CN110408686A - 一种快速鉴定小鼠基因型的方法 - Google Patents

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任娇艳
曹家宁
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Abstract

本发明公开了一种快速鉴定小鼠基因型的方法。该方法包括：将待测小鼠的组织加入NaOH溶液中，加热，得到混合液，调节混合液的pH为7.6~8.0，离心，得到样品DNA提取液；将样品DNA提取液、目标基因型的引物溶液及PCR反应液混合均匀，进行PCR反应，得到PCR产物；将PCR产物进行电泳处理，得到电泳结果图，根据所述电泳结果图判断待测小鼠的基因型，如果电泳结果图上出现了条带结果，则判断待测小鼠的基因型为目标基因型，如果电泳结果图上没有出现条带结果，则判断待测小鼠的基因不是目标基因型。该方法减少了传统DNA提取的繁琐步骤，在小鼠样本数量较多或需鉴定的等位基因较多时，可显著提高实验的效率。

Description

一种快速鉴定小鼠基因型的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴定小鼠基因型的方法。
背景技术
基因工程小鼠(转基因或基因敲除小鼠)可作为某种疾病的模式生物，为研究各种人类疾病作出了巨大贡献，并在医学、生命科学等学科有着广泛应用。目前大多数实验室使用基因工程小鼠多以自构建方式，生产繁殖特定基因型及一定数量的小鼠。在使用这些小鼠开展实验之前，通常需对小鼠基因型进行确认，以区分不同基因型小鼠并完成实验分组。
通常小鼠基因型鉴定工作使用小鼠尾巴组织，先用含蛋白酶的消化液消化蛋白，再用异丙醇/乙醇提纯DNA，最后在空气中晾干，制得DNA样品。或通过购买市面上成熟得DNA抽提试剂盒制的DNA。这些方法虽可获得纯度较高且可长期保存的组织DNA，但存在一些明显的不足之处，如：
(1)实验涉及多种试剂且步骤繁琐，如抽提DNA过程中涉及蛋白酶K、异丙醇、乙醇等。而且实验的每一步均需振荡、离心等操作；
(2)实验成本较高，由于小鼠的基因型鉴定属于长期固定的工作，当需要鉴定的样本数较大或需鉴定的等位基因较多时，实验所需试剂耗材也水涨船高；
(3)实验周期长、效率低、强度大，蛋白酶裂解完全释放DNA需3h左右，后续需要异丙醇/乙醇提纯DNA，到最终制的纯DNA需1天以上。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种快速鉴定小鼠基因型的方法。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供了一种快速鉴定小鼠基因型的方法，该方法包括：用NaOH溶液(优选浓度为50mM的NaOH溶液)处理待测小鼠的脚趾或尾巴组织，使其组织中细胞内核酸释放出来的过程，然后通过聚合酶链式反应，得到扩增的DNA溶液，然后在琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果图来判断小鼠基因型。
本发明提供的一种快速鉴定小鼠基因型的方法，仅仅使用待测小鼠的四肢脚趾或1～2mm小鼠尾巴就能将待测小鼠的基因型检测出来。
现有的小鼠基因型鉴定实验中，DNA提取耗费时间长且成本较高。为改进现有DNA样品地制备方法，本发明提供了一种快速鉴定小鼠基因型的方法。该方法是通过一种DNA粗提的方法快速制备可用于小鼠基因型鉴定实验的DNA样品，从而节约鉴定小鼠基因型实验的时间。
本发明提供一种快速的小鼠基因型鉴定方法。包括采用50mM NaOH溶液处理小鼠组织，使得组织内核酸快速释放。本发明经研究发现50mM NaOH处理小鼠尾巴组织或脚趾，能够使组织内核酸释放到溶液中，而无需使用蛋白酶K消化，异丙醇或乙醇多次纯化的步骤，采用Tris-HCl中和后的释放DNA可直接用于PCR扩增，减少了传统DNA提取的繁琐步骤，在小鼠样本数量较多或需鉴定的等位基因较多时，可显著提高实验的效率。
本发明提供的快速鉴定小鼠基因型的方法，所使用的DNA裂解方法，能够快速提取小鼠组织中的DNA，可显著缩短实验周期及成本，有效节省了实验时间及劳动力。
本发明提供的一种快速鉴定小鼠基因型的方法，包括如下步骤：
(1)将待测小鼠的组织加入NaOH溶液中，然后加热处理，得到混合液，然后用Tris-HCl溶液调节所述混合液的pH值为7.6～8.0，混合均匀，离心取上清液，得到样品DNA提取液；
(2)将步骤(1)所述样品DNA提取液、目标基因型的引物溶液及PCR反应液混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；
(3)将步骤(2)所述PCR反应产物加入琼脂糖凝胶中进行电泳处理，得到电泳结果图，根据所述电泳结果图判断步骤(1)所述待测小鼠的基因型，如果电泳结果图上出现了条带结果，则判断步骤(1)所述待测小鼠的基因型为所述目标基因型，如果电泳结果图上没有出现条带结果，则判断步骤(1)所述待测小鼠的基因不是所述目标基因型。
进一步地，步骤(1)所述待测小鼠的组织为待测小鼠的四肢脚趾或待测小鼠的尾巴。
进一步地，步骤(1)所述NaOH溶液可以使得小鼠组织内的DNA释放出来。
优选地，所述待测小鼠的尾巴的长度为1-2mm。
进一步地，步骤(1)所述NaOH溶液的浓度为40～60mM；所述待测小鼠的组织与NaOH溶液的质量体积比为1：15～25mg/mL。
进一步地，步骤(1)所述加热处理的温度为94～95℃，所述加热处理的时间为20～30min。
进一步地，步骤(1)所述样品DNA提取液能够在4℃冰箱中长期保存3～6个月。
优选地，步骤(1)所述Tris-HCl溶液的浓度为1M。
优选地，步骤(1)所述NaOH溶液的浓度为50mM。
优选地，步骤(1)所述NaOH溶液，当需要使用浓度为50mM的NaOH溶液时，可以将0.2g NaOH固体，溶于100ml去离子水中，混合均匀，然后配置成50mM NaOH溶液。
优选地，步骤(1)所述Tris-HCl溶液，当需要使用浓度为1M的Tris-HCl溶液时，可以将121.1gTris(三羟甲基氨基甲烷)加入800mL的去离子水中，然后搅拌均匀，接着加入70mL的浓盐酸溶液(浓度为12mol/L)，混合均匀得到混合液，然后将混合液定容至1L(通过加水定容)，接着高温高压灭菌处理，冷却至室温，调节其pH值为7.4，得到所述浓度为1M的Tris-HCl溶液。
进一步地，步骤(2)所述PCR反应体系，按体积份数计，包括：
优选地，步骤(2)所述PCR反应体系的体积为20μl；所述PCR反应液包括：1μL的步骤(1)所述样品DNA提取液，16μl的ddH2O，2μl的10×Taq buffer溶液，0.4μl的dNTP溶液(浓度为10mM)，0.4μl的目标基因型引物溶液(浓度为10pmol/μl)，0.2μl的Taq酶溶液(5U/μl)。
进一步地，所述ddH2O为二次蒸馏水；所述dNTP溶液的浓度为2～5mM，所述dNTP包括dATP、dCTP、dGTP及dTTP；所述目标基因型引物溶液的浓度为8～20pmol/μL；所述Taq酶溶液的浓度为2～5U/μL。
优选地，所述目标基因型引物溶液可以先用TE缓冲液(10mmol/L Tris.HCl；1mmol/L EDTA)配制100～200pmol/μL的目标基因型引物母液，便于存储，等需要进行PCR反应时才稀释至为8～20pmol/μL的目标基因型引物溶液，然后再加入到PCR反应体系中。
优选地，步骤(2)所述目标基因型的引物溶液是目标基因型的引物母液浓度为100pmol/μL，然后等需要进行PCR反应时才用去离子水稀释为浓度为10pmol/μL的目标基因型引物溶液。
进一步地，步骤(2)所述PCR反应的反应条件为：
在94～95℃条件下预变性5～10min，然后进行扩展循环，最后在温度为72℃的条件下再延伸5min；
所述扩展循环为：先在温度为94～95℃的条件下变性15～30sec，然后在温度为54～65℃的条件下退火20～30sec，接着在温度为72℃的条件下延伸40～45sec，循环的次数为30～40。
优选地，步骤(2)所述PCR反应产物可在10摄氏度下保存。
进一步地，步骤(3)所述琼脂糖凝胶的质量体积百分比浓度为1.5％～3％，单位为g/mL。
进一步地，步骤(3)所述电泳分离的条件为：在电压为110～135V的条件下，电泳20～40分钟。
目前大多数实验室使用基因工程小鼠多以自构建方式，生产繁殖特定基因型及一定数量的小鼠。在使用这些小鼠开展实验之前，通常需对小鼠基因型进行确认，以区分不同基因型小鼠并完成实验分组。
在本发明提供的鉴定方法中，如果步骤(1)所述待测小鼠的基因型与目标基因型的引物能够匹配得上，则在步骤(3)的电泳结果图中会出现相应的DNA条带，则判断步骤(1)所述待测小鼠为目标基因型的小鼠，如果在步骤(3)的电泳结果图中没有出现相应的DNA条带，则判断步骤(1)所述待测小鼠不是目标基因型的小鼠。
本发明提供的一种快速鉴定小鼠基因型的方法，具体包括如下步骤：
(1)将小鼠脚趾或尾巴及NaOH溶液(NaOH溶液浓度优选为50mM，体积优选为120μL)在反应容器(此处的反应容器如果要节省时间，可以优选在96孔板上的其中一个孔进行)中混合，得到混合液；
(2)用封板膜将反应容器的开口进行密封，然后将含步骤(1)所述混合液的反应容器进行加热处理(如果反应容器选择了96孔板上的其中一个孔，此处的加热处理可以优选在PCR仪器中进行，仅需要调节PCR仪器的程序，加热处理的温度为95℃，加热处理的时间为20min)，得到加热后的反应液；
(3)将反应容器离心(离心速率优选为1000r/min)，使步骤(2)所述加热后的反应液都回流到反应容器的中部或底部，然后往反应容器中加入Tris-HCl溶液，调节所述加热后的反应液的pH值为7.6～8.0，振荡混匀，然后离心(此处离心速率优选为1000r/min)，将液体均离心回反应容器的底部，得到样品DNA提取液；
(4)将所述样品DNA提取液与PCR反应液混合，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；
(5)将步骤(4)所述PCR反应产物在琼脂糖凝胶中进行电泳处理，然后在凝胶成像仪中观察电泳结果(观察条带的分布位置)，根据所述电泳结果图判断步骤(1)所述待测小鼠的基因型，如果电泳结果图上出现了条带结果，则判断步骤(1)所述待测小鼠的基因型为所述目标基因型，如果电泳结果图上没有出现条带结果，则判断步骤(1)所述待测小鼠的基因不是所述目标基因型。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的一种快速鉴定小鼠基因型的方法，步骤(1)中，通过NaOH溶液处理小鼠脚趾或尾巴释放其组织内核酸过程，简单快速，成本低廉；整个过程需30min，当有20个样品以上或2个以上等位基因需鉴定时可比现有技术可节省5h小时以上；
(2)本发明提供的一种快速鉴定小鼠基因型的方法，步骤(1)中，通过加入Tris-HCl溶液来调整得到的核酸产物的pH(即调节步骤(1)所述混合液的pH值)，该过程操作简单，得到的所述样品DNA提取液在4℃条件下的保存时间为3-6个月，最高可达6个月之久，在保存的时间内，所述样品DNA提取液中的DNA片段稳定；
(3)本发明提供的一种快速鉴定小鼠基因型的方法，可以使用96孔板(作为反应容器)来代替传统方法的1.5mLEP管进行基因型鉴定，当处理大规模样本时(20个样品以上)，其所占空间体积比1.5mL EP管小，可节省保存设备的内部空间，相比之下，96孔板的占的空间比1.5mL EP管占的空间小2-3倍；
(4)本发明提供的一种快速鉴定小鼠基因型的方法，在基因型鉴定过程中只需要微量的DNA样品，即可扩增出目的片段，而该方法释放出的DNA量完全可以满足条件，即使该方法在DNA样品中混有少量组织中的蛋白质等物质，但由于上样量为1～2uL，因此其他杂质的影响可忽略不计。
附图说明
图1为实施例1对12只小鼠进行基因型鉴定的结果图；
图2为实施例2对12只小鼠进行基因型鉴定的结果图；
图3为实施效果验证中用常规的DNA提取方法对10只小鼠进行基因型鉴定的结果图；
图4为实施效果验证中用本发明提供的快速提取小鼠组织中DNA的方法对10只小鼠进行基因型鉴定的结果。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
以下实施例所用Taq酶体系购买自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为：R001A。所述Taq酶体系包括：10×Taq buffer溶液、dNTP溶液(浓度为2.5mM)、引物混合溶液(浓度为10pmol/μL)、Taq酶溶液(浓度为5U/μl)及ddH2O(二次蒸馏水)。
实施例1
作为举例，实施例1选取一批小鼠(12只)，这批小鼠中含有未知数量的APPswe/PSEN1dE9双转基因的基因型小鼠及野生型小鼠，以下使用本发明提供的快速鉴定小鼠基因型的方法，对这一批小鼠的基因型进行鉴定，以便于筛选出所述APPswe/PSEN1dE9双转基因的基因型小鼠。因此，以下的方法步骤(2)中，所使用的目标基因型的引物为APP引物及PS1引物(APP及PS1引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)；所述APP引物、PS1引物分别与基因APPswe、基因PSEN1dE9对应，能分别在PCR反应中特异性拷贝出基因APPswe和基因PSEN1dE9，若待测小鼠中含有基因APPswe，则电泳结果图上会出现400～500bp大小的条带，若待测小鼠中含有基因PSEN1dE9，则电泳结果图上会出现700～1000bp大小的条带；如果待测小鼠的基因型为APPswe/PSEN1dE9双转基因，则在电泳结果图中会同时出现400～500bp大小和700～1000bp大小的条带。
一种快速鉴定小鼠基因型的方法，包括如下步骤：
(1)用小号眼科剪(弯尖)分别沿12只待测小鼠的四肢脚趾根部剪下一根脚趾，得到12份待测小鼠的组织(每一份待测小鼠的组织对应一只待测小鼠)；将这12份待测小鼠分别命名为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12；它们对应的组织则分别为S1的组织、S2的组织、S3的组织、S4的组织、S5的组织、S6的组织、S7的组织、S8的组织、S9的组织、S10的组织、S11的组织、S12组织；
(2)将12份所述待测小鼠的组织(小鼠脚趾)分别加入96孔板上的一个小孔中，然后12个小孔中分别加入150μL浓度为40mM的NaOH溶液，所述待测小鼠的组织与NaOH溶液的质量体积比均为1：15(mg/mL)，混合均匀，然后将该96孔板转移至PCR仪器中，设置PCR仪器的程序，使PCR仪器的温度为94℃，对96孔板进行加热处理，加热处理的时间为30min，得到12份混合液，然后用浓度为1M的Tris-HCl溶液分别调节12份所述混合液的pH值为7.6，混合均匀，离心，分别取孔板底部液体，得到12份样品DNA提取液(12份样品DNA提取液分别对应12只待测小鼠)；
(3)因为实施例1中待鉴定的目标基因型为APPswe/PSEN1dE9双转基因，对应的引物也有两对，分别为APP引物和PS1引物，为了防止两组引物在PCR反应中的互相干扰，将上述的每一份样品DNA提取液分别均匀分为两组，一组用于鉴定有无APPswe基因(后续PCR反应中对应加入APP引物)，另一组用于鉴定有无PSEN1dE9基因(后续PCR反应中对应加入PS1引物)，得到24份样品DNA提取液；
然后分别将所述24份样品DNA提取液依次与目标基因型的引物溶液(APP引物溶液及PS1引物溶液的浓度均为20pmol/μL)及PCR反应液混合均匀，得到24份PCR反应体系(每一份PCR反应体系的体积均为20μL)，24份PCR反应体系除了加入的样品DNA提取液及目标基因型的引物溶液不同以外，其他组分均相同，然后分别进行PCR反应，得到24份PCR反应产物，冷藏备用；
其中，加入APP引物溶液的12份PCR反应体系组分可参照下表1所示；
表1
表1中的样品DNA提取液分别为S1的DNA提取液、S2的DNA提取液、S3的DNA提取液、S4的DNA提取液、S5的DNA提取液、S6的DNA提取液、S7的DNA提取液、S8的DNA提取液、S9的DNA提取液、S10的DNA提取液、S11的DNA提取液及S12的DNA提取液；
其中，加入PS1引物溶液的12份PCR反应体系组分可参照下表2所示；
表2
表2中的样品DNA提取液分别为S1的DNA提取液、S2的DNA提取液、S3的DNA提取液、S4的DNA提取液、S5的DNA提取液、S6的DNA提取液、S7的DNA提取液、S8的DNA提取液、S9的DNA提取液、S10的DNA提取液、S11的DNA提取液及S12的DNA提取液；
所述PCR反应的反应条件均为：
在94℃条件下预变性10min，然后进行扩展循环，最后在温度为72℃的条件下再延伸5min；
所述扩展循环为：先在温度为95℃的条件下变性30sec，然后在温度为65℃的条件下退火30sec，接着在温度为72℃的条件下延伸40sec，循环的次数为40；
(4)将步骤(3)所述的24份PCR反应产物分别加入制备好的质量体积比浓度为2％(g/mL)琼脂糖凝胶中进行电泳处理，电泳的电压为135V，电泳的时间为30min，于凝胶成像仪中观察结果，得到电泳结果图，如图1所示，图1为实施例1对12只小鼠进行基因型鉴定的结果图。图1中的“APP”表示APPswe基因扩增条带，“PS1表示”PSEN1dE9基因扩增条带，”+”表示稳定遗传了该基因，“-”表示没有遗传该基因；“M”表示为DNA marker。结果显示这批小鼠中稳定遗传了APPswe/PSEN1dE9双转基因的小鼠为S1、S3、S7、S8、S12，而S2、S4、S5、S6、S9、S10、S11均为野生型的小鼠。
实施例2
实施例2选取一批小鼠(12只)，这批小鼠中含有未知数量的APPswe/PSEN1dE9双转基因的基因型小鼠及野生型小鼠，以下使用本发明提供的快速鉴定小鼠基因型的方法，对这一批小鼠的基因型进行鉴定，以便于筛选出所述APPswe/PSEN1dE9双转基因的基因型小鼠。因此，以下的方法步骤(2)中，所使用的目标基因型的引物为APP引物及PS1引物(APP及PS1引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)；所述APP引物、PS1引物分别与基因APPswe、基因PSEN1dE9对应，能分别在PCR反应中特异性拷贝出基因APPswe和基因PSEN1dE9，若待测小鼠中含有基因APPswe，则电泳结果图上会出现400～500bp大小的条带，若待测小鼠中含有基因PSEN1dE9，则电泳结果图上会出现700～1000bp大小的条带如果待测小鼠的基因型为APPswe/PSEN1dE9双转基因，则在电泳结果图中会同时出现400～500bp大小和700～1000bp大小的条带。
一种快速鉴定小鼠基因型的方法，包括如下步骤：
(1)用小号眼科剪(弯尖)分别沿12只待测小鼠的尾尖剪下长度为2mm的尾巴组织，得到12份待测小鼠的组织(每一份待测小鼠的组织对应一只待测小鼠)；将这12份待测小鼠分别命名为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12；它们对应的组织则分别为S1的组织、S2的组织、S3的组织、S4的组织、S5的组织、S6的组织、S7的组织、S8的组织、S9的组织、S10的组织、S11的组织、S12组织；
(2)将12份所述待测小鼠的组织(小鼠尾巴)分别加入96孔板上的一个小孔中，然后12个小孔中分别加入100μL浓度为60mM的NaOH溶液，所述待测小鼠的组织与NaOH溶液的质量体积比均为1：25(mg/mL)，混合均匀，然后将该96孔板转移至PCR仪器中，设置PCR仪器的程序，使PCR仪器的温度为95℃，对96孔板进行加热处理，加热处理的时间为20min，得到12份混合液，然后用浓度为1M的Tris-HCl溶液分别调节12份所述混合液的pH值为8.0，混合均匀，离心，分别取接近孔板底部液体，得到12份样品DNA提取液(12份样品DNA提取液分别对应12只待测小鼠)；
(3)因为实施例2中待鉴定的目标基因型为APPswe/PSEN1dE9双转基因，对应的引物也有两对，分别为APP引物和PS1引物，为了防止两组引物在PCR反应中的互相干扰，将上述的每一份样品DNA提取液分别均匀分为两组，一组用于鉴定有无APPswe基因(后续PCR反应中对应加入APP引物)，另一组用于鉴定有无PSEN1dE9基因(后续PCR反应中对应加入PS1引物)，得到24份样品DNA提取液；
然后分别将所述24份样品DNA提取液依次与目标基因型的引物溶液(APP引物溶液及PS1引物溶液浓度均为8pmol/μL)及PCR反应液混合均匀，得到24份PCR反应体系(每一份PCR反应体系的体积均为20μL)，24份PCR反应体系除了加入的样品DNA提取液及目标基因型的引物溶液不同以外，其他组分均相同，然后分别进行PCR反应，得到24份PCR反应产物，冷藏备用；
其中，加入APP引物溶液的12份PCR反应体系组分可参照下表3所示；
表3
表3中的样品DNA提取液分别为S1的DNA提取液、S2的DNA提取液、S3的DNA提取液、S4的DNA提取液、S5的DNA提取液、S6的DNA提取液、S7的DNA提取液、S8的DNA提取液、S9的DNA提取液、S10的DNA提取液、S11的DNA提取液及S12的DNA提取液；
其中，加入PS1引物溶液的12份PCR反应体系组分可参照下表4所示；
表4
表4中的样品DNA提取液分别为S1的DNA提取液、S2的DNA提取液、S3的DNA提取液、S4的DNA提取液、S5的DNA提取液、S6的DNA提取液、S7的DNA提取液、S8的DNA提取液、S9的DNA提取液、S10的DNA提取液、S11的DNA提取液及S12的DNA提取液；
所述PCR反应的反应条件均为：
在95℃条件下预变性5min，然后进行扩展循环，最后在温度为72℃的条件下再延伸5min；
所述扩展循环为：先在温度为94℃的条件下变性15sec，然后在温度为58℃的条件下退火25sec，接着在温度为72℃的条件下延伸45sec，循环的次数为32；
(4)将步骤(3)所述的24份PCR反应产物分别加入制备好的质量体积比为1.5％(g/mL)琼脂糖凝胶中进行电泳处理，电泳的电压为110V，电泳的时间为40min，于凝胶成像仪中观察结果，得到电泳结果图，如图2所示，图2为实施例2对12只小鼠进行基因型鉴定的结果图。图2中的“APP”表示APPswe基因扩增条带，“PS1表示”PSEN1dE9基因扩增条带，”+”表示稳定遗传了该基因，“-”表示没有遗传该基因，“M”表示为DNA marker。结果显示S3、S4、S10均为遗传了APPswe/PSEN1dE9双转基因的小鼠，而S1、S2、S5、S6、S7、S8、S9、S11、S12均为野生型小鼠。
实施效果验证
为比较传统的小鼠组织DNA提取方法和本发明提供的小鼠组织DNA提取方法的效果差异。选取10只小鼠，10只小鼠中含有数量未知的APPswe/PSEN1dE9双转基因小鼠，将这10只小鼠分别编号为1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号及10号。取10只小鼠尾部组织2mm装于1.5mL EP管中，在剪尾的同时沿该小鼠四肢脚趾根部剪下小鼠脚趾于96孔板中。存于1.5mL EP管中的鼠尾使用常规动物组织DNA提取方法提取DNA(即所述传统的小鼠组织DNA提取方法)，存于96孔板中的小鼠脚趾使用本发明提供的方法提取DNA，两种方法完成DNA提取工作后同时按照以下方法的步骤(2)、(3)进行PCR扩增和跑胶，以下的方法步骤(2)中，所使用的目标基因型的引物均为APP引物及PS1引物(APP及PS1引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)所述APP引物、PS1引物分别与基因APPswe、基因PSEN1dE9对应，若待测小鼠中含有基因APPswe，则电泳结果图上会出现400～500bp大小的条带，若待测小鼠中含有基因PSEN1dE9，则电泳结果图上会出现700～1000bp大小的条带如果待测小鼠的基因型为APPswe/PSEN1dE9双转基因，则在电泳结果图中会同时出现400～500bp大小和700～1000bp大小的条带。
常规的小鼠尾部DNA组织提取步骤：
(1)用小号眼科剪(弯尖)分别沿上述编号为1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号及10号的10只待测小鼠的尾尖剪下2mm的尾尖组织，装于1.5EP管中，得到10份待测小鼠的组织(每一份待测小鼠的组织对应一只待测小鼠)；这10份待测小鼠的组织则分别对应为1号的尾尖组织、2号的尾尖组织、3号的尾尖组织、4号的尾尖组织、5号的尾尖组织、6号的尾尖组织、7号的尾尖组织、8号的尾尖组织、9号的尾尖组织及10号的尾尖组织；
(2)将上述10份所述待测小鼠的组织分别放入10个的1.5mL EP管中；然后分别向1号的尾尖组织、2号的尾尖组织、3号的尾尖组织、4号的尾尖组织、5号的尾尖组织、6号的尾尖组织、7号的尾尖组织、8号的尾尖组织、9号的尾尖组织及10号的尾尖组织所在1.5mLEP管(离心管)中加入400μL含蛋白酶K的组织消化液(含0.5mg/mL％SDS、0.1M NaCl、0.05MEDTA、0.01M Tris.C1(pH8.0)、100gμ/mL蛋白酶K)，将其分别置于混合仪上消化，在55℃条件下，消化3h；得到10份消化后的样品；
(3)分别向10份消化后的样品中加入400μL异丙醇，反复颠倒，一般可见絮状分层。然后放至离心机中，用10000r/min的转速离心10min，得到10份离心后的样品；该步骤共耗时20min。
(4)将步骤(3)所述10份离心后的样品分别去除上清液取沉淀，得到10份沉淀，然后分别加入750μL体积分数为70％的乙醇，在10000r/min的转速条件下离心10min，然后弃去上清液，保留沉淀，此操作重复一次，得到10份含沉淀的离心管；步骤(4)共耗时30min；
(5)将步骤(4)所述10份含沉淀的离心管均置于空气中晾干，然后分别往10份含沉淀的离心管中滴加10μL的ddH20，吹打均匀，使样品DNA溶解于dd H20，得到10份DNA提取液(DNA样品)，将这10份DNA样品分别对应命名为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9及S10；步骤(5)耗时约2h；
上述用传统方法提取小鼠尾部组织DNA的方法共需6h左右。
本发明使用的一种快速鉴定小鼠基因型的方法，包括如下步骤：
(1)用小号眼科剪(弯尖)分别沿上述编号为1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号及10号的10只待测小鼠的四肢脚趾根部剪下完整的小鼠脚趾组织得到10份待测小鼠的组织(每一份待测小鼠的组织对应一只待测小鼠)；这10份待测小鼠的组织分别对应为1号的脚趾组织、2号的脚趾组织、3号的脚趾组织、4号的脚趾组织、5号的脚趾组织、6号的脚趾组织、7号的脚趾组织、8号的脚趾组织、9号的脚趾组织及10号的脚趾组织；
(2)将10份所述待测小鼠的组织(小鼠脚趾)分别加入96孔板上的一个小孔中，然后10个小孔中分别加入120μL浓度为50mM的NaOH溶液，所述待测小鼠的组织与NaOH溶液的质量体积比均为1：20，混合均匀，然后将该96孔板转移至PCR仪器中，设置PCR仪器的程序，使PCR仪器的温度为95℃，对96孔板进行加热处理，加热处理的时间为20min，得到10份混合液，然后用浓度为1M的Tris-HCl溶液分别调节10份所述混合液的pH值为7.8，混合均匀，离心，分别取接近孔板底部液体，得到10份DNA提取液(10份样品DNA提取液分别对应10只待测小鼠)，将这10份DNA提取液分别对应命名为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10；
该方法的步骤(1)和步骤(2)共耗时40min左右。
通过上述两种方法可得到20份样品DNA提取液，其中10份为常规方法得到的DNA样品，编号为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10，另外10为本发明所提供的方法得到的DNA样品编号为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10。
因为待鉴定的目标基因型为APPswe/PSEN1dE9双转基因，对应的引物也有两对，分别为APP引物和PS1引物，为了防止两组引物在PCR反应中的互相干扰，因此针对上述每一种方法可制备2组PCR反应液，一组用于鉴定有无APPswe基因(后续PCR反应中对应加入APP引物)，另一组用于鉴定有无PSEN1dE9基因(后续PCR反应中对应加入PS1引物)。对应于常规方法提取的DNA样品，PCR反应液编号为PS1、PS2、PS3、PS4、PS5、PS6、PS7、PS8、PS9、PS10、PS11、PS12、PS13、PS14、PS15、PS16、PS17、PS18、PS19、PS20。在PS1、PS2、PS3、PS4、PS5、PS6、PS7、PS8、PS9、PS10中分别加入APP引物(引物浓度为10pmol/μL)，在PS11、PS12、PS13、PS14、PS15、PS16、PS17、PS18、PS19、PS20中分别加入PS1引物(引物浓度为10pmol/μL)。对应于使用本发明提供的方法得到的DNA样品，PCR反应液分别编号为PC1、PC2、PC3、PC4、PC5、PC6、PC7、PC8、PC9、PC10、PC11、PC12、PC13、PC14、PC15、PC16、PC17、PC18、PC19、PC20。在所述PC1、PC2、PC3、PC4、PC5、PC6、PC7、PC8、PC9、PC10中分别加入APP引物(引物浓度为10pmol/μL)，在所述PC11、PC12、PC13、PC14、PC15、PC16、PC17、PC18、PC19、PC20中分别加入PS1引物(引物浓度为10pmol/μL)
(3)然后分别将两种方法提取的DNA样品、对应的目标基因引物溶液和PCR反应液混合均匀，得到PCR反应体系，每一份PCR反应体系的体积均为20μL，共得到40份PCR反应液，然后分别进行PCR反应，得到40份PCR反应产物，冷藏备用；
其中，加入APP引物溶液的20份PCR反应体系组分可参照下表5所示；
表5
表5中的样品DNA提取液分别为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10。
加入PS1引物溶液的10份PCR反应体系组分可参照下表6所示；
表6
表6中的样品DNA提取液分别为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10。
所述的PCR反应的反应条件为：
在94℃条件下预变性3min，然后进行扩展循环，最后在温度为72℃的条件下再延伸5min；
所述扩展循环为：先在温度为94℃的条件下变性15sec，然后在温度为58℃的条件下退火25sec，接着在温度为72℃的条件下延伸45sec，循环的次数为32；
(4)将步骤(3)所述的40份PCR反应产物分别加入制备好的质量体积比为2％(g/mL)琼脂糖凝胶中进行电泳处理，电泳的电压为130V，电泳的时间为22min，于凝胶成像仪中观察结果，得到电泳结果图，结果如图3及图4所示。图3为用常规的DNA提取方法(即传统的小鼠组织DNA提取方法)对10只小鼠进行基因型鉴定的结果图，图3中的“APP”表示APPswe基因扩增条带，“PS1表示”PSEN1dE9基因扩增条带，”+”表示稳定遗传了该基因，“-”表示没有遗传该基因。图3中第一列泳道“M”为DNA marker自上而下为：1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp及100bp。图4为用本发明提供的方法提取同样的10只小鼠的DNA样品经过跑胶后的电泳图，图4中的“APP”表示APPswe基因扩增条带，“PS1表示”PSEN1dE9基因扩增条带，”+”表示稳定遗传了该基因，“-”表示没有遗传该基因。图4中第一列泳道“M”为DNA marker自上而下为：1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp及100bp。
如图3所示，使用常规方法提取小鼠尾部组织DNA，再经过PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后，鉴定得到2号、3号、4号、6号、10号小鼠为APPswe/PSEN1dE9双转基因小鼠，而1号、5号、7号、8号、9号为野生型小鼠。
如图4所示，使用本发明所提供的方法提取小鼠脚趾DNA后，再经过PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后，鉴定得到2号、3号、4号、6号、10号为APPswe/PSEN1dE9双转基因小鼠，1号、5号、7号、8号、9号为野生型小鼠。
由图3和图4可知，常规DNA提取方法(传统的小鼠组织DNA提取方法)和本发明提供的DNA提取方法对最终的跑胶结果没有差别，而常规方法需要6h以上，本发明提供的方法仅需40min，在10个样品量的条件下，可节省5h左右，而且随着样本量的增大，节省的时间越多。
本发明提供的一种快速鉴定小鼠基因型的方法，通过NaOH溶液处理小鼠脚趾或尾巴释放其组织内核酸过程，简单快速，成本低廉；整个过程所需时间短，当有20个样品以上或2个以上等位基因需鉴定时可比现有技术可节省5个小时以上。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速鉴定小鼠基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将待测小鼠的组织加入NaOH溶液中，然后加热处理，得到混合液，然后用Tris-HCl溶液调节所述混合液的pH值为7.6~8.0，混合均匀，离心取上清液，得到样品DNA提取液；
（2）将步骤（1）所述样品DNA提取液、目标基因型的引物溶液及PCR反应液混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物；
（3）将步骤（2）所述PCR反应产物加入琼脂糖凝胶中进行电泳处理，得到电泳结果图，根据所述电泳结果图判断步骤（1）所述待测小鼠的基因型，如果电泳结果图上出现了条带结果，则判断步骤（1）所述待测小鼠的基因型为所述目标基因型，如果电泳结果图上没有出现条带结果，则判断步骤（1）所述待测小鼠的基因不是所述目标基因型。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定小鼠基因型的方法，其特征在于，步骤（1）所述待测小鼠的组织为待测小鼠的四肢脚趾或待测小鼠的尾巴。
3.根据权利要求2所述的快速鉴定小鼠基因型的方法，其特征在于，所述待测小鼠的尾巴的长度为1-2mm。
4.根据权利要求1所述的快速鉴定小鼠基因型的方法，其特征在于，步骤（1）所述NaOH溶液的浓度为40~60 mM；所述待测小鼠的组织与NaOH溶液的质量体积比为1：15~25mg/mL。
5.根据权利要求1所述的快速鉴定小鼠基因型的方法，其特征在于，步骤（1）所述加热处理的温度为94~95℃，所述加热处理的时间为20~30min。
6.根据权利要求1所述的快速鉴定小鼠基因型的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR反应体系，按体积份数计，包括：
ddH2O 13.7~16份；
10×Taq buffer溶液 2份；
dNTP溶液 0.4~1.6份；
目标基因型的引物溶液 0.2~0.5份；
Taq酶溶液 0.2~0.5份；
步骤（1）所述样品DNA提取液 1.0~2.0份。
7.根据权利要求6所述的快速鉴定小鼠基因型的方法，其特征在于，所述ddH2O为二次蒸馏水；所述dNTP溶液的浓度为2~5mM，所述dNTP包括dATP、dCTP、dGTP及dTTP；所述目标基因型引物溶液的浓度为8~20pmol/μL；所述Taq酶溶液的浓度为2~5U/μL。
8.根据权利要求1所述的快速鉴定小鼠基因型的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR反应的反应条件为：
在94~95°C条件下预变性5~10min，然后进行扩展循环，最后在温度为72°C的条件下再延伸5min；
所述扩展循环为：先在温度为94~95°C的条件下变性15~30 sec，然后在温度为54~65°C的条件下退火20~30 sec，接着在温度为72°C的条件下延伸40~45sec，循环的次数为30~40。
9.根据权利要求1所述的快速鉴定小鼠基因型的方法，其特征在于，步骤（3）所述琼脂糖凝胶的质量体积百分比浓度为1.5%~3%，单位为g/mL。
10.根据权利要求1所述的快速鉴定小鼠基因型的方法，其特征在于，步骤（3）所述电泳分离的条件为：在电压为110~135 V的条件下，电泳20~40分钟。
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