CN105861642B - 一种史氏鲟性别差异性分子标记及检测史氏鲟性别的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种史氏鲟性别差异性分子标记及检测史氏鲟性别的方法，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示的DNA序列采用PCR引物检测，根据PCR检测结果鉴定鲟鱼的性别，PCR引物的正向引物为F：5’‑CACACTGATGCTCTACATGT‑3’和反向引物R：5’‑AGGCTGGACAGTGATGCTGT‑3’，分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明提供了用于检测史氏鲟性别的核酸片段以及用于检测与史氏鲟相关的分子标记的PCR引物，该分子标记不受史氏鲟的年龄限制，准确可靠，操作方便，在生产方面具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种史氏鲟性别差异性分子标记及检测史氏鲟性别的方法。
背景技术
鲟鱼，为大型软骨硬鳞鱼类，营养及经济价值高，还可以作为观赏鱼类，性成熟时间长，一般最少5年以上，有的甚至达到15年之久，而鲟鱼没有第二性征，且幼鱼期只有一个“同样”的性腺，而区分鲟鱼的性别对鲟鱼的养殖和加工业都具有非常重要的意义。
目前，鲟鱼的性别鉴定的方法主要有微创手术法、内窥镜技术、超声波鉴定法、血液生化及激素指标法。微创手术法是鲟鱼性别鉴定的常规方法，首先将鲟鱼麻醉，然后用解剖刀在腹鳍前第4-5腹骨板间切一小口，用挖卵器取出性腺组织用肉眼在显微镜下进行观察，鉴别性别或者性腺的发育时期，此种方法容易造成鲟鱼的死亡，而且鲟鱼个体必须性腺发育，且对操作者经验水平要求高。内窥镜技术是将窥镜轴从鲟鱼生殖孔插入，使其前段紧贴性腺组织，通过目镜或外接成像系统进行观察，该方法同样受个体大小限制，而且鉴别率低，操作经验要求高。超声鉴别法是利用超声波的手段捕捉鲟鱼内脏器官的图像，然后分析得到结果，受腹部组织阻挡影响，同样鉴别率低，而且性腺发育不同程度对结果也产生影响。血液生化及激素指标法则是根据鲟鱼性腺发育的时期某些激素及生化指标的波动来检测鲟鱼的性别，该方法不稳定，需要探讨的指标多，而且检测程序复杂。
鲟鱼的性别由基因决定，而分子标记(molecular markers)，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达；检测手段简单、迅速。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测史氏鲟性别的核酸片段，该核酸片段的序列如SEQ ID NO.1所示，基因组DNA中含有该核酸片段的史氏鲟为雄鱼，反之则为雌鱼。
本发明的另一目的是提供用于检测与史氏鲟相关的分子标记的PCR引物，利用该PCR引物鉴定史氏鲟性别。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种史氏鲟性别差异性分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，所述SEQ ID NO.1所示的DNA序列采用PCR引物检测，根据PCR检测结果鉴定史氏鲟的性别。
作为优选，所述PCR引物的正向引物为F：5’-CACACTGATGCTCTACATGT-3’和反向引物R：5’-AGGCTGGACAGTGATGCTGT-3’，分别如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。
一种检测史氏鲟性别的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测史氏鲟的基因组DNA；
(2)以待测史氏鲟的基因组DNA为模板，利用引物F和R，通过PCR反应扩增出史氏鲟如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，其中，F：5’-CACACTGATGCTCTACATGT-3’，R：5’-AGGCTGGACAGTGATGCTGT-3’；
(3)采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，如果有286bp(接近300bp)的电泳条带，则是雄性史氏鲟；如果没有286bp(接近300bp)的电泳条带，则是雌性史氏鲟。
作为优选，所述步骤(2)中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA1 μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix2.0μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水。
作为优选，所述步骤(2)中PCR反应的条件为：94℃5分钟；进行30个循环的94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒；72℃5分钟。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的分子标记不受史氏鲟的年龄限制，可用于史氏鲟的早期选择，可显著提高史氏鲟养殖的经济效益。
(2)本发明提供了用于检测与史氏鲟相关的分子标记的PCR引物来检测史氏鲟的性别，如SEQ ID NO.1所示的DNA序列的方法准确可靠，操作方便，在生产方面具有重要的应用价值。
(3)本发明提供了用于检测史氏鲟性别的核酸片段，如SEQ ID NO.1所示的DNA序列的检测，为史氏鲟的性别鉴定提供了科学依据。
附图说明
图1是本发明中的实施例2中的电泳胶图；
图2是本发明中的实施例3中的电泳胶图；
其中，中间泳道为分子量Marker，Marker最上面一条带为1500bp，最下面一条带为100bp，胶图Marker左侧为雄鱼，右侧为雌鱼。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1 与鲟鱼性别相关的分子标记的获得
1.1 已知性别鲟鱼群体的获得
所采用的群体为江苏某鲟鱼养殖场已知性别的史氏鲟，雌雄鱼各有50尾。剪取鱼体背鳍鳍条于95％乙醇-20℃保存，用于基因组DNA提取。
1.2 鲟鱼基因组DNA提取
本试验采用常规酚氯仿方法抽提鲟鱼鳍条中的基因组DNA，具体步骤如下：
(1)取0.3～0.5g鳍条于1.5ml Eppendorf管中，剪碎，在超净工作台上开盖干燥20min；
(2)待乙醇基本挥发后，TE缓冲液(10mmol/ml Tris、1mmol/ml EDTA、SDS 5％，pH＝8.0)洗涤1～2次，再加入600μl DNA抽提液(0.001mol/LTris-C1、0.1mol/L EDTA、SDS5％，pH＝8.0)和3μl蛋白酶k(200mg/ml)，55℃水浴消化3h左右，前30min每10min轻摇离心管1次，消化至管内液体澄清；
(3)加入自配酚氯仿溶液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)600μl，轻轻来回颠倒离心管10min，12000r离心10min，取上层水相用等体积上述酚氯仿再抽提，直至水相与有机相之间没有白色沉淀；
(4)再用氯仿抽提1次，取出上清液，加入2倍体积已预冷的无水乙醇沉淀DNA，颠倒混匀，4℃静置30min，12000r离心10min，沉淀再用70％乙醇洗涤，离心晾干沉淀后加50μl无菌水溶解，4℃保存备用或-20℃长期保存。
1.3 采用RAD测序(Restriction-site Associated DNA，酶切位点相关DNA)获得雄性鲟鱼特异的DNA片段
基于Hiseq2000高通量测序平台，对每个个体进行RAD测序，测序策略为PE91bp，每个个体产生30M左右的reads，对雌雄鱼之间的reads进行比对分析，发现有1对reads只存在于雄性个体，而在雌性个体不存在，这对reads的序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
实施例2 与鲟鱼性别相关的分子标记的验证
2.1 提取待验证鲟鱼鳍条中的基因组DNA
待验证鲟鱼为实施例1中的群体，雌雄分别随机挑选12尾，DNA抽提方法如实施例1中所述。
2.2 扩增含雄性特异性reads的核苷酸片段
根据雄鱼特异性reads的DNA序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5分别设计引物，引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。以2.1中的基因组DNA为模板，PCR反应体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 2.0μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；PCR反应条件为：94℃5分钟；进行30个循环的94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒；72℃5分钟。其中，雄鱼可扩增出特异的核苷酸片段，序列如SEQ ID NO.1所示，雌鱼则无此扩增产物。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱如附图1所示，胶图中间泳道为分子量Marker，Marker最上面一条带为1500bp，最下面一条带为100bp，每条带间隔100bp。胶图Marker左侧为雄鱼，右侧为雌鱼，雄鱼可扩增得到一条明显的接近300bp的条带，雌鱼无明显的扩增条带。
实施例3 与鲟鱼性别相关的分子标记的应用
3.1 提取待测鲟鱼鳍条中的基因组DNA
待测鲟鱼为浙江某鲟鱼养殖场的已知性别的史氏鲟，雌雄分别随机挑选12尾，DNA抽提方法如实施例1中所述。
3.2扩增鲟鱼性别相关的分子标记
采用序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物，以3.1中的基因组DNA为模板，采用2.2中的PCR反应体系和条件。结果显示，能扩增出286bp条带的为雄鱼，雌鱼则无此扩增产物。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱如附图2所示，胶图中间泳道为分子量Marker，Marker最上面一条带为1500bp，最下面一条带为100bp，每条带间隔100bp。胶图Marker左侧为雄鱼，右侧为雌鱼，雄鱼可扩增得到一条明显的接近300bp的条带，雌鱼无明显的扩增条带。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
SEQ ID NO.1
雄性鲟鱼特异的DNA序列 长度286bp
CACACTGATGCTCTACATGTGCCAGCTTTCTCTCAGCATCTGTCCATGTAGTACCAAGGGTGGGTGCCACTGCAAGCTCTCTTCATTTGTTGCATTTCCATGCTGTTGTTAAGGGTCGCATTTATACAGAATTCCAAAATACTCCAAAGTAAAAACAGCATTCTGATAGTATAAGAATTTAACTATTTCAAGTAATGGATGCGGTGCGTTGCTGTATGTCTAACGAAACATTTTCAGAAATACCAAACATCAACCGAAAATCATTTACAGCATCACTGTCCAGCCT
SEQ ID NO.2
PCR正向引物F 长度20bp
CACACTGATGCTCTACATGT
SEQ ID NO.3
PCR反向引物R 长度20bp
AGGCTGGACAGTGATGCTGT
SEQ ID NO.4
RAD测序获得的雄性鲟鱼特异read 长度91bp
TCAAGAGTCCAGAGCCCTAACCACTACTCCACACTGATGCTCTACATGTGCCAGCTTTCTCTTAGCATCTGTCCATGTAGTACCAAGGGTG
SEQ ID NO.5
RAD测序获得的雄性鲟鱼特异read 长度91bp
CTAGCCCACAACACCTCAGGAAGGCTGGACAGTGATGCTGTAAATGATTTTCGGTTGATGTTTGGTATTTCTGAAAATGTTTCGTTAGACA
Claims (6)
1.一种史氏鲟性别差异性分子标记，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种史氏鲟性别差异性分子标记，其特征在于，所述SEQID NO.1所示的DNA序列采用PCR引物检测，根据PCR检测结果鉴定史氏鲟的性别。
3.如权利要求2所述的一种史氏鲟性别差异性分子标记，其特征在于，所述PCR引物的正向引物为F：5’-CACACTGATGCTCTACATGT-3’和反向引物R：5’-AGGCTGGACAGTGATGCTGT-3’，分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.一种检测史氏鲟性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测史氏鲟的基因组DNA；
(2)以待测史氏鲟的基因组DNA为模板，利用引物F和R，通过PCR反应扩增出史氏鲟如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，其中，F：5’-CACACTGATGCTCTACATGT-3’，R：5’-AGGCTGGACAGTGATGCTGT-3’；
(3)采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，如果有286bp的电泳条带，则是雄性史氏鲟；如果没有286bp的电泳条带，则是雌性史氏鲟。
5.如权利要求4所述的一种检测史氏鲟性别的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 2.0μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水。
6.如权利要求4所述的一种检测史氏鲟性别的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR反应的条件为：94℃5分钟；进行30个循环的94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒；72℃5分钟。
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