CN101333563B - 肉鸽性别鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
肉鸽性别鉴定方法，属于分子生物学技术领域。通过原鸡和小天鹅CHD基因内含子两端的外显子序列比对，在两端外显子上分别设计上下游引物：Psf：5’CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3’；Psr：5’GAATATCTTCTGCTCCTACTG3’；再以Psf/Psr引物扩增肉鸽羽髓基因组DNA的Z和W染色体上的CHD基因，最后经过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，根据带型判断性别，其中雌性为两条带，雄性为一条带。本发明只需掌握一般的PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染操作，就可进行鉴定，重复性强，准确率高(100％，n＝280)。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。
背景技术
目前，雏鸽的性别有根据初生重、脚趾长短比较、翻缸等经验与方法判断，缺乏科学依据的同时，准确率也不高。
鸟类的CHD基因，即染色体螺旋蛋白基因(chromo-helicase-DNA bindinggene)位于性染色体上，在非平胸鸟类中存在两个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，其中CHD-W为W连锁，CHD-Z为Z连锁。在大多数鸟类，此基因的外显子高度保守，而内含子在两性间突变较大，因此可以根据公母间内含子长度不同进行性别鉴定。
由于肉鸽雌性为ZW型，雄性为ZZ型，因此根据内含子两端外显子设计跨内含子的上下游引物，进行PCR扩增，再对PCR产物进行电泳检测时，在雌性可以得到不同长度的片段，而在雄性只能得到相同长度的片段。Griffiths等(1998)根据CHD基因设计了P2、P8引物对，证实可以鉴定笑翠鸟、欧洲食蜂鸟、深红玫瑰鹦鹉、雨燕、鸡、八哥、蓝冠山雀等27种鸟类的性别。另外，鸟类性别鉴定所用的基因组DNA大多是从血液样本中提取，易对动物造成伤害。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、准确、快速、无伤害的肉鸽性别鉴定方法。
本发明的技术方案是：通过原鸡和小天鹅CHD基因内含子两端的外显子序列比对，在两端外显子上分别设计上下游引物：Psf：5’CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3’；Psr：5’GAATATCTTCTGCTCCTACTG3’；再以Psf/Psr引物扩增肉鸽羽髓基因组DNA的Z和W染色体上的CHD基因，最后经过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，根据带型判断性别，其中雌性为两条带，雄性为一条带。
本发明利用CHD基因内含子在Z、W染色体上长度差异，设计跨内含子引物，根据PCR扩增产生不同的带型来判断肉鸽的性别。本发明只需掌握一般的PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染操作，就可进行鉴定，重复性强，准确率高(100％，n＝280)。另外，本发明利用羽髓提取肉鸽基因组DNA，再经过PCR扩增进行性别鉴定，能将对肉鸽的伤害减到最小，并能尽早准确判定肉鸽性别，不仅有利于肉鸽育种计划的进行，还有利于肉鸽的集约化生产，提高肉鸽经济效益。
本发明在对肉鸽羽髓基因组DNA W和Z染色体上CHD基因内含子进行扩增时，采用10μl体系：取1μl 10×PCR Buffer、1.5mM MgCl2、200μMdNTP、5pmol引物、100ng肉鸽羽髓基因组DNA和0.5U Taq DNA聚合酶，加双蒸水补至10μl。
另，本发明肉鸽羽髓基因组DNA的提取方法是：取肉鸽颈部或翅部羽毛，将末端羽髓部剪碎，置于1.5ml指形管，加600μl裂解液，37℃处理3h；然后加入5μl蛋白酶K，55℃水浴过夜后，再加入等体积的Tris饱和酚、等体积酚-氯仿-异戊醇和等体积氯仿-异戊醇各抽提1次；得到的上清用2.5倍体积冷无水乙醇沉淀DNA，70％冰乙醇洗两次，室温干燥，300μl TE 37℃溶解过夜，4℃保存备用。
附图说明
图1为肉鸽CHD基因PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
1、肉鸽羽髓DNA的提取：
(1)取肉鸽颈部或翅部羽毛3-5根，将末端羽髓部剪碎，置于1.5ml指形管，加600μl裂解液(50m MTris-HCl，100Mm EDTA，100Mm NaCl，0.5％SDS，pH 8.0)，37℃处理3h，然后加入5μl蛋白酶K(20mg/ml)，55℃水浴过夜；
(2)加入等体积的Tris饱和酚，温和摇动30min，12000rpm离心10min，吸取上清液于1.5ml离心管内；
(3)加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，温和摇动10min，12000rpm离心10min，吸取上清于另一干净离心管内；
(4)加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，温和摇动10min，12000rpm离心10min，吸上清于另一干净离心管内；
(5)2.5倍体积冷无水乙醇沉淀DNA，70％冰乙醇洗两次，室温干燥，300μl TE 37℃溶解过夜，4℃保存备用。
2、设计引物：
通过原鸡和小天鹅CHD基因内含子两端的外显子序列比对，在两端外显子上分别设计上下游引物：Psf：5’CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3’；Psr：5’GAATATCTTCTGCTCCTACTG3’
3、用得到的基因组DNA为模版进行PCR扩增：
PCR扩增采用10μl体系：10×PCRBuffer 1μl、MgCl21.5mM、dNTP 200μM、引物Psf/Psr各5pmol、模版DNA 100ng、Taq DNA聚合酶0.5U，加双蒸水至10μl。扩增程序为：94℃/4min；94℃/30s，56℃/55s，72℃/30min，35个循环；72℃/10min，4℃保存。
4、10％PAGE胶(聚丙烯酰胺凝胶)电泳检测、银染：
10％PAGE胶120V电泳6h，然后银染，根据显色的带型判断性别：雌性为两条带，雄性为一条带，准确率高达100％。
通过切胶回收、克隆测序发现，扩增的片段长度分别为：CHD-Z 264bp，CHD-W 244bp(见图1)。
<110>扬州大学
<120>肉鸽性别鉴定方法
<160>2
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>利用CHD基因内含子在Z、W染色体上长度差异，设计跨内含子引物
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caaggatgag aaactgtgca a
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<212>DNA
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<223>利用CHD基因内含子在Z、W染色体上长度差异，设计跨内含子引物
<400>2
gaatatcttc tgctcctact g
Claims (2)
1.一种肉鸽性别鉴定方法，其特征在于通过原鸡和小天鹅CHD基因内含子两端的外显子序列比对，在两端外显子上分别设计上下游引物：Psf：5’CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3’；Psr：5’GAATATCTTCTGCTCCTACTG3’；以Psf/Psr引物扩增肉鸽羽髓基因组DNA的Z和W染色体上的CHD基因，经过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，根据带型判断性别，两条带为雌性，一条带为雄性。
2.根据权利要求1所述肉鸽性别鉴定方法，其特征在于肉鸽羽髓基因组DNA的提取方法是：取肉鸽颈部或翅部羽毛，将末端羽髓部剪碎，置于1.5ml指形管，加600μl裂解液，37℃处理3h；然后加入5μl蛋白酶K，55℃水浴过夜后，再加入等体积的Tris饱和酚、等体积酚-氯仿-异戊醇和等体积氯仿-异戊醇各抽提1次；得到的上清用2.5倍体积冷无水乙醇沉淀DNA，70％冰乙醇洗两次，室温干燥，300μl TE 37℃溶解过夜，4℃保存备用。
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