CN108707654A - 鹧鸪早期性别pcr鉴定试剂盒、应用及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鹧鸪早期性别PCR鉴定试剂盒及应用，以及利用该试剂盒对鹧鸪进行早期性别鉴定的方法。所述试剂盒主要包括PCR扩增引物和PCR反应试剂，所述PCR扩增引物序列如下：上游引物：5'‑GTTACTGATTCGTCTACGAGA‑3'下游引物：5'‑ATTGAAATGATCCAGTGCTTG‑3'。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了通过分子手段对鹧鸪进行早期性别鉴定的途径，与其他方法如翻肛鉴别、腹腔镜检、粪便类固醇检测及核型相比，具有准确性高、操作简便、成本低、对动物伤害小等优点，对推动鹧鸪良种选育和产业化具有十分重要的意义。

Description

鹧鸪早期性别PCR鉴定试剂盒、应用及方法
(一)技术领域
本发明涉及一种鹧鸪早期性别PCR鉴定试剂盒及应用，以及利用该试剂盒对鹧鸪进行早期性别鉴定的方法。
(二)背景技术
鹧鸪(Francolinus pintadeanus)又称石鸡，隶属于鸟纲、鸡形目、雉科、鹧鸪属。目前市场上人工养殖的鹧鸪都是美国鹧鸪，具有生长快，繁殖力强，肉厚骨细，味道鲜美，营养丰富，含脂肪少等特点，且有壮阳补肾、化痰下气等药性作用，被视为珍禽野味。已与鹌鹑、火鸡、鸵鸟一同成为我国特禽养殖生产的重要的组成部分。鹧鸪是一种单态性鸟，其雌雄外貌形态差别甚微，不像家鸡、山鸡等其他禽类从外形上可以区分开。
因此有必要研究一种利用分子手段对鹧鸪进行性别鉴定的方法。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种鹧鸪早期性别PCR鉴定试剂盒及应用，以及利用该试剂盒对鹧鸪进行早期性别鉴定的方法，采用分子手段对鹧鸪进行性别鉴定。
本发明采用的技术方案是：
一种鹧鸪早期性别PCR鉴定试剂盒，主要包括PCR扩增引物和PCR反应试剂，所述PCR扩增引物序列如下：
上游引物：5'-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3'
下游引物：5'-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3'。
本发明试剂盒关键在于引物序列的选定，PCR试剂可采用本领域常规试剂。
本发明利用CHD基因的特异引物对鹧鸪的染色体解螺旋蛋白DNA结合基因基因(chromo-helicase-DNA binding gene,CHD)上的同源序列进行特异性扩增，从而对鹧鸪的性别进行了鉴定，获得了较好的结果。
鸟类的CHD基因位于性染色体Z和W上，其在鹧鸪等鸟类的两条性染色体上内含子的长度不同，导致该基因在两条性染色体上的长度不同，也证明了CHD基因用于雌雄的判定较为准确。因此，根据CHD基因内含子在Z和W染色体上不同，设计出特定的DNA分子扩增引物，扩增该基因的不同长度片段，成为了本发明鹧鸪性别鉴定的理论依据。
本发明还涉及所述试剂盒在鹧鸪早期性别鉴定中的应用。
本发明还涉及利用所述试剂盒对鹧鸪进行早期性别鉴定的方法，所述方法包括：
(1)提取初生鹧鸪羽毛DNA；
(2)以提取获得的DNA为模板，采用PCR扩增引物进行PCR扩增；
所述PCR扩增引物序列如下：
上游引物：5'-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3'；
下游引物：5'-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3'；
(3)PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若仅扩增获得1条566bp的特异性条带，则判断为雄性鹧鸪；若扩增获得566bp和416bp的2条特异性条带，则判断为雌性鹧鸪。
PCR反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10S，53.1℃退火30S，72℃延伸30S，共30个循环；72℃延伸2min；4℃保存。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了通过分子手段对鹧鸪进行早期性别鉴定的途径，与其他方法如翻肛鉴别、腹腔镜检、粪便类固醇检测及核型相比，具有准确性高、操作简便、成本低、对动物伤害小等优点，对推动鹧鸪良种选育和产业化具有十分重要的意义。
(四)附图说明
图1为PCR扩增产物电泳图；
图2为解剖验证图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1材料与方法
1.1样品采集
拔取初生鹧鸪尾部带有毛囊的新生羽毛1～2根；放入2ml离心管，-20℃冷冻保存，用于分子实验鉴别其性别。同时作解剖学辅助鉴定。
1.2羽毛处理
取每羽的1～2根带毛囊的羽毛，用75％乙醇清洗干净，用镊子挤出下根部1～2mm处的羽髓于EP管中，之后按照TIANGEN公司的组织基因组提取试剂盒的步骤提取DNA。
1.3DNA样品浓度测定
分别用超微量紫外分光光度计Nandrop2000和1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度、纯度及完整性。
1.4引物设计与合成
选择利用以下2对引物分别对鹧鸪性别基因CHD进行特异性扩增，引物序列为：
F：5'-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3'，
R：5'-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3'。
1.6PCR扩增
以所提取鹧鸪羽毛DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系25uL：模板5uL，上、下游引物各2uL，PCR-Mix 12.5uL，灭菌去离子水3.5uL。PCR反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10S，53.1℃退火30S，72℃延伸30S，共30个循环；72℃延伸2min；4℃保存。取2.5uL PCR扩增产物用于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
1.7性腺观察的形态学鉴定
对未知性别的10只鹧鸪经羽毛DNAPCR检测后解剖作性腺观察的形态学鉴定，依据雄性个体的性腺睾丸雌性个体性腺卵巢为标准判定标准，然后将PCR性别鉴定结果与性腺解剖后观察结果作符合率比较，判定准确率。
2结果
2.1PCR产物电泳结果
利用该组合引物，从未知性别的鹧鸪的基因组DNA样本中扩增出相应的片段，所有雌性个体表现为两条带，所有雄性个体表现为一条带。结果见图1：1、2、3、4、5号是雄性鹧鸪(ZZ)，扩增出1条566bp左右的特异性条带；5、6、7、8、9、10号是雌性鹧鸪(ZW)，扩增出2条特异性条带，其中1条566bp，另1条416bp，扩增结果与解剖学验证相吻合。解剖结果见图2。
按照上述方法，鉴定了300只鹧鸪，准确率达100％。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 鹧鸪早期性别PCR鉴定试剂盒、应用及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gttactgatt cgtctacgag a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
attgaaatga tccagtgctt g 21

Claims (4)

1.一种鹧鸪早期性别PCR鉴定试剂盒，主要包括PCR扩增引物和PCR反应试剂，其特征在于，所述PCR扩增引物序列如下：
上游引物：5'-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3'
下游引物：5'-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3'。
2.权利要求1所述试剂盒在鹧鸪早期性别鉴定中的应用。
3.利用权利要求1所述试剂盒对鹧鸪进行早期性别鉴定的方法，所述方法包括：
(1)提取初生鹧鸪羽毛DNA；
(2)以提取获得的DNA为模板，采用PCR扩增引物进行PCR扩增；
所述PCR扩增引物序列如下：
上游引物：5'-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3'；
下游引物：5'-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3'；
(3)PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若仅扩增获得1条566bp的特异性条带，则判断为雄性鹧鸪；若扩增获得566bp和416bp的2条特异性条带，则判断为雌性鹧鸪。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于PCR反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10S，53.1℃退火30S，72℃延伸30S，共30个循环；72℃延伸2min；4℃保存。
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