CN108866046A - 一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法 - Google Patents

一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108866046A
CN108866046A CN201810824552.2A CN201810824552A CN108866046A CN 108866046 A CN108866046 A CN 108866046A CN 201810824552 A CN201810824552 A CN 201810824552A CN 108866046 A CN108866046 A CN 108866046A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
nucleic acid
excretion body
5min
purification column
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810824552.2A
Other languages
English (en)
Inventor
赵�卓
李萍
张绍峰
康伟
苏加忱
李淑君
马南
王绍成
吕志
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liaoning Base Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Liaoning Base Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liaoning Base Biotechnology Co Ltd filed Critical Liaoning Base Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201810824552.2A priority Critical patent/CN108866046A/zh
Publication of CN108866046A publication Critical patent/CN108866046A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物检测技术领域,是一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法。利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态；利用样本平衡液预处理样本；将上述处理后样本加入至上述活化的羟基磷灰石纯化柱进行分离纯化外泌体及游离核酸；利用洗涤液洗涤羟基磷灰石纯化柱，再用不用浓度的洗脱液分别洗脱样品中的外泌体和/或游离核酸。本发明方法操作简单易行、成本低，可快速高效地获得高纯度的外泌体及核酸，且该方法外泌体及核酸与羟基磷灰石吸附温和，便于外泌体、核酸各类相关的下游试验，同时，该方法可以简单快速获得去除90％外泌体的血清，具有很好的应用前景。

Description

一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,是一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法。
背景技术
外泌体(exosomes)是一种含有复杂的蛋白质、脂质和核酸等活性生物分子的具有质膜双分子层结构的微囊泡，直径约为30-150nm，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。随着对其研究的不断深入，包括对其生物来源、分布、物质构成及运输和细胞间信号传导的研究，发现外泌体具有多种不同的功能。外泌体的功能根据来源细胞类型的不同，可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。有研究发现被疱疹病毒潜伏感染的细胞通过外泌体选择性释放和转移RNA可触发树突状细胞抗病毒免疫反应(Baglio S.R,et al.(2016)Sensing of latent EBV infectionthrough exosomal transfer of 5'pppRNA.Proc Natl Acad Sci USA 113(5):587–596.)。另研究发现肿瘤细胞转移到脑部后可以被神经胶质细胞分泌的外泌体所改造，其外泌体内部携带的大量的miRNA可以靶向肿瘤细胞内的mRNA从而影响肿瘤细胞内蛋白水平，进而促进肿瘤细胞的增殖，提升肿瘤细胞的抗凋亡能力(Zhang L,et al.(2015)Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brainmetastasis outgrowth.Nature 527(7576):100-104.)。
建立有效的从细胞培养液或生物体液分离外泌体的方法，可以让研究者更好地开展外泌体的相关研究。超速离心是分离外泌体常见且有效的方式，并且可以选用密度梯度离心法得到纯度更高的外泌体。但是，由于该方法耗时长，且仪器设备昂贵，限制了该方法的应用。
循环游离核酸(cf NA)是一种细胞外游离状态的核酸，细胞通过主动分泌、损伤破裂、凋亡、坏死等多种方式将核酸释放到体液中。cf NA主要包括cfDNA和cfRNA，cfDNA部分仍具有双螺旋结构，部分则与蛋白质及RNA共同形成复合体，而cfRNA则多与蛋白结合，以免于体液中RNase的降解。大量研究表明游离核酸与肿瘤、妊娠相关性疾病、自身免疫疾病、移植排斥反应、创伤急救医学等有紧密联系。有研究对结直肠癌发生转移的患者中的cfDNA水平进行了分析，通过cfDNA可以检测到具有临床意义的KRAS基因突变，检出率为87.2％，特异性达到了99.2％，而患者循环游离DNA的浓度也相应升高，且发现浓度升高与基因突变检出率呈正相关(Kuo Y B,et al.(2014)Comparison of KRAS mutation analysis ofprimary tumors and matched circulating cell-free DNA in plasmas of patientswith colorectal cancer.Clin Chim Acta 433(10):284-289)。另外Porreco等通过母体cfDNA检测胎儿染色体非整倍体疾病(如21-三体，18-三体和13-三体)，由于可以直接检测到胎儿的染色体，与传统的生物标记物相比，检出率有很大幅度的提高，准确率已经可以达到99％，而假阳性率低于1％(Porreco R P,et al.(2014)Noninvasive prenatalscreening for fetal trisomies 21,18,13 and the common sex chromosomeaneuploidies from maternal blood using massively parallel genomic sequencingof DNA.American J of obstetrics gynecology 211(6):711-712.)。目前，无创产前诊断方法已成为临床研究的新趋势。因此循环游离核酸检测在疾病早期诊断、分期、治疗监测、预后判断及产前基因诊断的多个方面有重要意义。
利用游离核酸进行的肿瘤检测或产前筛查，首先要进行游离核酸的提取纯化。循环核酸的提取方法日渐增多，主要包括酚氯仿抽提，硅胶柱分离和磁珠法分离。酚氯仿法虽然抽提成本低，但是对于提取游离核酸来说效率低，操作复杂，提取过程中使用对人体有害的有机溶剂，另外操作过程中需要多次高速离心，难以实现自动化。柱提取方法，操作相对简单且不需要使用毒性较大的有机溶剂，但操作过程中仍然需要进行高速离心，同时提取效率较低，难以实现自动化。磁珠法操作简便、快速，获得的核酸纯度较高，目前已有多家公司开发出配套的自动化系统，可以有效地提高工作效率，但该方法成本相对比较高。因此迫切需要开发操作简便、稳定高效、低成本的游离核酸提取试剂盒。
发明内容
本发明目的在于提供一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种同时分离、纯化外泌体和/或游离核酸的方法，
S1.利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态；
S2.利用样本平衡液预处理样本；
S3.将上述处理后样本加入至上述活化的羟基磷灰石纯化柱进行分离纯化外泌体及游离核酸；
S4.利用洗涤液洗涤羟基磷灰石纯化柱，再用不用浓度的洗脱液分别洗脱样品中的外泌体和/或游离核酸。
所述羟基磷灰石纯化柱中羟基磷灰石用量为10-100mg，并经柱平衡液对其进行活化，其中，柱平衡液为1-10mM Na3PO4，pH为6.5-7.5。
所述样本处理为将样本上清液与样本平衡液等体积混匀。
所述样本平衡液液为50-500mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5，即可同时或分别分离、纯化外泌体及游离核酸。
其中，当实验目的为分离外泌体时平衡液为：50-200mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA；pH为6.5-7.5；
当实验目的为分离核酸时平衡液为：200-500mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA；pH为6.5-7.5；
当实验目的为同时分离外泌体及游离核酸时平衡液为：50-100mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA；pH为6.5-7.5。
所述步骤S3为将步骤S2处理后样本加入步骤S1平衡后的羟基磷灰石纯化柱，室温孵育10-60min后，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，弃滤液。
所述样本为细胞培养液或生物体液；
其中，当样本为细胞培养液预处理为：细胞培养液在4℃，12000g离心20min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡；
当样本为生物体液预处理为：生物体液在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。
所述步骤S4将洗涤液加入纯化柱中，孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，弃滤液,重复一次。
洗涤液为1-10mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，200mM-1M NaCl，pH为6.5-7.5。
所述经洗涤后纯化柱用含50-200mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA,pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度外泌体；
所述洗涤后用含200-500mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度游离核酸；
所述洗涤后先用含50-200mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度外泌体；再用含200-500mMNa3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度游离核酸，即可同时分离纯化外泌体和游离核酸。
所述分离、纯化外泌体和/或游离核酸方法可用于制备无外泌体血清。
本发明可具有以下效果：可以同时简单、快速的获得大量、高纯度外泌体、核酸，同时也提供了一种简单便捷的无外泌体血清的制备方法，便于体液及细胞培养液中相关外泌体和核酸的下游研究。
附图说明
图1为本发明所述的实例1蛋白电泳图。
图2为本发明所述的实例1电镜图。
图3为本发明所述的实例2DNA检测图。
图4为本发明所述的实例3RNA检测图。
图5为本发明所述的实例3电镜图。
图6为本发明所述的实例4细胞存活率柱形图。
图7为本发明所述的实例4miRNA检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，其中羟基磷灰石为BioRad(CHTⅡ型)。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均可从商业途径得到。
下述实施例的记载烦请进一步核实有描述不清楚的地方。
实施例1
从体液及细胞培养液中分离纯化总的外泌体的方法：
1.柱平衡：
取100μl含10mM Na3PO4，pH7.2柱平衡液加入到羟基磷灰石纯化柱中，室温放置1min，5000rpm离心30S备用；
2.样本预处理
取1个冷冻的血浆样本,1个冷冻的血清样本(分别标记为样本A,B)于室温下解冻，在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。另取1细胞培养液(标记为样本C)，在4℃，12000g离心20min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。
3.样本平衡
取200μl上述处理后各样本，分别加入200μl样本平衡液，其中样本平衡液为100mMNa3PO4，2mM EDTA，pH为6.8，吹打混匀后再分别加入羟基磷灰石纯化柱中，室温静置10min，4℃，5000rpm，离心1min，弃滤液。
4.洗涤
取500μl洗涤液加入上述上样后的羟基磷灰石纯化柱中，室温静置1min，4℃，5000rpm，离心1min，弃滤液，该步骤重复一次；其中，洗涤液为5mM Na3PO4，1mM EDTA，500mMNaCl，pH为6.8。
5.洗脱
取100μL洗脱液加到上述洗涤后羟基磷灰石纯化柱中，室温静置2min，4℃，5000rpm，离心1min，滤液即为外泌体溶液(分别记为A’,B’,C’)；其中，洗脱液为200mMNa3PO4，1mM EDTA，pH为6.8。
6.蛋白检测：
用8％SDS-PAGE配置胶检测其处理后样品中的蛋白含量及分布：各样品(A、B、C、A’、B’、C’)用无菌水稀释10倍后分别取20μL于0.5mL离心管中，再分别加入5x上样缓冲液(loading buffer)5μL，移液器反复吹打混合均匀，于100℃加热煮沸10min，待冷却至室温后，分别取20μL加入预先配置好的8％SDS-PAGE胶胶孔中，进行电泳。浓缩胶使用80V恒压30min，分离胶使用150V恒压40min。电泳结束后考马斯亮蓝染胶15min，在脱色液脱色过夜。结果如图1所示，提取后的外泌体溶液中蛋白质的含量减少显著，说明本发明方法提取的外泌体蛋白含量低，纯度高。
7.粒径检测
取100μl样本A’、B’、C’进行粒径检测(参见图2)。由图2可见样本A’粒径检测图，结合提取前后样本蛋白量的变化，及粒径可知所提取的外泌体纯度高且蛋白含量少。
实施例2
从体液及细胞培养液中提取游离核酸的方法
1.柱平衡：
取100μl含5mM Na3PO4，pH7.0的柱平衡液加入到羟基磷灰石纯化柱中，室温放置1min，5000rpm离心30S备用；
2.样本预处理
取1个冷冻的血清样本，2个冷冻的血浆(分别记为样本1、2,其中2号样本为肠癌患者血清)于室温下解冻，在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。另取1细胞培养液(标记为样本3)，在4℃，12000g离心20min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。
3.样本平衡
取200μl上述处理后各样本，加10μl 20mg/mL蛋白酶K(ProK)，58℃孵育15min，然后将入200μl样本平衡液，其中，样本平衡液为300mM Na3PO4，2mM EDTA，pH为7.2，吹打混匀后加入羟基磷灰石纯化柱中，室温静置10min，4℃，5000rpm，离心1min，弃滤液(滤液分别记为a，b，c)。
4.洗涤
取500μl洗涤液，加入上述上样后羟基磷灰石纯化柱中，室温静置1min，4℃，5000rpm，离心1min，弃滤液，该步骤重复一次，其中，洗涤液为10mM Na3PO4，1mM EDTA，500mMNaCl,pH为7.5，。
5.洗脱
取50μL洗脱液加到上述洗涤后羟基磷灰石纯化柱中，室温静置2min，4℃，5000rpm，离心1min，滤液即为核酸溶液(分别记为C-1,C-2,C-3)，其中，洗脱液为500mMNa3PO4，1mM EDTA，pH为7.5。
6.分别取上述步骤3中滤液a、b、c各100μl进行粒径检测。
7.对比实验
分别取400μl上述预处理后样本1、样本2和3样本，再用SBI The OriginalExoQuick提取外泌体，而后用420μl PBS重悬外泌体沉淀，取100μl重悬后外泌体进行粒径检测；沉淀外泌体后的上清取210μl用SBI XCFTM COMPLETE Exosome&cfDNA IsolationKit提取cfDNA(记为S-1，S-2，S3),另取210μl沉淀外泌体后的上清用天根血液总RNA提取试剂盒提取总cfRNA(记为T-1,T-2,T-3)，具体操作参照相关试剂盒中的说明书。
8.核酸检测
(1)DNA检测
以β-actin为代表检测上述步骤7中获得的DNA。体系中所用引物、探针序列见表1，每个PCR反应管中各组分按表2进行加入，盖好管盖，瞬时离心。将PCR反应管放入荧光定量PCR仪中，按对应顺序设置待测样本名称及阴性对照，选择FAM通道检测β-actin，PCR反应程序见表3。
表1
β-actin Forward primer 5’-AGT GTG ACT TTG TGG TGT GGC-3’
β-actin Reverse primer 5’-GCA CTC TGG GTA AGG ACA AGT-3’
β-actin Probe 5’-GAG GGT GAA CCC TGC AAA AGG GTG-3’
表2
反应液组分 反应液浓度 反应液加入量μl/管
模板 ---- 5
dNTP 10mM each 3.5
10x Buffer ---- 5
MgCl2 25mM 4
β-actin-Forward Primer 10mM 1
β-actin-Reverse Primer 10mM 1
β-actin-Probe 10mM 1
Hot Start DNA Polymerase 5U/μl 0.5
H2O ---- 29
表3
注：在58℃处检测荧光。
(2)RNA检测
以18S为代表检测上述步骤7中获得的RNA。体系中所用引物、探针序列见表4，每个PCR反应管中各组分按表5进行加入，盖好管盖，瞬时离心。将PCR反应管放入荧光定量PCR仪中，按对应顺序设置待测样本名称及阴性对照，选择FAM通道检测18S，PCR反应程序见表6。
表4
18S Forward primer 5’-ACC TGG TTG ATC CTG CCA GT-3’
18S Reverse primer 5’-CGA GCG ACC AAA GGA ACC AT-3’
18S Probe 5’-CGC ACG GCC GGT ACA GTG AA-3’
表5
反应液组分 反应液浓度 反应液加入量μl/管
模板 ---- 5
dNTP 10mM each 3.5
10x RT Buffer ---- 5
MgCl2 25mM 4
18S-Forward Primer 10mM 1
18S-Reverse Primer 10mM 1
18S-Probe 10mM 1
Hot Start DNA Polymerase 5U/μl 0.5
M-MLV Reverse Transcriptase 200U/μl 2
H2O ---- 27
表6
注：在58℃处检测荧光。
(3)miRNA检测
以miR-92a为代表检测上述步骤7中获得的MicroRNA。体系中所用引物、探针序列见表7，每个PCR反应管中各组分按表8进行加入，盖好管盖，瞬时离心。将PCR反应管放入荧光定量PCR仪中，按对应顺序设置待测样本名称及阴性对照，选择FAM通道检测MiR-92a，PCR反应程序见表9。
表7
表8
表9
注：在58℃处检测荧光。
9、结果分析
(1)粒径检测结果
上述提取核酸后的血清，外泌体的含量与对照试验中SBI试剂盒提取的外泌体含量都是1.3E+11particles/mL，说明本发明中提取循环游离核酸的方法，并没有破坏外泌体，所有核酸均来源于血清、血浆或细胞培养液中游离的核酸。
(2)DNA检测结果
对上述各样本cfDNA(C-1,C-2,C-3,S-1,S-2,S-3)qPCR的扩增曲线见图3，检测结果见表10；由图3和表10可见两种方法检测结果基本一致，说明本发明方法能有效提取血清、血浆及细胞培养液中游离的DNA。
表10
(3)RNA检测结果
对上述各样本cfRNA(C-1,C-2,C-3,T-1,T-2,T-3)RT-qPCR检测结果见表11，由表11可见两种方法检测结果基本一致，说明本发明方法能有效提取血清、血浆及细胞培养液中游离的RNA。
表11
(4)miRNA检测结果
对上述各样本cf miRNA(C-1,C-2,C-3,T-1,T-2,T-3)RT-qPCR检测结果见表12，由表12可见两种方法检测结果基本一致，说明本发明方法能有效提取血清、血浆及细胞培养液中游离的RNA。
表12
根据对3个样本核酸提取液中DNA、RNA及miRNA的检测，结果显示本发明方法利用羟基磷灰石上钙离子对核酸上的磷酸根离子的金属螯合作用，在不破坏外泌体的情况下，能同时提取体液或细胞培养液中游离的各种核酸。
实施例3
从体液中同时分离外泌体及游离核酸的方法
1.柱平衡：
取100μl柱平衡液-即10mM Na3PO4，pH7.0，加入到羟基磷灰石纯化柱中，室温放置1min，5000rpm离心30S备用；
2.样本预处理
取1冷冻的血清样本(记为样本1)于室温下解冻，在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。
3.样本平衡
取500μl上述处理后血清，加200μl 20mg/mL ProK，58℃孵育15min，然后将入500μl样本平衡液，吹打混匀后加入羟基磷灰石纯化柱中，室温静置10min，4℃，5000rpm，离心1min。取100μl滤液进行粒径检测(记为样本2)，剩余400μl滤液，取200μl用SBI XCFTMCOMPLETE Exosome&cfDNA Isolation Kit提取cfDNA(记为样本3)，取200μl用天根血液总RNA提取试剂盒提取总cfRNA(记为样本4)其中，样本平衡液为100mM Na3PO4，2mM EDTA，pH为7.2。
4.洗涤
取500μl洗涤液加入上述上样后羟基磷灰石纯化柱，室温静置1min，4℃，5000rpm，离心1min，弃滤液，该步骤重复一次，其中洗涤液为10mM Na3PO4，1mM EDTA，500mM NaCl，pH为7.5。
5.洗脱
取200μL洗脱液1加到上述洗涤后羟基磷灰石纯化柱中，室温静置2min，4℃，5000rpm，离心1min，滤液即为外泌体溶液(记为样本5)，其中，洗脱液1为200mM Na3PO4，1mMEDTA，pH为7.2；再取50μL洗脱液2再对羟基磷灰石纯化柱进行洗脱，室温静置2min，4℃，5000rpm，离心1min，所得滤液为核酸溶液(记为样本6)，其中，洗脱液2为500mM Na3PO4，1mMEDTA，pH为7.5。
6.对比实验
取400μl样本1的预处理后血清，用SBI The Original ExoQuick提取外泌体，用420μl PBS重悬外泌体沉淀，取100μl重悬后外泌体(记为样本7)进行粒径检测；沉淀外泌体后的上清取210μl用SBI XCFTM COMPLETE Exosome&cfDNA Isolation Kit提取cfDNA(记为样本8),另取210μl沉淀外泌体后的上清用天根血液总RNA提取试剂盒提取总cfRNA(记为样本9)，具体操作参照相关试剂盒中的说明书。
7.外泌体检验
将上述样本2、5、7各取100μl进行粒径检测。
8.核酸检验
按照实例2中DNA检测的方法检测样本3、样本6及样本8中的cfDNA；按照实例二中RNA检测得方法检测样本4、样本6及样本9中的cfRNA；按照实例二中miRNA检测得方法检测样本4、样本6及样本9中的miRNA。
9.结果分析
(1)粒径检测结果
本实例中第一次洗脱(样品5)的外泌体的含量为2.4E+11particles/mL，对照试验中SBI试剂盒提取的外泌体含量是2.3E+11particles/mL，两者外泌体的量基本一致，而样本2中外泌体的量则明显少于样本5和样本7，说明本发明方法能有效提取体液及细胞培养液中的绝大多数外泌体(三个样本的粒径图见图5)。
(2)DNA检测结果
各样本cfDNA检测结果见表13，本实例中有两种方法共检测，两种方法检测结果基本一致，同时还检测了本发明方法提取完外泌体和核酸后样本4的cfDNA，根据Ct值可以样本4中的cfDNA含量已经大大减少，说明本发明方法能有效提取体液及细胞培养液中cfDNA。
表13
(3)RNA检测结果
各样本cfRNA检测结果见表14，与本实例中cfDNA检测结果类似，样本6与样本9的检测结果基本一致，样本4中的cfRNA含量也明显减少，说明本发明方法同样能有效提取体液及细胞培养液中cfRNA。
表14
(4)miRNA检测结果
各样本cfRNA检测结果见表15，与本实例中cfDNA、cfRNA检测结果类似，样本6与样本9的检测结果基本一致，样本4中的cfRNA含量也明显减少，说明本发明方法同样能有效提取体液及细胞培养液中cfRNA。
表15
结合粒径检测结果和各类核酸检测结果，本发明方法利用羟基磷灰石对酸性蛋白和碱性蛋白结合力的不同能有效去除提取物中的蛋白含量，获得高质量的提取物。同时，利用羟基磷灰石对核酸和外泌体膜蛋白螯合力的差异，利用不同的洗脱液能同时获得外泌体和游离核酸两种提取物，并且该游离核酸包括DNA、RNA、miRNA等各种类型的核酸。本发明方法操作简便，提取产物质量高、效率好，并且能大量节省实验成本。
实施例4
制备无外泌体血清的方法
1、柱平衡：
取1mL柱平衡液加入到羟基磷灰石纯化柱中，室温放置1min，5000rpm离心30S备用，其中柱平衡液为10mM Na3PO4，pH7.0；
2、样本预处理
取1冷冻的胎牛血清(记为FBS-3)于室温下解冻，在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。
3、样本平衡
取10mL上述处理后胎牛血清，加100μl 20mg/mL ProK，58℃孵育15min，然后将入10mL样本平衡液，震荡混匀后，取10mL加入羟基磷灰石纯化柱中(记为样品1)，而后与不经过羟基磷灰石纯化柱的10mL胎牛血清(记为样品2)一起于室温静置10min，4℃，5000rpm，离心1min，所得滤液分别记为FBS-1和FBS-2，样本平衡液为100mM Na3PO4，2mM EDTA，pH为7.2。
4、粒径检测
取FBS-1、FBS-2各100μl进行粒径检测
5、细胞存活率检测
将HeLa，A549，HCT-15及U937细胞等量加入含有(体积比)10％FBS-1、FBS-2和FBS-3的DMEM培养基中，分种于培养瓶中并置于5％CO2(细胞培养的常规环境，CO2体积分数为5％)，饱和湿度95％，37℃培养箱中培养24-72小时，用MTT法测定计算细胞相对存活率。
细胞存活率(％)＝FBS-n平均OD值/FBS-1平均OD值×100％
6、牛miRNA检测
各取200μlFBS-1和FBS-2用实例三中所述天根方法提取FBS-1和FBS-2中总RNA，并用实例二和实例三中所述的miRNA检测方法进行检测，体系中所用的引物探针序列见表16(注：牛血清中含有miR-93)(Mahdi Mahdipour,et al.(2015)Validating referencemicroRNAs for normalizing qRT-PCR data in bovine oocytes and preimplantationembryos,DMC Development Biology 15:25)。
表16
7、结果分析
(1)粒径结果
本实例中FBS-1和FBS-2经过粒径检测，FBS-2外泌体含量为2.4E+11particles/mL，FBS-1的外泌体含量1.8E+11particles/mL，即经过羟基磷灰石纯化柱处理后的血清中只剩余7.5％的外泌体，92.5％的外泌体已经被去除。
(2)细胞存活率结果
根据各样本经过MTT处理后的OD值检测结果，计算出来的细胞存活率结果见图6，结果说明羟基磷灰石纯化柱的处理并没有影响各种细胞系的生长，在细胞培养方面依然保持原有特点。
(3)牛miRNA检测结果
本实例中miR-93的荧光定量PCR检测结果见表17，结果说明经过羟基磷灰石处理的胎牛血清中已经不含有胎牛的miRNA。
表17
结合粒径、细胞存活率及牛miRNA的检测，说明本实验方法，在不影响细胞生长的情况下，有效去除了外泌体和牛相关的核酸，避免了外泌体和牛核酸对下游实验的影响。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种同时分离、纯化外泌体和/或游离核酸的方法，其特征在于，
S1.利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态；
S2.利用样本平衡液预处理样本；
S3.将上述处理后样本加入至上述活化的羟基磷灰石纯化柱进行分离纯化外泌体及游离核酸；
S4.利用洗涤液洗涤羟基磷灰石纯化柱，再用不用浓度的洗脱液分别洗脱样品中的外泌体和/或游离核酸。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述羟基磷灰石纯化柱中羟基磷灰石用量为10-100mg，并经柱平衡液对其进行活化，其中，柱平衡液为1-10mM Na3PO4，pH为6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述样本处理为将样本上清液与样本平衡液等体积混匀。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述样本平衡液液为50-500mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5，即可同时或分别分离、纯化外泌体及游离核酸。
5.根据权利要求1或3所述方法，其特征在于，所述步骤S3为将步骤S2处理后样本加入步骤S1平衡后的羟基磷灰石纯化柱，室温孵育10-60min后,4℃，2000-5000rpm离心1-5min，弃滤液。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述样本为细胞培养液或生物体液；
其中，当样本为细胞培养液预处理为：细胞培养液在4℃，12000g离心20min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡；
当样本为生物体液预处理为：生物体液在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于,所述步骤S4将洗涤液加入纯化柱中，孵育1-5min,4℃，2000-5000rpm离心1-5min，弃滤液,重复一次。
8.根据权利要求1或7所述方法，其特征在于，洗涤液为1-10mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA；200mM-1M NaCl，pH为6.5-7.5。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述经洗涤后纯化柱用含50-200mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度外泌体；
所述洗涤后用含200-500mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度游离核酸；
所述洗涤后先用含50-200mM Na3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度外泌体；再用含200-500mMNa3PO4，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1-5min，4℃，2000-5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度游离核酸，即可同时分离纯化外泌体和游离核酸。
CN201810824552.2A 2018-07-25 2018-07-25 一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法 Pending CN108866046A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810824552.2A CN108866046A (zh) 2018-07-25 2018-07-25 一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810824552.2A CN108866046A (zh) 2018-07-25 2018-07-25 一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108866046A true CN108866046A (zh) 2018-11-23

Family

ID=64305243

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810824552.2A Pending CN108866046A (zh) 2018-07-25 2018-07-25 一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108866046A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108865978A (zh) * 2018-07-25 2018-11-23 辽宁润基生物科技有限公司 一种分离和纯化外泌体的方法
CN112126643A (zh) * 2020-09-11 2020-12-25 上海长征医院 一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法
CN112553151A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法
CN112831457A (zh) * 2021-02-07 2021-05-25 辽宁润基生物科技有限公司 一种分离和浓缩外泌体的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1264744A (zh) * 1999-02-26 2000-08-30 上海生元基因开发有限公司 一种通过循环差减进行大规模cDNA克隆和测序的方法
WO2003027669A2 (de) * 2001-09-21 2003-04-03 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung einer normalisierten genbank aus nukleinsäure-exktrakten von bodenproben und deren verwendung
WO2014141288A1 (en) * 2013-03-12 2014-09-18 Amrita Vishwa Vidyapeetham University The art, method, manner, process and system of a nano-biomineral for multi-modal contrast imaging and drug delivery
CN107446879A (zh) * 2017-06-27 2017-12-08 华南农业大学 一种分离和纯化不同外泌体亚群的方法
CN108865978A (zh) * 2018-07-25 2018-11-23 辽宁润基生物科技有限公司 一种分离和纯化外泌体的方法
CN110199019A (zh) * 2016-05-02 2019-09-03 Encodia有限公司 采用核酸编码的大分子分析
WO2020219365A1 (en) * 2019-04-23 2020-10-29 Encodia, Inc. Methods for spatial analysis of proteins and related kits
CN112272703A (zh) * 2017-10-31 2021-01-26 Encodia有限公司 采用核酸编码和/或标签进行分析的试剂盒

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1264744A (zh) * 1999-02-26 2000-08-30 上海生元基因开发有限公司 一种通过循环差减进行大规模cDNA克隆和测序的方法
WO2003027669A2 (de) * 2001-09-21 2003-04-03 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung einer normalisierten genbank aus nukleinsäure-exktrakten von bodenproben und deren verwendung
WO2014141288A1 (en) * 2013-03-12 2014-09-18 Amrita Vishwa Vidyapeetham University The art, method, manner, process and system of a nano-biomineral for multi-modal contrast imaging and drug delivery
CN110199019A (zh) * 2016-05-02 2019-09-03 Encodia有限公司 采用核酸编码的大分子分析
CN107446879A (zh) * 2017-06-27 2017-12-08 华南农业大学 一种分离和纯化不同外泌体亚群的方法
CN112272703A (zh) * 2017-10-31 2021-01-26 Encodia有限公司 采用核酸编码和/或标签进行分析的试剂盒
CN108865978A (zh) * 2018-07-25 2018-11-23 辽宁润基生物科技有限公司 一种分离和纯化外泌体的方法
WO2020219365A1 (en) * 2019-04-23 2020-10-29 Encodia, Inc. Methods for spatial analysis of proteins and related kits

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F O OBI: "Interaction of DNA with hydroxyapatite. Studies on the effect of the phosphate concentration of the column equilibration and washing buffer", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY》 *
FADROSH,DOUGLAS W.等: "Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography", 《JOVE-JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS》 *
任英华: "纳米羟基磷灰石聚醚醚酮对成骨细胞MG63增殖分化的影响及其机制的研究", 《万方学位论文数据库》 *
王斌等: "羟基磷灰石色谱在生物分子分离中的应用", 《药物分析杂志》 *
陈光明等: "羟基磷灰石纯化NDV-HN基因核酸疫苗效果观察", 《中国兽医杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108865978A (zh) * 2018-07-25 2018-11-23 辽宁润基生物科技有限公司 一种分离和纯化外泌体的方法
CN112553151A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法
CN112126643A (zh) * 2020-09-11 2020-12-25 上海长征医院 一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法
CN112126643B (zh) * 2020-09-11 2022-04-15 上海长征医院 一种基于磁珠分离外泌体中ecDNA的方法
CN112831457A (zh) * 2021-02-07 2021-05-25 辽宁润基生物科技有限公司 一种分离和浓缩外泌体的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108866046A (zh) 一种分离、纯化样品中外泌体和/或游离核酸的方法
AU2014210676B2 (en) Methods of Using miRNA for Detection of In Vivo Cell Death
EP2303458B1 (en) Nucleic acid extraction apparatus
CN104755628B (zh) 生物样品的稳定化
US8481261B2 (en) Nucleic acid extraction method
CN106755488A (zh) 应用rpa技术对转基因玉米bt11品系特异性鉴定
KR20110106436A (ko) 세포의 유전적 분석
JP2004519234A (ja) 核ｍＲＮＡの収集および使用方法
WO2019075868A1 (zh) 一种检测布鲁菌感染的方法及其应用
CN107460241B (zh) 外泌体小分子rna在急性心肌梗死风险评估中的应用
JP6815334B2 (ja) 核酸の単離のための自動化可能な方法
CN103074422A (zh) Ms4a6a基因的用途
CN108486221A (zh) 检测端粒长度的方法
CN107058305A (zh) 一组核苷酸序列及在eml4‑alk融合基因快速检测中的应用
CN110564864A (zh) miR-6090作为γ射线辐射标志物的应用
CN102108420B (zh) 一种检测登革1型病毒的荧光定量pcr试剂盒
CN108315324A (zh) 尿液ctDNA中BRAF基因突变位点的检测
CN106191032B (zh) 智力障碍疾病的致病基因模型及其构建方法和应用
CN108315321A (zh) 尿液ctDNA中K-ras基因突变位点的检测
CN103060446B (zh) Cd157 基因的用途
CN110863037A (zh) 一种能检测多种真菌基因组dna的微阵列芯片及其制备方法
CN110408686A (zh) 一种快速鉴定小鼠基因型的方法
CN105063052A (zh) 急性髓系白血病miRNA标记物
CN104388587A (zh) 乙型流感病毒一步法检测试剂盒及乙型流感病毒检测方法
CN111705111A (zh) 一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181123

RJ01 Rejection of invention patent application after publication