CN113186300B - 一种快速鉴定中华鲟遗传性别的基因组序列片段zhxf-2及应用 - Google Patents

一种快速鉴定中华鲟遗传性别的基因组序列片段zhxf-2及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴定中华鲟遗传性别的基因组序列片段ZHXF‑2及其应用。本发明公开了一段雌性中华鲟序列，雌性中华鲟基因组特异性片段ZHXF‑2如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，雌雄基因组DNA可扩增出的阳性参考DNA片段如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。利用本发明提供的PCR反应体系，对待测中华鲟进行PCR扩增，当扩增结果片段为985bp和317bp两条条带时，则待测中华鲟为雌性。当PCR扩增结果仅可扩增出317bp一条条带时，待测中华鲟为雄性。本发明提供的中华鲟序列片段可以快速有效鉴定中华鲟雌雄。利用本方法可以有效提高中华鲟养殖效率，进一步提高中华鲟养殖合理性，人为调节养殖中华鲟雌雄比例，更为合理的利用养殖中华鲟的人力、物力和财力。

Description

一种快速鉴定中华鲟遗传性别的基因组序列片段ZHXF-2及 应用
技术领域
本发明属于涉及动物分子遗传学领域，涉及一种快速鉴定中华鲟遗传性别的基因组序列片段ZHXF-2及应用。
背景技术
中华鲟是典型的溯河洄游性鱼类，由于人类活动，中华鲟的数量急剧下降，已被我国列为濒危物种。中华鲟平时生活在东海、南海的沿海大陆架地带，在海中生长发育。当雄鱼长到9至18岁，体长为170厘米，重为50千克以上，雌鱼长到14至26岁，可达到初次性成熟。开始成熟的个体于7-8月间由海进入江河，在淡水栖息一年性腺逐渐发育。
大多数脊椎动物为雌雄异体，且在形态和生理上体现出明显的性别二态性。性别是决定两性生殖繁殖的关键环节。随着分子生物学的发展，多种类型的性别标记被开发出来，包括微卫星标记、单核苷酸多态性、随机扩增多态性DNA和限制性片段长度多态性。性别特异分子标记的开发应用和性别决定基因的鉴定一方面可以提高与性别相关的经济性状，为实现性控育种提供必要的工具；另一方面也为阐明鱼类性别决定的分子机理奠定基础。性别分子标记是开发性别控制技术的重要工具。
发明内容
为解决上述技术问题，提供一种快速鉴定中华鲟遗传性别的基因组序列片段ZHXF-2及应用。
本发明的方案是：
一种快速鉴定中华鲟遗传性别的基因组序列片段ZHXF-2，雌性中华鲟基因组特异性片段ZHXF-2如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
以雌雄中华鲟基因组DNA为模板可扩增出的阳性参考DNA片段如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
用于检测SEQ ID NO:1所示核苷酸的引物为引物1F和1R。
用于检测SEQ ID NO:2所示核苷酸的引物为引物2F和2R。
用于检测SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸的引物，所述的引物信息为：
表1
序列信息 退火温度(℃)
1F AAACCGCTACTTGGACAT 58
1R ACCGTATTGATTTGACAGG 58
2F AGAACTGAAGGTGCTCAA 58
2R GCCTACTGGGAAAGACG 58
优选地，所述的引物在中华鲟鱼性别鉴定中应用。
一种鉴定中华鲟雌雄的试剂盒，包含所述的引物对。
一种鉴定中华鲟雌雄的方法，其特征在于，包含所述的引物对。
优选地，对待测中华鲟的基因组DNA进行PCR扩增，当扩增结果片段为985bp和317bp两条条带时，则待测中华鲟为雌性，当PCR扩增结果仅可扩增出317bp一条条带时，待测中华鲟为雄性。
进一步优选地，提取待鉴定中华鲟DNA；利用所述引物对样品进行PCR扩增；
进一步，所述的PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul。
进一步，所述的PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
进一步，电泳方法为，在2％琼脂糖凝胶电泳20分钟，电压为120V。
本发明有益效果：
利用本发明可以快速准确的鉴定各个种群中华鲟性别。利用本发明可以实现中华鲟全雌化养殖，节省了养殖空间，合理利用中华鲟养殖的人力、物力和财力。对待测中华鲟进行PCR扩增，当扩增结果片段为529bp和317bp两条条带时，则待测中华鲟为雌性。当PCR扩增结果仅可扩增出317bp一条条带时，待测中华鲟为雄性。当实验失败时没有条带。避免了实验失败情况下，实验结果没有条带误导雌雄结果的判定，造成实验结果误差。
附图说明
图1为鉴定的中华鲟卵巢；
图2为鉴定的中华鲟精巢；
图3为提取的中华鲟DNA完整度检测图；
图4为野生中华鲟性别鉴定图，(M为DL2000 plus)；
图5为鉴定的人工养殖子二代中华鲟性别图，(M为DL2000 plus)。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
用内窥镜鉴定中华鲟性别并筛选雌雄中华鲟差异DNA片段选择发育良好，个体较大的中华鲟个体，并且其性腺发育在二期。在中华鲟腹部用手术刀划开2厘米的口子，把内窥镜深入中华鲟的腹部，观察中华鲟性腺的形态。图1内窥镜鉴定卵巢，图2为鉴定的中华鲟精巢。分别取一段中华鲟精巢和卵巢各3个个体样本，提取这6个样本的DNA，进行全基因组测序，通过比较基因组学方法对雌雄中华鲟基因组进行比对，筛选出雌雄差异的DNA片段，并根据差异片段设计引物，然后扩大样本数量进行有效性验证，最终获得雌性中华鲟基因组特异性片段ZHXF-2如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。
实施例2
提取待鉴定中华鲟DNA
(1)取出保存的鳍条样本，剪取0.5g左右，放入2mL的灭菌离心管中，加入1×TE无菌缓冲液，4℃浸泡12h；
(2)取出鳍条组织，放入含有352ul的无菌抽提缓冲液中，轻轻混匀，加入40ul20％SDS和10ul 20mg/mL蛋白酶K(终浓度为400ug/mL)，混匀；
(3)56℃孵育4h，每隔半小时轻轻摇晃离心管以利消化。若组织不易消化，可延长孵育时间至8h，或37℃消化过夜：
(4)待组织消化完全，取出离心管，加入300ul 6M NaCI溶液，立刻剧烈震动30S；
(5)12000rpm离心10min；
(6)弃沉淀，将上清液倒入新的离心管中，再以同等条件离心一次，取上清液，加入等体积的预冷异丙醇，.20℃放置1h以上；
(7)4℃，12000rpm离心15min；
(8)弃上清液，沉淀用70％乙醇溶液洗涤一次，37℃烘干或自然晾干；
(9)加入50ul灭菌双蒸水溶解DNA，待完全溶解后稀释成100ng/uL，置于4℃冰箱保存备用。
(10)用1％琼脂糖凝胶鉴定提取的DNA完整度，所用Marker为DL2000 plus，结果如图3所示。
实施例3鉴定2011年野生中华鲟的性别
提取待鉴定24尾2011年野生中华鲟DNA(经内窥镜鉴定为12雄12雌)。利用利用本发明提供的引物(表1)进行PCR反应。PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/LdNTP 2ul，MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水10.5ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。然后在2％琼脂糖凝胶电泳30分钟，电压为120V。在照胶仪上观察结果，具体结果如图4所示，经过本方法鉴定24尾中华鲟有12尾为雄性，12尾为雌性。其结果和内窥镜结果一致。
实施例4鉴定全人工繁殖中华鲟的性别
提取待鉴定24尾2011年全人工繁殖中华鲟DNA(经内窥镜鉴定为12雄12雌)。利用本发明提供的引物(表1)进行PCR反应。PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水10.5ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。然后在2％琼脂糖凝胶电泳30分钟，电压为120V。在照胶仪上观察结果，具体结果如图5所示，经过本方法鉴定24尾中华鲟有12尾为雄性，12尾为雌性。其结果和内窥镜结果一致。
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure GDA0003502099800000051
Figure GDA0003502099800000061
Figure GDA0003502099800000071
SEQUENCE LISTING
<110>中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所
<120>一种快速鉴定中华鲟遗传性别的基因组序列片段ZHXF-2及应用
<130>6
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>985
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ACCGTATTGATTTGACAGGTAAACGAGGGGCAGCTGCACGCAATAAGGCAGCTGCAACCGCTTACCTAGATATCATGCGGGATTACAAATAGGGGCCAGGGGAACGCTGTTCTTTTCCTTCGTTTGGGTTTAACCAAGGACCGAGAAGGACCTTAAACTGTGTTACTCTGCAAAGAGTTGTGTGTGGGAGTTTGTGTGGGATACTTGTAAAAACTAACTGTCTGTCTTGTTTCCGAATCACCAGACAGCTAAAAAGCACATCCGGAGCTGTCGCACTGGGCGAGCACGAGCCGGATCACGTCTTCACCTACTGTCACAGAATTCCATGTGTTCACCCACCACTATCACGACTGCACGCACCCGAGACGGGTGACCGTGCTTTGTTCCCCCTTTTTGTGTTCAGGACTGTATCCTGCGTTTTGTCAGCCCCTGCTTTACACATCGTTGTGTATTGCCGGGCTTATTATTATTTACGGTCACTAGACCGCTGCTTTAATTAAAAAGCCTTTTTCCCCTGGACTACCGTCTGTCTGTCTGTCATTCCTGCACCGCATCACGGTTACACCAGTACCCCTCACCACCCACATTGCCACAGTAATATACATGATTAAGGTGTGCAATATAACTGGGCTACTATTGATGTGCAATAATTACTATTTATGTGCAAACTATAATCAAGTTTATCAAGTGTGCTATATTTTTTTTTGATTCAGCCGGATATAATGTTTGTTGGGCCAGATGGTTAACTATTGAGTGCTATAATATAACTTTGGATGTGATTTATTATGAAATCATTTGTTCTTCATTTGAGCCAACTGTCCAAAAGGTCTATTACCTGTAGAGCACAATAAATGCTCCATTTTTACTGTCTTTCTGGGTTCTGTTCCAGCTTCTTCTCTCCTCTGTCCTGTTTTTAATTCCTCTGCATAGGATTCTAGTAGTGTTACTCATGGATCGTGCACATGTTATGTCCAAGTAGCGGTTT 985
<210> 2
<211>317
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
AGAACTGAAGGTGCTCAACTCAGTTTCTGTGCCAACACCAATTGGCATTCTGGACATGCCCCACAAAACTGTTCCACTTCTTGATATATTCCTATCCAATAAAACCTTTTTTAAATGTGTTCCCTTGTTTTCTGAACTCCCAATTGTCCCTCTAAAAAATGACCATGGGCTAGTTTCAAAACTGTTGTTTTATACTTCCTTGGGGCCATTAACTGTTCTACCAGCTCTCACATATTAGAATTGCTCACCCTGTAGAACAGATCATTTTTAACTATAACATTTGGGAAATTAAAATTTCTGCGTCTTTCCCAGTAGGC
317
<210>3
<211>18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>3
AAACCGCTACTTGGACAT18
<210>4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>4
ACCGTATTGATTTGACAGG 19
<210>5
<211>18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>5
AGAACTGAAGGTGCTCAA18
<210>6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>6
GCCTACTGGGAAAGACG 17

Claims (6)

1.一种快速鉴定中华鲟遗传性别的基因组序列片段ZHXF-2，其特征在于：雌性中华鲟基因组特异性片段ZHXF-2核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，雌雄基因组DNA均可扩增出的阳性参考DNA片段为SEQ ID NO:2所示。
2.用于快速鉴定中华鲟遗传性别的引物，其特征在于：所述引物用于检测SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸，引物信息为：
引物1F：AAACCGCTACTTGGACAT；
引物1R：ACCGTATTGATTTGACAGG；
引物2F：AGAACTGAAGGTGCTCAA；
引物2R：GCCTACTGGGAAAGACG。
3.权利要求2所述的引物在中华鲟鱼性别鉴定中应用。
4.一种鉴定中华鲟雌雄的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的引物对。
5.一种鉴定中华鲟雌雄的方法，其特征在于，使用权利要求3所述引物对对待测中华鲟的基因组DNA进行PCR扩增，当扩增结果片段为985bp和317bp两条条带时，则待测中华鲟为雌性，当PCR扩增结果仅可扩增出317bp一条条带时，待测中华鲟为雄性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，提取待鉴定中华鲟DNA；利用所述引物对样品进行PCR扩增；把PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳30分钟进行分离，具体电压为120V；根据分离结果统计PCR扩增产物的条带大小；
PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP2ul，MgCl23ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水10.5ul；
PCR反应程序为：94℃预变性3min; 94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环； 72℃延伸10min； 4℃保存。
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