CN103468825B - 一种用于鹅性别鉴定的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鹅性别鉴定的引物对、试剂盒及方法。本发明提供的用于检测性别鉴定的引物对序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；通过引物对鹅血液基因组DNA上CHD基因在Z、W染色体上不同拷贝内含子，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据带型对鹅性进行鉴定：一条带为公鹅；两条带为母鹅。本发明仅需普通PCR和琼脂糖凝胶电泳技术就可以对鹅性别进行简单、准确的鉴定。

Description

一种用于鹅性别鉴定的引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种鹅性别鉴定的引物、试剂盒及方法。
背景技术
由于公母个体间生长速度，生长性能等种质特性的不同，在现代养禽业中大多进行早期性别鉴定。目前传统的性别鉴定除了金银色羽、快慢羽等方法外，主要通过翻肛鉴别。但翻肛鉴别由于需要在雏禽出生24h内进行鉴定，且劳动强度大、需要专业人员才能进行鉴定，此外还存在一定的误鉴率。公母鹅外形外貌差异较小，根据外形对鹅进行公母鉴定难度较大，对实验采样和生产都有一定的影响，因此通过采取鹅羽毛、血液等，通过分子生物学手段进行性别鉴定具有重要意义。
雄性禽类性染色体为ZZ型，雌性染色体为ZW型，这样就能通过扩增W染色体上特异性序列而进行雌雄鉴别。目前位于性染色体上的性连锁基因主要有CHD1、ATP5A1及假基因序列EE0.6、XhoⅠ等。禽类CHD基因，即染色体螺旋蛋白基因，在大多数非平胸鸟类中具有两个同源拷贝CHD-Z和CHD-W，CHD-Z为Z染色体连锁，CHD-W为W染色体连锁。CHD基因内含子在雌雄个体之间差异较大，通过设计特异性引物进行PCR扩增之后，再对PCR产物进行电泳检测，在母鹅个体上可见两条长度不同的条带，而在公鹅上仅有一条带。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种简单、准确、快速的鹅性别鉴定的引物对。该引物对为：
上游引物CHD-F：5’-ggtggcttaatgaggtagca-3’，SEQ ID NO.1；
下游引物CHD-R：5’-aggatggaaatgagtgca-3’,SEQ ID NO.2。
本发明的目的之二是一种鹅性别鉴定的PCR试剂盒。
本发明提供的鹅性别鉴定的PCR试剂盒，由所述引物对、双蒸水、PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、DNA聚合酶组成。
本发明的目的之三是一种鹅性别鉴定的方法。
本发明提供一种利用上述引物鉴别鹅性别的方法，其特征在：以CHD-F/CHD-R为引物，以鹅血液基因为模板进行PCR扩增，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。当产物条带产物出现485bp和330bp两个条带时为母鹅，当产物条带产物出现485bp一个条带时为公鹅。
上述方法所述PCR扩增体系具体组成如下：
20μl反应体系：10×PCR Buffer2.0μL，Mg2+2.2μL，dNTPMixture0.8μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，上、下游引物各1.0μL，鹅DNA模板1.0μL，ddH2O11.8μL。
上述方法所述PCR扩增程序具体组成如下：
反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55.9℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸8min；4℃保存。
本发明根据CHD基因在Z、W染色体上不同拷贝内含子差异，设计特异性引物，根据PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳根据带型对鹅性别进行简便、准确的鉴定。本发明只需普通PCR仪及琼脂糖凝胶电泳设备即能完成鹅性别鉴定工作，避免采用传统方法耗时、耗力等缺点。
附图说明
图1为本发明实施例2的已知性别鹅的PCR扩增产物的部分电泳图（一条带为雄性，两条带为雌性）；
图2为本发明实施例2的未知性别鹅的PCR扩增产物的部分电泳图（一条带为雄性，两条带为雌性）。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
利用CHD基因在Z、W染色体上不同拷贝内含子差异，设计一对特异性引物CHD-F和CHD-R；所述引物序列为：
上游引物CHD-F：5’-ggtggcttaatgaggtagca-3’；
下游引物CHD-R：5’-aggatggaaatgagtgca-3’。
本发明的鹅性别鉴定方法通过以下实施例2进行描述：
实施例2
采用酚-氯仿萃取法提取鹅血液基因组：
取10μL鹅血液加500μL细胞裂解液，加入10μL10%SDS和10μL10%蛋白酶K，55℃水浴过夜；加入500μL Tris饱和酚，上下颠倒混匀20min；12000r/min10min，小心吸取上层水相于新Ep管中；加入等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）混合液，上下颠倒混匀20min；12000r/min10min，小心吸取上层水相于新1.5mL指形管中；加入等体积氯仿、异戊醇（24:1）混合液，上下颠倒混匀20min；加入2倍体积无水乙醇，横向震荡3min；12000r/min10min，管底可见白色DNA沉淀；加1mL70%乙醇，洗涤DNA沉淀；8000r/min5min，倒掉乙醇，待乙醇完全蒸发后，加入100μL双蒸水，室温溶解，测定核酸浓度，稀释为100ng/μL,4℃保存备用。
鹅CHD基因PCR扩增：
鹅CHD基因PCR扩增体系和程序具体组成如下：
反应体系为20μL：10×PCR Buffer2.0μL，Mg2+2.2μL，dNTP Mixture0.8μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，上、下游引物各1.0μL，DNA模板1.0μL，ddH2O11.8μL。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55.9℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸8min；4℃保存。
琼脂糖检测PCR扩增产物：
取5μLPCR扩增产物通过1.5%（质量百分含量）琼脂糖凝胶110V电压电泳25min，用凝胶成像系统拍照对PCR扩增产物进行鉴定。根据带型就判断性别：一条带为公鹅；两条带为母鹅。图1为已知性别鹅的PCR扩增产物的部分电泳图，其中一条带为雄性个体，两条带为雌性个体，共检测30只，雌雄个体各半，最终结果显示鉴定准确率为100%；图2为未知性别鹅的PCR扩增产物的部分电泳图，共检测30个个体，根据本发明专利方法鉴定结果与解剖鉴定或专业人员翻肛鉴别结果一致。

Claims (3)

1.一种用于鹅性别鉴定的引物对，其序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
2.一种鹅性别鉴定的PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒包括权利要求1所述的引物对、双蒸水、PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、DNA聚合酶。
3.一种鉴定鹅性别鉴定的方法，其特征在于：用权利要求1所述的引物对，以鹅血液基因为模板进行PCR扩增，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；当扩增产物条带出现485bp和330bp两个条带时为母鹅，当产物条带产物出现485bp一个条带时为公鹅。
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