CN111763723A - 中华鲟无损伤性别鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中华鲟无损伤性别鉴定方法，采用TRIZOl裂解法提取中华鲟腹鳍鳍条总RNA；逆转录获得中华鲟腹鳍鳍条模板cDNA；设计中华鲟透明带糖蛋白zp3.2特异性引物和内参基因β‑actin特异性引物；反应程序：95℃变性3 s，60℃退火30 s，72℃延伸反应25 s，40次循环，实施qPCR。根据qPCR的结果分析，若中华鲟腹鳍ΔCt值（Ctzp3.2‑Ctβ‑actin）在6.32～8.33区间内，则判断中华鲟个体为雌性，若中华鲟腹鳍ΔCt值（Ctzp3.2‑Ctβ‑actin）在9.09～11.63区间内，则判断中华鲟个体为雄性；采用内窥镜技术对本发明方法鉴定不同年龄群体中华鲟性别进行验证，准确率在78%以上。本发明方法可以快速有效的对中华鲟2龄及以上个体进行雌雄性别鉴定，相较于传统手术鉴定方法对中华鲟伤害极小，且可鉴别年龄更早。

Description

中华鲟无损伤性别鉴定的方法
技术领域
本发明涉及一种基于荧光定量PCR(qPCR)技术进行中华鲟无损伤早期性别鉴定的方法，属于分子生物学领域。
背景技术
中华鲟Acipensersinensis是一种古老的大型海河回游性鱼类，曾经分布于我国的长江和珠江河流，由于近年来过度捕捞、环境污染、水利工程建设等人为原因造成了中华鲟的数量急剧下降，现在珠江流域的中华鲟已经绝迹，中华鲟已成为极度濒危的物种。
然而，中华鲟个体大，性成熟晚，平均10龄以上达到性成熟，从外形上无法辨别雌雄，甚至在繁殖期也没有明显的第二性征，很大程度上限制了鲟鱼性别鉴定的准确性。目前鲟鱼性别鉴定的方法主要是活体手术法，还有需借助仪器的超声波、内窥镜等方法，但一般要到5龄左右才能保障鉴别的准确度。由此可见，开展一种中华鲟无损伤早期性别鉴定的方法势在必行。
发明内容
本发明的目的是提供了一种无损伤简单快速的鉴定中华鲟低龄个体性别的方法。
一种基于荧光定量PCR(qPCR)技术进行中华鲟无损伤早期性别鉴定的方法包括如下步骤：
(2)总RNA提取：采用TRIZOL裂解法提取中华鲟腹鳍鳍条总RNA，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量；
(3)cDNA模板制备：逆转录获得中华鲟腹鳍鳍条模板cDNA；
(4)引物设计：设计中华鲟透明带糖蛋白基因zp3.2特异性引物和内参基因β-actin特异性引物；
(5)荧光定量PCR：采用SYBRGreenI染料法进行荧光定量PCR。
(6)数据分析：根据ΔCt值(Ctzp3.2-Ctβ-actin)的大小判断中华鲟个体性别。
上所述的引物设计，透明带糖蛋白基因zp3.2为目的基因，β-actin为内参基因，具体序列如下
Figure BDA0002531665080000011
根据权利要求2所述的中华鲟无损伤性别鉴定的方法，其特征在于，荧光定量PCR步骤中，
以中华鲟腹鳍cDNA的浓度20-30ng/μL作为检测模板，在反应条件为：2×SYBR Green IFast qPCR Master mix：10μL；50×ROX 2μL；上、下游引物各1μL；模板cDNA：6μL；反应程序为：95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸反应25s，40次循环，并进行熔解曲线分析。
2×SYBR Green I Fast qPCR Master mix：10μL；50×ROX 2μL的混合试剂选自RealUniversal彩色荧光定量预混试剂(天根生化科技(北京)有限公司，http://www.tiangen.com/？productShow/t1/2/id/518.html)
上述的数据分析，其特征在于：ΔCt值(Ctzp3.2-Ctβ-actin)在6.3～8.3区间内，则判断中华鲟个体为雌性，若ΔCt值(Ctzp3.2-Ctβ-actin)在9.0～12.0区间内，则判断中华鲟个体为雄性。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
1.本发明提供的中华鲟性别鉴定方法不需要对中华鲟进行手术，不会造成损伤。
2.本发明提供的中华鲟性别鉴定方法将中华鲟性别鉴定年限提前至2龄。
本发明公开了一种基于荧光定量PCR(qPCR)技术进行中华鲟无损伤早期性别鉴定的方法，采用TRIZOl裂解法提取中华鲟腹鳍鳍条总RNA；逆转录获得中华鲟腹鳍鳍条模板cDNA；设计中华鲟透明带糖蛋白zp3.2特异性引物和内参基因β-actin特异性引物用于中华鲟特异性荧光定量PCR扩增，建立了中华鲟快速荧光定量PCR扩增体系；将中华鲟腹鳍cDNA的浓度调至20ng/μL作为检测模板，制备20ul检测体系，2×SYBRGreen I Fast qPCRMaster mix：10μL；(50)×ROX 2μL；上、下游引物各μL；模板DNA：6μL。按照反应程序：95℃变性/3s，60℃退火/30s，72℃延伸反应/25s，40次循环，实施qPCR。根据qPCR的结果分析，若2龄中华鲟子二代腹鳍ΔCt值(Ctzp3.2-Ctβ-actin)在6.32～8.33区间内，则判断中华鲟个体为雌性，若2龄中华鲟子二代腹鳍ΔCt值(Ctzp3.2-Ctβ-actin)在9.09～11.63区间内，则判断中华鲟个体为雄性；采用内窥镜技术对本发明方法鉴定不同年龄群体中华鲟性别进行准确性验证，准确率在78％以上。本发明方法可以快速有效的对中华鲟2龄及以上个体进行雌雄性别鉴定，相较于传统手术鉴定方法对中华鲟伤害极小，且可鉴别年龄更早，从而为中华鲟的种质资源保护和人工种群管理研究提供了一项重要技术手段，具有较大的科学意义和实用价值。
附图说明
图1为荧光定量引物熔解曲线图。
图2为中华鲟2龄子二代雌鱼性腺组织切片。
图3为中华鲟2龄子二代雄鱼性腺组织切片。
具体实施方式
实施例1
中华鲟样本的获取：
湖北宜昌中华鲟研究所养殖池内取20尾1.5龄子二代中华鲟，20尾2龄子二代中华鲟和20尾3龄子二代中华鲟。解剖分别取性腺组织和腹鳍组织，取部分性腺组织浸泡于10％福尔马林用于组织切片，其余性腺组织和腹鳍组织液氮速冻后置于-80℃保存。
总RNA提取：
采用TRIZOL裂解法提取中华鲟腹鳍鳍条总RNA，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。具体步骤如下：1取0.1g中华鲟腹鳍置于TRIZOL试剂(天根生化，北京)中，用手术剪刀剪碎成悬浮液状态；2加入200ul氯仿试剂，剧烈震荡30s，静置15min后在高速冷冻离心机中4℃、12000rpm条件下离心15min，取上清液；3上清液中加入500ul异丙醇，混匀后静置15min，4℃、12000rpm条件下离心15min后，离心管底部出现白色沉淀，即为总RNA；4倒掉离心管内液体，保留白色沉淀，用预冷的75％乙醇溶液清洗白色沉淀，4℃、12000rpm条件下离心2min，此清洗过程重复两次；5将离心管倒置于吸水纸上晾干，离心管内加入50ul无RNA酶双蒸水，于-80℃保存
cDNA模板制备：
采用FastKing一步法RT-PCR试剂盒(天根生化，北京)获得中华鲟腹鳍鳍条模板cDNA，具体步骤如下：取中华鲟腹鳍总RNA16μL，加入试剂盒中的2×FastKing One Step RT-PCRMasterMix试剂4μL，于离心管中混匀；2离心管置于42℃水浴锅中水浴15min；3上一步骤结束后立即置于95℃中水浴3min，然后置于冰上冷却，冷却后于-20℃保存。
引物设计：
根据Genebank数据库中已发表的中华鲟透明带糖蛋白基因zp3.2序列(序列号FJ610234.1)和中华鲟β-actin基因序列(序列号KY457447.1)设计中华鲟透明带糖蛋白基因zp3.2特异性引物和内参基因β-actin特异性引物，透明带糖蛋白基因zp3.2为待检测的目的基因，β-actin为内参基因；引物具体序列见表1
表1中华鲟荧光定量PCR特异性扩增引物
Figure BDA0002531665080000031
荧光定量PCR：
中华鲟腹鳍cDNA的浓度20ng/μL作为检测模板，20ul反应体系：2×SYBR Green I FastqPCR Master mix：10μL；(50)×ROX 2uL；上、下游引物各μL；模板DNA：6μL，每个样品设置3个β-actin基因反应体系和3个zp3.2基因反应体系，采用美国应用生物系统公司的StepOne plus实时荧光定量PCR扩增仪进行荧光定量PCR反应。反应程序：95℃变性/3s，60℃退火/30s，72℃延伸反应/25s，40次循环。循环结束后，使用熔解曲线程序进行特异性引物分析，以每个特异性引物是否只出现一个单位判断引物的特异性。
分别检测中华鲟性腺ΔCt值(Ctzp3.2-Ctβ-actin)和中华鲟腹鳍ΔCt值(Ctzp3.2-Ctβ-actin)，数据处理方法采用2-△△Ct法，检测基因相对表达量值ΔCt(ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因)，ΔCt值越小，目的基因相对内参基因的表达量越大，以基因相对表达量值ΔCt作为判断雌雄的依据。
中华鲟特异性引物分析
中华鲟荧光定量PCR的特异性引物熔解曲线图见图1，图1中呈现两条曲线，分别为zp3.2基因和β-actin基因的熔解曲线，每条曲线都只有一个单峰，表示该基因只扩增出指定大小的特异性片段，无其他非特异性扩增出现。
2中华鲟子二代不同群体雌雄个体zp3.2 mRNA相对表达量
表2和表3分别是1.5龄、2龄和3龄子二代中华鲟雌雄个体中性腺和腹鳍zp3.2 mRNA相对表达量的ΔCt值。在不同年龄的中华鲟子二代雌性性腺中，zp3.2基因的ΔCt值有明显差异，可以区分雌雄，但性腺结果不能作为无损伤鉴定手段。在不同年龄的中华鲟子二代雌性性腺中，zp3.2基因的ΔCt值在1.5龄中华鲟子二代雌雄个体中无明显差异，无法区分雌雄，在2龄及3龄个体中有明显差异，可以区分雌雄。2龄中华鲟子二代腹鳍zp3.2基因的ΔCt值可以作为中华鲟无损伤性别鉴定的依据。
表2.中华鲟不同年龄子二代雌雄性腺zp3.2 mRNA相对表达量
Figure BDA0002531665080000041
表3.中华鲟不同年龄子二代雌雄腹鳍zp3.2 mRNA相对表达量
Figure BDA0002531665080000042
Figure BDA0002531665080000051
性腺组织切片：由于2龄及以下中华鲟性腺组织外观上无法区分雌雄，需要进行性腺组织切片来确认取样个体的性别。取上述试验中的2龄中华鲟性腺组织浸泡于10％福尔马林后进行石蜡切片，用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色法进行染色，观察细胞形态。中华鲟雌鱼性腺切片可明显观察到卵细胞，见图2。中华鲟雄鱼性腺切片可明显观察到精细胞，见图3，由于2龄中华鲟性腺在外观上均为白色细带状，外观难以区分，中华鲟性腺组织切片方法确认了采集的2龄中华鲟样本的性别。
实施例2
为验证此方法在不同年龄群体中华鲟性别鉴定中的准确性，取不同年龄群体的中华鲟子二代共240尾，取腹鳍组织进行RNA提取和qPCR定量检测，同时进行内窥镜检查鉴定性别，内窥镜鉴定性别的结果作为性别分子标记鉴定结果的验证参照。由于目前阶段内窥镜技术最小能对5龄以上的中华鲟进行性别鉴定，内窥镜技术对5龄以下中华鲟无法完全准确地鉴定性别，故选取5龄及以上中华鲟作为试验材料。各年龄群体中华鲟样本量及基础生物学数据见表4。
表4不同年龄群体中华鲟基础生物学信息
Figure BDA0002531665080000052
对2011年至2014年4个年龄群体中华鲟子二代各60尾个体腹鳍样本进行zp3.2基因相对表达量检测，根据ΔCt值对个体性别进行判定。通过内窥镜检查结果对zp3.2基因相对表达量鉴定中华鲟子二代性别结果进行验证，2011、2012、2013和2014年中华鲟子二代群体准确率分别为78.3％、81.6％、86.6％和83.3％，240个个体整体准确率为82.5％，具体结果见表5。表明本方法对不同年龄群体中华鲟子二代性别鉴定都具有较高的准确率。
表5ΔCt值判定中华鲟性别结果准确率
Figure BDA0002531665080000061

Claims (3)

1.中华鲟无损伤性别鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)总RNA提取：采用TRIZOL裂解法提取中华鲟腹鳍鳍条总RNA；
(2)cDNA模板制备：根据步骤(1)所获得的中华鲟腹鳍鳍条总RNA逆转录获得中华鲟腹鳍鳍条模板cDNA；
(3)引物设计：以中华鲟透明带糖蛋白基因zp3.2特异性引物为目的基因和β-actin特异性引物为内参基因；
(4)荧光定量PCR：采用SYBRGreen I染料法进行荧光定量PCR；
(5)数据分析：根据步骤(4)定量检测所得到的ΔCt值(Ctzp3.2-Ctβ-actin)的大小判断中华鲟个体性别，其中，ΔCt值(Ctzp3.2-Ctβ-actin)在6.3～8.3区间内，则判断中华鲟个体为雌性，若ΔCt值(Ctzp3.2-Ctβ-actin)在9.0～12.0区间内，则判断中华鲟个体为雄性。
2.根据权利要求1所述的中华鲟无损伤性别鉴定的方法，其特征在于，其特征在于，步骤(2)所述的中华鲟透明带糖蛋白基因zp3.2特异性引物，β-actin特异性引物的具体序列如下：
Figure FDA0002531665070000011
3.根据权利要求2所述的中华鲟无损伤性别鉴定的方法，其特征在于，荧光定量PCR步骤中，以中华鲟腹鳍cDNA的浓度20-30ng/μL作为检测模板，在反应条件为：2×SYBR GreenI Fast qPCR Master mix：10μL；50×ROX 2μL；上、下游引物各1μL；模板cDNA：6μL；反应程序为：95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸反应25s，40次循环，并进行熔解曲线分析。
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