CN108660223B - 西伯利亚鲟及以西杂的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了西伯利亚鲟及西杂的鉴定方法，包括如下步骤：(1)以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，a、以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现215bp的扩增产物，则判断为西伯利亚鲟或西杂；或b、以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现252bp的扩增产物，则判断为施氏鲟或施杂；(2)对判断为西伯利亚鲟或西杂的鲟鱼DNA进一步鉴定：以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，以HLJSX48引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现163bp的扩增产物，则为西杂，否则为西伯利亚鲟；可以简单快速地可将西伯利亚鲟及以西伯利亚鲟为母本施氏鲟为父本杂交后代进行区分。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及西伯利亚鲟及西杂的鉴定方法。
背景技术
施氏鲟和西伯利亚鲟是我国的2个重要养殖品种。自然条件下，施氏鲟仅分布于黑龙江（阿穆尔河）水系，是黑龙江的特有种和重要经济鱼类，其生长速度较快，但抗病力差、不耐运输，而且对活饵过于依赖较难驯化，在养殖过程中死亡率较高，加大了鲟鱼养殖业的风险。而西伯利亚鲟主要分布于中亚和东欧，在我国额尔齐斯河水系有少量分布，其生长速度慢，但抗病力强，耐运输。
我国于2007年前后将西伯利亚鲟和施氏鲟的杂交组合繁育成功，因其正、反交的效果差别不大，所以统称为“西杂”。西杂较双亲有明显的生产优势，适应能力较强、生长速度较快、抗病力强、运输存活率高。西杂繁育成功之后，迅速在全国范围内推广养殖，现已成为东北、华北、华东、华中地区的主要养殖品种，是目前我国商品鲟鱼养殖规模与产量最大的品种。
在西杂及其亲本的亲权鉴定方面已开展了部分研究，主要集中在同工酶生化标记研究上。吴艺等采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对施氏鲟、西伯利亚鲟及其正反杂交种4个群体5种组织(心、肝、肌、眼、肾)的酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)和乙醇脱氢酶(ADH)3种同工酶进行了分析，发现3种同工酶在各自群体内具有明显的组织特异性;在4个不同鲟鱼群体间也表现出明显的规律性差异,可作为区分这4种鲟鱼的生化遗传标记。尹洪滨等同样采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对4个群体5个组织进行9种同工酶表达分析发现杂交种的酶带表达比亲本复杂，但多与母本酶带表达相近，并通过聚类分析表明施氏鲟、施氏鲟（♀）×西伯利亚鲟（♂）杂交种聚为同一分支,西伯利亚鲟、西伯利亚鲟（♀）×施氏鲟（♂）杂交种聚为另一分支。采用此类方法进行鉴定，虽然操作简单，易于学习掌握，但是样品制备复杂，样本间产生的条带差异较小，极易受到样品采集方法和实验过程中的各种条件的影响，因此近年在鲟鱼鉴别中报道较少，多用于检测人工饲养条件下的鲟鱼个体健康评估与测定。为了能够更好的对西杂及其亲本西伯利亚鲟和施氏鲟进行鉴定，故急需开发一种快速、稳定、可靠的方法，为后续的研究提供可靠的基础。
本发明中的西杂是指以西伯利亚鲟为母本施氏鲟为父本杂交后代；施杂是指以施氏鲟为母本西伯利亚鲟为父本杂交后代。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何快速、稳定、可靠地对西伯利亚鲟及西杂的进行鉴定。
本发明的技术方案为：西伯利亚鲟及以西杂的鉴定方法，包括如下步骤：
（1）以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，a、以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现215 bp的扩增产物，则判断为西伯利亚鲟或西杂；或b、以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现252 bp的扩增产物，则判断为施氏鲟或施杂；
（2）对判断为西伯利亚鲟或西杂的鲟鱼DNA进一步鉴定：以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，以HLJSX48引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现163 bp的扩增产物，则为西杂，否则为西伯利亚鲟；
西伯利亚鲟引物对的前向引物序列为CAGATGCCAGTAACAGGCTGA（SEQ ID No.1所示），后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT（SEQ ID No.2所示）；施氏鲟引物对的前向引物序列为TGTGGGGTCACGGACTTTACAG（SEQ ID No.3所示），后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT（SEQ ID No.4所示）；HLJSX48引物对的前向引物序列为CTAAGCAAGCCTCTCGCTGT（SEQ ID No.5所示），后向引物序列为GTTTTCCCAGTCACGACGTT（SEQID No.6所示）。
进一步地，步骤（1）中，以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，50℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。
进一步地，步骤（1）中，以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，53℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。
进一步地，步骤（2）中，PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5 μL、ddH2O10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，49℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
采用本发明的方法，可以简单快速地可将西伯利亚鲟及以西伯利亚鲟为母本施氏鲟为父本杂交后代进行区分。
附图说明
图1西伯利亚鲟引物对在西伯利亚鲟、施氏鲟及其杂交后代中扩增产物的琼脂糖电泳图谱；
图2施氏鲟引物对在西伯利亚鲟、施氏鲟及其杂交后代中扩增产物的琼脂糖电泳图谱；
图3 HLJSX48引物对在西伯利亚鲟、施氏鲟及其杂交后代中扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。
具体实施方式
1.1.材料
1.1实验材料：
亲本样品：西伯利亚鲟34份，施氏鲟10份（取部分鳍条用无水乙醇保存）
子代样品：西杂12尾，施杂12尾（取整体用无水乙醇保存）
1.2实验器材：
PCR仪：Bio-Rad iCycler和MJ100;
离心机：Eppendorf Centrifuge5415D;
稳压稳流电泳仪：Bio-Rad powerPAC300;
凝胶成像系统：Alphalmage Multimage Light Cabinet;
电子天平、恒温水箱、培养箱、蒸汽灭菌器、摇床、离心机以及一些常用实验设备。
1.3主要药品和试剂：
双蒸水（MilliQ）、二水二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）、蛋白酶K（Merck公司）（10mg/mL）、Tris碱、浓盐酸、NaOH、MgCl2、Taq酶缓冲液、dNTPs(10mM)等等。
2. 方法
2.1总基因组DNA的提取
①切取不多于30mg的组织材料，放入装有200µl GA缓冲液的离心管中（离心管做好标记），涡旋振荡15sec。
②加入20µl Proteinase K（20mg/ml）溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠，在56̊C放置（消化），直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
③加入200µl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70̊C放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。（注意：在等待时应放入4̊C的冰箱中）
④加入200µl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中，并做好标记），12000rpm（~13,400×g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
⑥向吸附柱CB3中加入500µl 缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm（~13,400×g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑦向吸附柱CB3中加入600µl缓冲液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm（~13,400×g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑧重复步骤7。
⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000 rpm（~13,400×g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟（大概10min），以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验）
⑩将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200µl 洗脱缓冲液TE（本实验用ddH2O），室温放置2~5min，12000 rpm（~13,400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中。
2.2琼脂糖凝胶电泳检测DNA
①制备1%琼脂糖凝胶:用天平称取0.4~0.6g琼脂糖，倒入45mL左右的1倍TAE缓冲液，摇匀后置于微波炉中高温加热至完全溶解，取出待稍凉后，加入EB 2uL。
②胶板制备：将制胶板放置于水平位置，然后插入样品梳子。将上一步制得的琼脂糖凝胶液倒入制胶板槽内。冷却半小时待凝胶固定后轻轻拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内。加入TAE液使其浸没凝胶。
③加样：在点样板上点上1/6体积的点样缓冲液（溴酚蓝），后用枪吸2uL DNA溶液加入点样缓冲液并混匀，记录点样顺序和点样量。
④跑电泳：100V电压,400mA电流,电泳15~20min。电泳后根据紫外透射检测仪上电泳的亮度来确定模板DNA的浓度，若浓度高，可以加适量MilliQ（ddH2O）稀释，若浓度低可在PCR扩增时适量增加加入量。检测后的DNA置于-20̊C冰箱保存备用。
2.3引物设计
根据鲟鱼线粒体序列及微卫星序列，设计了三对引物，分别命名为西伯利亚鲟引物对、施氏鲟引物对和HLJSX48引物对，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。
西伯利亚鲟引物对的前向引物序列为CAGATGCCAGTAACAGGCTGA（SEQ ID No.1所示），
西伯利亚鲟引物对的后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT（SEQ ID No.2所示），
施氏鲟引物对的前向引物序列为TGTGGGGTCACGGACTTTACAG（SEQ ID No.3所示），
施氏鲟引物对的后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT（SEQ ID No.4所示），
HLJSX48引物对的前向引物序列为CTAAGCAAGCCTCTCGCTGT（SEQ ID No.5所示），
HLJSX48引物对的后向引物序列为GTTTTCCCAGTCACGACGTT（SEQ ID No.6所示）。
2.4 PCR扩增体系及条件
以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，50℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。用120v 1.5%的琼脂糖对PCR产物凝胶电泳后，用紫外线检测扩增后的片段。
以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，53℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。用120v 1.5%的琼脂糖对PCR产物凝胶电泳后，用紫外线检测扩增后的片段。
HLJSX48引物对 PCR扩增：PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，49℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。PCR反应产物使用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide Gel，简称PAAG)电泳检测，电泳结束后使用改良银染法进行染色-显影-扫描成像后保存数据结果。
3.结果
西伯利亚鲟引物对在以西伯利亚鲟及以西伯利亚鲟为母本的杂交后代DNA为模版的PCR扩增中出现长度215bp特异性条带，而在以施氏鲟及以施氏鲟为母本的杂交 后代DNA为模版的PCR扩增中并未出现特性性条带（图1）。而施氏鲟引物对在以施氏鲟及以施氏鲟为母本的杂交后代DNA为模版的PCR扩增中出现长度252bp特异性条带，而在以西伯利亚鲟为母本的杂交后代DNA为模版的PCR扩增中并未出现特异性条带（图2）。
HLJSX48引物对在以施氏鲟DNA为模版的PCR扩增中出现163bp的条带，在以西伯利亚鲟DNA为模版的PCR扩增中并不能扩增出该条带，而在杂交后代中均能扩增出该条带（图3）。
4 结果分析
根据上述结果可见，以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，a、以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现215 bp的扩增产物，则判断为西伯利亚鲟或西杂；或b、以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现252 bp的扩增产物，则判断为施氏鲟或施杂；
对判断为西伯利亚鲟或西杂的鲟鱼DNA进一步鉴定：以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，以HLJSX48引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现163 bp的扩增产物，则为西杂，否则为西伯利亚鲟；
实施例
西伯利亚鲟及西杂的鉴定方法，包括如下步骤：
（1）以待鉴定的鲟鱼DNA为模版（提取方法采用前面2 总基因组DNA的提取方法），以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，50℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。用120v 1.5%的琼脂糖对PCR产物凝胶电泳后，用紫外线检测扩增后的片段。如果出现215 bp的扩增产物，则判断为西伯利亚鲟或西杂；
或者以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，53℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。用120v 1.5%的琼脂糖对PCR产物凝胶电泳后，用紫外线检测扩增后的片段。如果出现252 bp的扩增产物，则判断为施氏鲟或施杂。
（2）对判断为西伯利亚鲟或西杂的鲟鱼DNA进一步鉴定：以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，以HLJSX48引物对作为引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性5min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，49℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。PCR反应产物使用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide Gel，简称PAAG)电泳检测，电泳结束后使用改良银染法进行染色-显影-扫描成像后保存数据结果。如果出现163 bp的扩增产物，则为西杂，否则为西伯利亚鲟。
Claims (4)
1.西伯利亚鲟及以西杂的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，a、以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现215 bp的扩增产物，则判断为西伯利亚鲟或西杂；或b、以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现252 bp的扩增产物，则判断为施氏鲟或施杂；所述待鉴定的鲟鱼为西伯利亚鲟、施氏鲟、西杂或施杂；所述西杂是指以西伯利亚鲟为母本施氏鲟为父本杂交后代；施杂是指以施氏鲟为母本西伯利亚鲟为父本杂交后代；
（2）对判断为西伯利亚鲟或西杂的鲟鱼DNA进一步鉴定：以待鉴定的鲟鱼DNA为模版，以HLJSX48引物对作为引物进行PCR扩增，如果出现163 bp的扩增产物，则为西杂，否则为西伯利亚鲟；
西伯利亚鲟引物对的前向引物序列为CAGATGCCAGTAACAGGCTGA，后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT；施氏鲟引物对的前向引物序列为TGTGGGGTCACGGACTTTACAG，后向引物序列为TATACACCATTATCTCTATGT；HLJSX48引物对的前向引物序列为CTAAGCAAGCCTCTCGCTGT，后向引物序列为GTTTTCCCAGTCACGACGTT。
2. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（1）中，以西伯利亚鲟引物对作为引物进行PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、前向引物0.5 μL、后向引物0.5 μL；PCR反应条件如下：95℃预变性5 min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，50℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。
3. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（1）中，以施氏鲟引物对作为引物进行PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、前向引物0.5 μL、后向引物0.5 μL；PCR反应条件如下：95℃预变性5 min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，53℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。
4. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增的反应体系为DNA模板1 μL、Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、前向引物0.5 μL、后向引物0.5 μL；PCR反应条件如下：95℃预变性5 min;然后循环35次，每一个循环包括94℃变性40s，49℃退火35s,72℃延伸50s；最后72℃下延伸10 min。
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| "Genetic and Morphometric Assessment of Sturgeon Species Bred in Closed Water Supply";Nurlan Khabibullovich Sergaliev等;《Journal of pharmaceutical sciences and research》;20171231;第9卷(第11期);第2296-2300页 * |
| "Polymorphism of the Mitochondrial DNA Control Region in Eight Sturgeon Species and Development of a System for DNA-Based Species Identification";N.S.Mugue等;《Russian Journal of Genetics》;20080630;第44卷(第7期);第793-798页 * |
| "五种鲟鳇鱼种质鉴定及遗传多样性分析";郭向贺;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20150315;正文第1.4节、第2.1.1节、第2.2.2节、第2.2.3节、第3.2节、第3.3.2节、第3.4节、第3.5节 * |
| "施氏鲟、达氏鳇及其杂交子代的分子鉴定";胡佳 等;《中国水产科学》;20100131;第17卷(第1期);第21页右栏第1段，第22页左栏第3段、右栏第9段，第23页表1，第24页右栏第1-2段、图2、左栏第2段，第25页表2、左栏第1段 * |
| "用磁珠富集法制备史氏鲟的微卫星分子标记";于冬梅等;《大连水产学院学报》;20071215;第22卷(第6期);第431-435页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108660223A (zh) | 2018-10-16 |
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