CN108315443A - 一种准确简便鉴定沼泽山雀性别的引物及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种准确简便鉴定沼泽山雀性别的引物及鉴定方法。提取沼泽山雀的基因组总DNA；2)以基因组总DNA为模板，利用引物2550F和RevP1进行PCR扩增反应，获得扩增产物；将获得扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，用Dolphin‑Doc凝胶成像仪进行拍照记录，根据带型判断沼泽山雀的性别：雌性为两条带长度分别为447bp和635bp，雄性为一条带长度为447bp。本发明利用对CHD基因在W,Z染色体上的特异序列的扩增所产生的不同带型来判断沼泽山雀的性别，无需特殊仪器要求，鉴定方法简便易行，快速准确，可重复性强，为今后对沼泽山雀分子生物学领域进一步深入探究奠定了基础。

Description

一种准确简便鉴定沼泽山雀性别的引物及鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种准确简便的鉴定沼泽山雀性别的方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
性别是鸟类最重要的特征之一，雌雄个体的鸟类往往在生理，行为等方面具有差别。鸟类的性别鉴定，特别是性别的早期鉴定对鸟类的遗传疾病防治，种群结构和群体遗传学分析等有着非常重要的意义。全世界约有50％的鸟类为雌雄同型鸟，很难通过外部特征进行性别鉴定。通过外科手术(剖腹和镜检)直接观察生殖腺进行鉴定，不适用于体积较小的鸟类，而且均会对鸟类造成伤害甚至导致不育。细胞水平的性别鉴定主要是对W染色体进行观察，雌性的性染色体一条大(Z)，一条小(W)，而雄性个体为两条较大的(Z)染色体，但是在实际应用中存在一定的困难，鸟类的染色体数量大，而且对染色体的大小划分容易造成人为差异。
沼泽山雀是一种单态性鸟，无论在幼鸟还是成鸟时期，都很难从外观形态或其他行为上区分雌雄。因此，开发一种准确简便的沼泽山雀性别鉴定方法，对后续的分子研究极为重要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种准确简便的，可操作性强的沼泽山雀性别鉴定方法。
本发明采用的技术方案是：一种准确简便鉴定沼泽山雀性别的引物，所述的引物的DNA序列为：
2550F 5’-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3’
RevP1 5’-TGAGGAAACAAGCACTGGAC-3’
一种准确简便鉴定沼泽山雀性别的方法，包括如下步骤：
1)提取沼泽山雀的基因组总DNA；
2)以基因组总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物；
PCR扩增反应程序为：94℃/7min；94℃/30s，58℃/30s，72℃/45s，30个循环；72℃/7min，4℃保存。
3)将获得扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，用Dolphin-Doc凝胶成像仪进行拍照记录，根据带型判断沼泽山雀的性别。带型判断标准为：雌性为两条带，雄性为一条带，即雌性为两条带，长度分别为447bp和635bp，雄性为一条带，长度为447bp。
本发明的有益效果是：本发明的方法，样本简单(如羽毛、血液样本)、采样量低、可非损伤性取样、双阳性检验。本发明的方法主要是基因水平的性别鉴定技术，使得鉴定结果更为可靠，可广泛应用于鸟类的性别鉴定。自染色体螺旋蛋白基因(Chromobox-helicase-DNA binding gene,CHD)是鸟类性染色体上同源区的基因，该基因在演化的过程中相对保守。在Z和W染色体上各有一个拷贝，该拷贝外显子序列相似，但内含子序列长度存在差异。因此，本发明根据内含子序列两侧的侧翼序列设计引物，在PCR的结果中，雄性可以扩增出1个条带，雌性可以扩增出两个条带，因而，可以根据PCR电泳结果中的条带数判定鸟类的性别。本发明利用对CHD基因在W,Z染色体上的特异序列的扩增所产生的不同带型来判断沼泽山雀的性别，无需特殊仪器要求，鉴定方法简便易行，快速准确，可重复性强，为今后对沼泽山雀分子生物学领域进一步深入探究奠定了基础。
附图说明
图1为沼泽山雀CHD基因部分序列PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1
1、利用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒(产品目录：DP304-02)提取沼泽山雀的基因组总DNA。
1)剪取冰箱中保存的滤纸血样3mm×3mm，放到1.5ml EP管中，加200μl缓冲液GA，振荡至血样彻底悬浮；2)在EP管中加20μl Proteinase K溶液，充分混匀；3)将EP管放入恒温水浴器，56℃过夜放置直至血样完全溶解；4)溶解后加200μl缓冲液GB，颠倒混匀，于70℃下放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；5)加200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，(此时可能会产生絮状沉淀)，简短离心以去除管盖内壁的水珠；6)将以上所得溶液及絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)离心1min，倒去废液，将吸附柱CB3放回收集管中；7)在吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm(～13400×g)离心1min，倒去废液，将吸附柱CB3放回收集管中；8)在吸附柱CB3中加600μl缓冲液PW，12000rpm(～13400×g)离心1min，倒去废液，将吸附柱CB3放回收集管中；9)重复操作步骤8)；10)将吸附柱CB3放到收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，倒去废液，将吸附柱CB3在室温放置数分钟，直至彻底晾干在吸附柱中残留的漂洗液；11)将吸附柱CB3放入另一个干净的离心管中，将40μl洗脱缓冲液TE悬空滴加到吸附膜的中间部位，室温放置2-5min，12000rpm(～13400×g)离心2min，使溶液最终流到离心管中；12)重复操作步骤11)，最后共得到80μl基因组样本溶液；将提取出的基因组总DNA样本于-20℃保存。
2、以提取的基因组总DNA为模板，进行PCR扩增反应
PCR扩增反应程序为：94℃/7min；94℃/30s，58℃/30s，72℃/45s，30个循环；72℃/7min，4℃保存。
3、2％琼脂糖凝胶电泳检测
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度为2％，在凝胶未干前加入SYBR Green Ⅰ DNA荧光染料染色。取各基因组2.5μl，与0.5μl 6×Loading Buffer混合后点样，用Marker DL2000对照标记。电泳仪设置电压100V，时间为25min。之后使用Dolphin-Doc凝胶成像系统观察基因组提取结果。图1中我们随机选择了8只在繁殖期捕获的沼泽山雀亲鸟血液样本，经本发明进行性别鉴定后，1号和6号样品出现两个条带，长度分别为447bp和635bp，鉴定为雌性，其余6个样本出现一条带，长度为447bp，鉴定为雄性。这与我们在血液样本采集过程中，通过孵卵斑进行性别鉴定的结果一致，说明本发明的方法可靠，准确。

Claims (6)

1.一种准确简便鉴定沼泽山雀性别的引物，其特征在于，所述的引物的DNA序列为：
2550F 5’-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3’
RevP1 5’-TGAGGAAACAAGCACTGGAC-3’。
2.权利要求1所述的引物在鉴定沼泽山雀性别中的应用。
3.一种准确简便鉴定沼泽山雀性别的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取沼泽山雀的基因组总DNA；
2)以基因组总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物；
3)将获得扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，用Dolphin-Doc凝胶成像仪进行拍照记录，根据带型判断沼泽山雀的性别。
4.根据权利要求3所述的一种准确简便鉴定沼泽山雀性别的方法，其特征在于，步骤2)，
5.根据权利要求3所述的一种准确简便鉴定沼泽山雀性别的方法，其特征在于，步骤2)，PCR扩增反应程序为：94℃/7min；94℃/30s，58℃/30s，72℃/45s，30个循环；72℃/7min，4℃保存。
6.根据权利要求3所述的一种准确简便鉴定沼泽山雀性别的方法，其特征在于，步骤3)带型判断标准为：雌性为两条带，雄性为一条带。
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