CN110643715B - 一种快速鉴定矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速鉴定矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的方法，包括：(1)提取矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼样品的基因组DNA；(2)采用特异性引物进行PCR扩增；(3)PCR扩增产物经凝胶电泳后拍照记录比对电泳结果，爪哇拟虾虎鱼在175bp处有一条清晰的特异性鉴别条带，矛尾复虾虎鱼在140bp处有一条清晰的特异性鉴别条带。本发明鉴别准确、简单快速、价格低廉、对仪器设备要求低，适合大规模鉴别操作，具有良好的应用前景。

Description

一种快速鉴定矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的方法
技术领域
本发明属于鱼类鉴定领域，特别涉及一种快速鉴定矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的方法。
背景技术
矛尾复虾虎鱼(Synechogobius hasta)隶属于鲈形目、虾虎鱼亚目、虾虎鱼科、复虾虎鱼属，俗称沙光鱼、油光鱼、光鱼、推浪鱼、海鲶鱼，该鱼为一年生浅海底栖性鱼类，属虾虎鱼亚目鱼类中为最大的鱼种之一，经济价值较高。因其适应温度和盐度的能力较强，分布甚广，在我国沿海以及朝鲜、日本和印度尼西亚的近海、咸淡水域均有分布。
爪哇拟虾虎鱼(Pseudogobius javanicus)栖息于近岸和咸淡水的河口区，繁殖能力强，个体小，无食用价值。两种鱼在幼苗时十分相似，仅凭肉眼区分较为困难，在矛尾复虾虎鱼池塘养殖过程中，如大量繁殖爪哇拟虾虎鱼苗，争夺矛尾复虾虎鱼饵料，将严重影响矛尾复虾虎鱼的池塘养殖产量，养殖户蒙受损失。
尽管两种鱼是非近缘物种，但两者形态特征十分相似，两种鱼在幼苗时十分相似，仅凭肉眼区分较为困难，在矛尾复虾虎鱼池塘养殖过程中，如大量繁殖爪哇拟虾虎鱼苗，争夺矛尾复虾虎鱼饵料，将严重影响矛尾复虾虎鱼的池塘养殖产量，养殖户蒙受损失。为此，有必要采用分子生物学的技术手段，对二者进行分类和鉴定。而到目前为止，并没有相关研究被发表。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速鉴定矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的方法，该方法鉴别准确、简单快速、价格低廉、对仪器设备要求低，适合大规模鉴别操作，具有良好的应用前景。
本发明提供了一种快速鉴定矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的方法，包括：
(1)提取矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼样品的基因组DNA；
(2)采用特异性引物进行PCR扩增；
其中，引物序列为：
上游引物：5′-CAGTTTTTCCAGTGTAGCTGT-3'；
下游引物：5′-GTTGATCTTGAACTCCACAAC-3'；
(3)PCR扩增产物经凝胶电泳后拍照记录比对电泳结果，爪哇拟虾虎鱼在175bp处有一条清晰的特异性鉴别条带，矛尾复虾虎鱼在140bp处有一条清晰的特异性鉴别条带。
所述步骤(2)中的PCR扩增体系为：总体积25μL，2.5μL 10×PCR buffer，0.5μLdNTP，2.5μL Mg2+，1μL DNA模板，上下游引物各1μL，0.25μL Taq DNA聚合酶，用灭菌双蒸馏水补足体积。
所述步骤(2)中的PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃30s，55℃35s，72℃1min，36个循环，最后55℃延伸35s。
所述步骤(3)中凝胶电泳为2.2％琼脂糖凝胶电泳；电泳缓冲液为1×TAE，电压不超过5V/cm，电泳时间30-60min，取3μL PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明是基于分子生物学技术原理建立的鉴别方法，所用引物为自行设计和优化，来源于NCBI数据库。该方法无需依赖专业的分类学背景，也不要求具有长期从事鱼类鉴别的丰富经验；无需高级的荧光定量等实施操作仪器，只需要简单的分子生物学仪器就可以进行操作，具有准确快捷、经济实用的特点。
有益效果
本发明克服了形态学特征无法准确鉴定矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的不足，在遗传育种工作中具有重要意义，填补了现有研究的空白；鉴别准确、简单快速、价格低廉、对仪器设备要求低，适合大规模鉴别操作，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的电泳图片；其中，M为marker，P1-P12为爪哇拟虾虎鱼，A1-A12为矛尾复虾虎鱼，矛尾复虾虎鱼在140bp处有一条清晰的特异性鉴别条带，爪哇拟虾虎鱼在175bp处有一条清晰的特异性鉴别条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)提取矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼样品的基因组DNA：
①用简单消毒的剪刀剪取矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼约8mm2的尾鳍组织，用镊子稍稍捏碎置入干净的1.5ml塑料离心管中。
②加入600μl裂解液，裂解液包括1)Tris-Hcl 10molL-1，EDTA-2Na 1mol L-1，pH＝8.0；2)10％SDS；3)蛋白酶K 20mgmL-1；1)、2)、3)的体积比为20:10:1；
③55℃水浴3h后加入600μL的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)轻轻摇晃20min后5000r/min离心10min，重复一次；
④提取上清液转移到干净的1.5mL的离心管里面，倒入2倍的无水乙醇(-20℃预冷)，12000r/min离心10min；
⑤倒出无水乙醇，倒入1mL的75％乙醇溶解DNA，12 000r/min离心5min，重复1次；
⑥倒出液体，风干后倒入30μL的纯水，得到基因组DNA。
(2)采用特异性引物进行PCR扩增；
上游引物：5′-CAGTTTTTCCAGTGTAGCTGT-3'；
下游引物：5′-GTTGATCTTGAACTCCACAAC-3'；
PCR扩增体系为：总体积25μL，2.5μL 10×PCR buffer，0.5μL dNTP(10mmol/L)，2.5μL Mg2+(25mmol/L)，1μL DNA模板，上下游引物各1μL(10μmol/L)，0.25μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，用灭菌双蒸馏水补足体积。
PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃30s，55℃35s，72℃1min，36个循环，最后55℃延伸35s。
(3)PCR扩增产物经2.2％琼脂糖凝胶电泳后拍照记录比对电泳结果：电泳缓冲液为1×TAE，电压不超过5V/cm，电泳时间30-60min，取3μL PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，矛尾复虾虎鱼在140bp处有一条清晰的特异性鉴别条带，爪哇拟虾虎鱼在175bp处有一条清晰的特异性鉴别条带。
任取50条矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼分别采用上述方法以及人工形态学观察鉴别，结果如下表：
矛尾复虾虎鱼 爪哇拟虾虎鱼 准确率
标准 28 22 /
本实施例 28 22 100％
形态参数鉴别 24 20 88.0％
由此可见，本发明相较于形态参数鉴别法可以保证100％的鉴别准确率，判断快速，具有良好的实用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省海洋水产研究所
<120> 一种快速鉴定矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagtttttcc agtgtagctg t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttgatcttg aactccacaa c 21

Claims (4)

1.一种快速鉴定矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼的方法，包括：
（1）提取矛尾复虾虎鱼和爪哇拟虾虎鱼样品的基因组DNA；
（2）采用特异性引物进行PCR扩增；
其中，引物序列为：
上游引物：5' - CAGTTTTTCCAGTGTAGCTGT-3'；
下游引物：5' - GTTGATCTTGAACTCCACAAC-3'；
（3）PCR扩增产物经凝胶电泳后拍照记录比对电泳结果，在175bp处有一条清晰的特异性鉴别条带为爪哇拟虾虎鱼，在140bp处有一条清晰的特异性鉴别条带为矛尾复虾虎鱼。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的PCR扩增体系为：总体积25μL，2.5μL 10×PCR buffer，0.5μL dNTP，2.5μL Mg2+，1μL DNA模板，上下游引物各1μL，0.25μL Taq DNA聚合酶，用灭菌双蒸馏水补足体积。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃30s，55℃35s，72℃1min，36个循环，最后55℃延伸35s。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中凝胶电泳为2.2%琼脂糖凝胶电泳；电泳缓冲液为1× TAE，电压不超过5V/cm，电泳时间30-60min，取3μL PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
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