CN102134600A - 一种朱鹮性别鉴定的pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种朱鹮性别鉴定的PCR方法。本发明提供了一种检测鸟类性别的引物对。本发明提供的检测鸟类性别的引物对，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列1所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列2所示的核苷酸。本发明的实验证明，本发明利用CHD基因内含子在Z、W染色体上长度差异，设计跨内含子引物，根据PCR扩增产生不同的带型对朱鹮的性别进行了简便、准确的鉴定。本技术对朱鹮的野生幼鸟性比监测、饲养种群的科学配对体系构建和再引入释放个体的选择和合理搭配具有重要意义。

Description

一种朱鹮性别鉴定的PCR方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种朱鹮性别鉴定的PCR方法。

背景技术

鸟类CHD基因，即染色体螺旋蛋白基因(chromo-helicase-DNA binding gene)，位于性染色体，鸟类的性染色体为ZW型，雄性为ZZ，雌性为ZW。CHD基因在大多数非平胸型鸟类中有两个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，其中CHD-W为W染色体连锁，CHD-Z为Z染色体连锁。由于CHD基因外显子高度保守，而内含子在两性间突变较大，现已成为非平胸型鸟类性别鉴定最重要的分子标记。

性别是鸟类最重要的特征之一，雌雄个体的鸟类往往在生理，行为等方面具有差别。鸟类的性别鉴定特别是性别的早期鉴定对鸟类的遗传疾病防治，种群结构和群体遗传学分析等有着非常重要的意义，尤其是对濒危鸟类的保护和管理具有重要的指导作用。全世界约有50％的鸟类为雌雄同型鸟，很难通过外部特征进行性别鉴定。通过外科手术(剖腹和镜检)直接观察生殖腺进行鉴定，不适用于体积较小的鸟类，而且均会对鸟类造成伤害甚至导致不育，不适用于濒危鸟类的性别鉴定。细胞水平的性别鉴定主要是对W染色体进行观察，雌性的性染色体一条大(Z)，一条小(W)，而雄性个体为两条较大的(Z)染色体，但是在实际应用中存在一定的困难，鸟类的染色体数量大，而且对染色体的大小划分容易造成人为差异。随着分子生物学技术的发展，利用性染色体连锁探针和PCR技术鉴定鸟类性别的方法已经在很多鸟类中得到了成功的应用。

朱鹮是雌雄同型的鸟类，雌雄个体颜色及体型相似，其性别从形态学特征上很难区分。准确简便的对朱鹮进行性别鉴定，将有助于对这一濒危物种进行深入研究和实施有效的保护措施，如野生种群在不同气候和食物压力下出生个体的性比变化、饲养种群的提前分群饲养和科学配对、再引入释放个体的正确选择等。已有的从外部形态特征如体重，喙长等鉴别朱鹮性别的的方法仍存在争议。目前，只能根据饲养人员的经验和交配行为来区分朱鹮成鸟的性别，对于野生及尚无交配行为的笼养幼鸟，则难以准确地鉴定性别。刘凌云(1992)用朱鹮羽髓细胞培养，通过检测染色体结构和核型分析来鉴定性别。此外，采用分子生物学技术对朱鹮进行性别鉴定的研究仅见于Li等(2001)。该方法对雌性个体W染色体上的性别相关基因进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后W染色体(雌性，ZW)可显示1条带，Z染色体(雄性，ZZ)无条带。但由于该方法缺少阳性对照，容易导致误判(将由于实验失误造成的结果“无条带”误判为雄性)，在实际的保护和研究中很少应用。利用CHD基因对朱鹮进行性别鉴定的研究至今未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测鸟类性别的引物对。

本发明提供的引物对，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列1所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列2所示的核苷酸。

本发明的第二个目的一种检测鸟类性别的PCR试剂。

本发明提供的检测鸟类性别的PCR试剂，由所述引物对、dNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液组成。

所述引物对中的一条引物为序列表中的序列1所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列2所示的核苷酸。

所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0.15μM；所述dNTP在所述的PCR试剂中的终浓度为125μM；所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的终浓度为0.05U/μL。

DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为ET101-02；PCR缓冲液购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为ET101-02(DNA聚合酶自带)；

dNTP购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为CD117-01。

所述鸟类为朱鹮。

含有所述的PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

所述引物对或所述的PCR试剂或所述试剂盒在检测鸟类性别中的应用也是本发明保护的范围；所述鸟类具体为朱鹮。

本发明的第三个目的是提供一种辅助检测待测鸟类性别的方法。

本发明提供的辅助检测待测鸟类性别的方法，包括如下步骤：用所述引物对或所述的PCR试剂或所述试剂盒中的引物对对待测鸟类基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物中含有大小分别为552bp和358bp的两条片段，则所述待测鸟类候选为雌性，若所述PCR扩增产物中只含有一条大小为552bp的片段，不含有大小为358bp的片段，则所述待测鸟类候选为雄性。

所述PCR扩增中，以待测鸟类的基因组DNA为模板；

所述PCR扩增的退火温度为55℃。

所述PCR扩增产物中，所述552bp片段为序列表中序列3所示的核苷酸，

所述PCR扩增产物中，所述358bp片段为序列表中序列4所示的核苷酸。

所述检测所述PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。

本发明的实验证明，本发明利用CHD基因内含子在Z、W染色体上长度差异，设计跨内含子引物，根据PCR扩增产生不同的带型对朱鹮的性别进行了简便、准确的鉴定。本发明无需特殊仪器要求，只需要掌握一般的PCR技术和琼脂糖凝胶电泳操作，就可进行鉴定，可重复性强，简便易行，准确率为100％。此外，本发明使用非损伤取样的方法，利用1枚朱鹮羽毛提取基因组DNA，将对朱鹮取样时的伤害降至最低。本技术明显提高了朱鹮性别鉴定的效率和准确性，对朱鹮的野生幼鸟性比监测、饲养种群的科学配对体系构建和再引入释放个体的选择和合理搭配具有重要意义。

附图说明

图1为朱鹮CHD基因部分序列PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳图

图2为朱鹮CHD基因部分序列PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、PCR鉴定朱鹮性别

对陕西省汉中33只朱鹮(Nipponia Nippon，Ding CQ.2010.Crested Ibis.Chinese Birds.1(2)：156-162，公众可从北京林业大学获得。)的性别进行了鉴定，每只朱鹮采1枚体羽。

一、朱鹮羽毛基因组DNA提取：

1)取已灭菌的2.0ml离心管置于试管架，编号为1-33；

2)用已灭菌的镊子从每只朱鹮取一根清洁干净的羽毛，用眼科剪剪取羽髓部1cm长度，尽量剪碎；

3)向每个离心管加入700μl STE溶液(将10mL Tris-HCl(1M；pH8.0)，2mL EDTA(0.5M；pH 8.0)，100mL浓度为1M的NaCl水溶液，双蒸水定容至1L，高压灭菌)、5μl10％SDS(质量百分含量)和15μl蛋白酶K(20mg/mL)，置于60r/m转速，55℃恒温水浴锅中过夜消化(18-20小时)；

4)消化完全后，向每个离心管中加入700μl Tris饱和酚(pH 8.0)，混匀15分钟形成乳浊液，12000r/m离心10min；

5)取上清液至2.0ml离心管中，重复步骤4)；

6)取上清液至2.0ml离心管中，加入350μl Tris饱和酚(pH 8.0)，350μl氯仿∶异戊醇混合物(24∶1)，混匀10min，12000r/m离心10min；

7)取上清液至2.0ml离心管中，加入600μl氯仿∶异戊醇混合物(24∶1)，混匀10min，12000r/m离心10min；

8)取上清液至1.5ml离心管中，加入1200μl冰乙醇(即为-20℃无水乙醇)，水平轻摇，可见絮状DNA，-20℃放置30min，12000r/m离心10min，DNA沉于管底；

9)弃去上清液，加入1200μl 75％乙醇水溶液，12000r/m离心10min；

10)重复步骤9)；

11)弃去上清液，沥干，置于室温(25℃)，风干DNA；

12)风干后的DNA溶于40μl TE(pH 8.0)中，保存于4℃冰箱备用；

13)检测提取的DNA质量：

使用NanoDrop ND-1000紫外分光光度仪(美国NanoDrop Technologies，Inc)检测浓度和纯度，OD260/280≈1.8，说明提取的DNA较纯，可用于后续实验。

二、鉴定朱鹮的性别

1、设计引物：

设计上下游引物：CISF：5′-CGTCAGTTTCCCTTTCAG-3′(序列1)；CISR：5′-CCAGTGCTTGTTTCCTCA-3′(序列2)；

2、利用设计的引物进行PCR扩增：

PCR扩增采用20μl体系：

2μl 10×PCR Buffer(购自天根生化科技(北京)有限公司，TaqDNA聚合酶ET101-02中含的Taq Buffer)；

1μl dNTP(2.5mM，终浓度为125μM；购自天根生化科技(北京)有限公司目录号：CD117-01)；

上下游引物各0.3μl(10μM，终浓度均为0.15μM；合成于生工生物工程(上海)有限公司)；

0.8ul上述得到的基因组DNA(稀释后浓度≈100ng/ul)；

和0.4μl TaqDNA聚合酶(2.5U/ul，终浓度为0.05U/μL；购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号ET101-02)，加双蒸水补齐至20μl。

扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃复性7min，4℃保存。

3.2％琼脂糖凝胶电泳检测：

通过2％(质量百分含量)琼脂糖凝胶110V电压电泳30min，用凝胶成像系统进行拍照，部分结果如图1和图2所示，图1和图2均为朱鹮CHD基因部分序列PCR扩增产物，M表示的Marker购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为MD103，M-1表示的Marker购自北京博迈德科技有限公司，产品目录号为DM06；泳道1-18分别对应编号为1-18的朱鹮。从图中可以看出，泳道1、2、3、11、18均得到两条片段(长片段≈550bp，短片段≈350bp)，泳道4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17均得到一条较长片段(片段≈550bp)，分别回收片段，测序(北京三博远志生物技术有限责任公司)。结果表明，长片段均为552bp，其核苷酸序列为序列表中的序列3，经比对，序列3与黑脸琵鹭CHD1Z基因部分片段(genbank登录号：AY464013)第95-647位核苷酸序列的相似性为97％，因此认为该序列即为朱鹮的CHD基因部分序列，记作CHD-Z；短片段为358bp，其核苷酸序列为序列表中的序列4，经比对，序列4与黑脸琵鹭CHD1W基因部分片段(genbank登录号：AY464014)第12-374位核苷酸的反向互补序列的相似性为99％，因此认为该序列即为朱鹮的CHD基因部分序列，记作CHD-W；CHD基因内含子在Z、W染色体(鸟类的性染色体为ZW型，雄性为ZZ，雌性为ZW)上长度有差异，因此可以根据带型来判断性别：雌性为两条带，雄性为一条带；因此，编号为1、2、3、11、18的朱鹮均为雌性，编号为4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17的朱鹮均为雄性。

根据繁殖管理记录(观察交配行为)，编号为1、2、3、11、18的朱鹮均为雌性，编号为4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17的朱鹮均为雄性，这与上述PCR鉴定的结果一致。实施例中的18只朱鹮个体的PCR性别鉴定结果与实际繁殖管理记录完全吻合，因此，本发明鉴定技术的正确率达到100％。

采用同样的方法鉴定其余15只朱鹮，结果与繁殖管理记录一致。

Claims (10)

1.一种检测鸟类性别的引物对，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列1所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列2所示的核苷酸。

2.一种检测鸟类性别的PCR试剂，由权利要求1所述的引物对、dNTP、DNA聚合酶和PCR缓冲液组成。

3.根据权利要求2所述的PCR试剂，其特征在于：

所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0.15μM；

所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为125μM；

所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的浓度为0.05U/μL。

4.根据权利要求2或3所述的PCR试剂，其特征在于：

所述鸟类为朱鹮。

5.含有权利要求2-4中任一所述的PCR试剂的试剂盒。

6.权利要求1所述的引物对或权利要求2-4中任一所述的PCR试剂或权利要求5所述试剂盒在检测鸟类性别中的应用；所述鸟类具体为朱鹮。

7.一种辅助检测待测鸟类性别的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的引物对或权利要求2-4中任一所述的PCR试剂或权利要求5所述试剂盒中的引物对对待测鸟类进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物中含有大小分别为552bp和358bp的片段，则所述待测鸟类候选为雌性，若所述PCR扩增产物中含有大小为552bp片段且不含有大小为358bp的片段，则所述待测鸟类候选为雄性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述PCR扩增中，以待测鸟类的基因组DNA为模板；

所述PCR扩增的退火温度为55℃。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：

所述PCR扩增产物中，所述552bp片段为序列表中序列3所示的核苷酸，

所述PCR扩增产物中，所述358bp片段为序列表中序列4所示的核苷酸。

10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：

所述检测所述PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。

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