RNA浓度。
15)测OD值，用超微量分光光度计测定总RNA浓度，以A260nm/A280nm比值评估纯度，定量RNA浓度。
16)将RNA浓度调整到500ng/μ1，按10ul每EP管分装，冻于-80℃冰箱。
4、人的离体外周血RNA逆转录为cDNA：
逆转录所用的试剂盒为Hairpin-itTMmicroRNA，具体步骤如下：
(1)从试剂盒中取出各组分放于冰上溶解，混匀溶解后的各组分并短暂离心后放于冰上备用。
(2)在200μl无RNase的进口PCR管中配制反应体系，如表2所示；miR-6090miRNA的逆转录引物如表3所示。
(3)逆转录反应，逆转录的反应程序如表4所示：
(4)逆转录反应85℃5分钟结束后立即将cDNA产物取出，快速置冰上冷却，后续所以步骤都在冰上进行，不要将cDNA产物随便从冰上移走。
5、实时荧光定量PCR反应
为了确定提取出的总RNA中有miRNA存在，选用U6 snRNA为内参，利用实时荧光定量PCR的方法对总RNA中的miRNA进行检测，实时定量PCR所用的试剂盒为miRNA荧光定量检测试剂盒(探针法)。
具体步骤如下：
1)将试剂盒中各组分从-20℃冰箱取出，放于冰上解冻，待融化后确保2×MasterMix、引物、模板完全溶解，所有试剂都在管底底部，使用前混匀并低速离心。
2)分别配制miRNA和U6 snRNA 2个独立的荧光定量反应体系，所述实时定量PCR反应体系如表5所示；miR-6090和内参U6的实时定量PCR的引物如表6所示；
3)每个样品的每一种miRNA做三个重复的反应体系，即三组平行试验，将配置好的qPCR反应体系均匀分装于白色的八连管中，反应体系配制的过程中需在冰上进行，并关闭实验台中的日光灯以避光；
4)将分装到八连管中的反应体系轻轻混匀，短暂离心后，放置于PCR仪中，反应程序的如表7所示；
5)实时定量PCR反应完成后，保存实验数据进行分析，以2-ΔΔCt法计算出目的miR-6090的相对表达量。miR-6090在3批不同批次的人外周血后三次平均数据如图2所示，miR-6090在不同照射时间点(4h，12h，24h)以及不同照射剂量(图2中A小剂量(0.5Gy和1Gy)；图2中B大剂量(2Gy，4Gy，6Gy和8Gy))分别与不照射(0Gy)比较均存在显著性的差异，说明通过检测外周血中miR-6090表达量或相对表达量可检测待测对象是否遭受γ射线的辐射，当待测对象的外周血中miR-6090表达量或相对表达量相对于未遭受γ射线的辐射的正常人增加表明待测对象遭受γ射线的辐射。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> miR-6090作为γ射线辐射标志物的应用
<130> GNCFY191236
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggagcgag gggcggggc 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcctttggg gagcgagg 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatggttgtt cacgactcct tcac 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccctatccaa ccatacagac gcccc 25

Claims (10)

1.检测miR-6090表达量或相对表达量的系统在制备检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的产品中应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测miR-6090表达量或相对表达量的系统为利用miRNA芯片技术检测所述miR-6090表达量或相对表达量的系统。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测miR-6090表达量或相对表达量的系统为利用定量PCR检测所述miR-6090表达量或相对表达量的系统。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述利用定量PCR检测所述miRNA的表达量或相对表达量的系统包括引物、探针、试剂盒和/或进行定量PCR所需的其他试剂和/或仪器。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述检测miRNA表达量或相对表达量的系统还包括数据处理装置，所述数据处理装置用于将来自待测对象的所述miRNA表达量或相对表达量转换为所述待测对象的检测结果。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述miR-6090表达量或相对表达量为细胞或血液中miR-6090的表达量或相对表达量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述miR-6090表达量或相对表达量为离体的外周血或淋巴母细胞或脐静脉内皮细胞中miR-6090的表达量或相对表达量。
8.以权利要求1中所述miR-6090作为标志物的检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的系统在制备检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的系统为权利要求1-7中任一所述的检测miR-6090表达量或相对表达量的系统。
10.检测或辅助检测是否遭受γ射线辐射的产品，其特征在于：所述产品为权利要求1-7中任一所述的检测miR-6090表达量或相对表达量的系统。
CN201910903428.XA 2019-09-24 2019-09-24 miR-6090作为γ射线辐射标志物的应用 Pending CN110564864A (zh)

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