CN107604077B

CN107604077B - 一种快速鉴定蜚蠊目昆虫品种的多重pcr引物及方法

Info

Publication number: CN107604077B
Application number: CN201710991800.8A
Authority: CN
Inventors: 姜顺日; 耿福能; 刘彬; 吴桃清
Original assignee: SICHUAN GOOD DOCTOR PANXI PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SICHUAN GOOD DOCTOR PANXI PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2019-03-08
Anticipated expiration: 2037-10-18
Also published as: CN107604077A

Abstract

本发明涉及一种快速鉴定蜚蠊目昆虫品种的多重PCR引物以及方法。属于应用生物技术领域。快速鉴定蜚蠊目昆虫品种的多重PCR引物，由美洲大蠊引物、黑胸大蠊引物、澳洲大蠊引物、褐斑大蠊引物、德国小蠊引物和地鳖引物组成。鉴定方法包括以下步骤：提取蜚蠊目昆虫基因组总DNA，进行多重PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测蜚蠊目昆虫种类。美洲大蠊、黑胸大蠊、澳洲大蠊、褐斑大蠊、德国小蠊和地鳖的PCR产物条带大小分别为452bp、125bp、160bp、284bp、253bp和380bp。本发明的鉴定引物及多重PCR方法可以灵敏、快速地确定待检测蜚蠊目昆虫样品的种类，较传统检测方法具有操作简单、可重复性强、成本低等优点。

Description

一种快速鉴定蜚蠊目昆虫品种的多重PCR引物及方法

技术领域

本发明涉及蜚蠊目昆虫的鉴别方法，尤其是涉及一种快速鉴定六种蜚蠊目昆虫品种的多重PCR引物及方法。

背景技术

蜚蠊目是昆虫纲有翅亚纲的1目。世界已知5000多种，我国已知250余种，分属蜚蠊科、姬蠊科和地鳖科3科。蜚蠊目中有些种类昆虫是重要的病害传播媒介，是卫生防除的主要对象之一；但是有的蜚蠊种类昆虫可以作为药材，用于提取生物活性物质，治疗人类多种疑难杂症(如：美洲大蠊和地蟞)。美洲大蠊俗称“蟑螂”，是我国重要的传统药材，其入药始载于《神农本草经》，并把它列为中品，谓“味咸、寒，有毒，治：血瘀症坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。《本草纲目》上记载其主治“瘀血，症坚，寒热，下气，利血脉”。《中国药学大辞典》、《中药大辞典》、《中国药用动物志》、《全国中草药汇编》等近、现代药学专著均记载蜚蠊有“活血、散瘀、化积、消疳、解毒、利尿、消肿”等功能。现代药理研究表明美洲大蠊具有多种药理作用，比如抗肿瘤、改善微循环、提高免疫力和促进组织修复等作用。地鳖又名土鳖虫、土元等，为鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌虫干燥体，地鳖虫(地鳖、冀地鳖)类中药使用历史悠久，中国汉代的药物著作《神农本草经》、东汉的《金匮要略》以及明代的《本草纲目》等均有记载，是传统的活血化瘀类动物药。现代药理实验也证明地鳖具有溶解静脉血栓、抑制血小板聚集、抗凝血和抗肿瘤等药效。

传统蜚蠊目昆虫品种的鉴定主要依靠形态学标准：躯体量度、头部形状、前胸背板色斑变异、翅的发育程度以及体色等特征。但是，对于药用蜚蠊如美洲大蠊和地鳖，经过产地粗加工和饮片炮制后，失去了形态学特征，不能乱用传统形态学对其进行鉴定，需要科学准确地鉴别该类药材，以保证药材安全有效的应用。因此，亟需寻求一种基于分子生物学技术的能够快速、准确鉴定六种蜚蠊目昆虫品种以及其混合物的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速鉴定六种蜚蠊目昆虫品种的多重PCR引物及方法。首先，本发明申请人成功地以美洲大蠊、黑胸大蠊、澳洲大蠊、褐斑大蠊、德国小蠊和地鳖六种蜚蠊目昆虫品的COI基因差异部分序列区域为研究对象同时兼顾了PCR产物长度的差异，分别设计了对这六种蜚蠊目昆虫均具有进行特异性扩增的特异性引物，也即共设计了6对(12条)特异性扩增引物；同时，本发明申请人经过大量试验筛选优化得到了对美洲大蠊、黑胸大蠊、澳洲大蠊、褐斑大蠊、德国小蠊和地鳖六种蜚蠊目昆虫品种进行特异性扩增的多重聚合酶链式反应(PCR)条件(包括PCR反应总体系和PCR扩增程序)。当多重PCR的样品数量太多时，随着引物数量的增加，引物之间形成二聚体的概率也增大，给多样品的同时检测带来极大的困难。在此，本发明申请人成功筛选优化得到了本发明多重PCR反应条件中6对(12条)特异性引物最佳浓度配比以及相应的退火温度。再者，本发明申请人通过筛选优化确定的最优的多重聚合酶链式反应(PCR)条件，对这六种蜚蠊目昆虫的单体及不同混合群体基因组DNA样品，都只需要一个PCR反应，简单地判断产物的大小便可以快速、准确鉴定此六种蜚蠊目昆虫，后续的实验证明不管是单体DNA样品还是不同混合群体DNA样品均可得到理想的鉴定效果。

本发明建立的多重PCR方法只需要通过一次反应和一次电泳，即可同时检测出多个目的片段，能够节约昂贵的试剂、PCR反应时间和电泳时间等。与每种蜚蠊目昆虫样品用单一PCR鉴定相比，本发明建立的多重PCR方法更加准确、高效和经济。较传统的检测方法具有操作简单、可重复性强、成本低等优点。

本发明的目的通过如下技术方案实现的：一种快速鉴定蜚蠊目昆虫品种及其混合物的多重PCR引物由美洲大蠊引物、黑胸大蠊引物、澳洲大蠊引物、褐斑大蠊引物、德国小蠊引物和地鳖引物组成；

所述的美洲大蠊引物的DNA序列为：

上游引物P ame-F：5’-TGCTGAGCTCGGGCAACCA-3’；

下游引物P ame-R：5’-CTACTGATCATACGAAAAGGGGA-3’；

所述的黑胸大蠊引物的DNA序列为：

上游引物P ful-F：5’-TCTATTACTAGCAAGCAGTATG-3’；

下游引物P ful-R：5’-AGTGTAGTGAAAAAATTGCTAGGTCGACT-3’；

所述的澳洲大蠊引物的DNA序列为：

上游引物Paus-F：5’-ATTACTATTAGCGAGCAGCATG-3’；

下游引物Paus-R：5’-ATTTACGGCTCCTAGAATTGAAGAG-3’；

所述的褐斑大蠊引物的DNA序列为：

上游引物Pbru-F：5’-TGGTTATACCAATTATAATTGGAGGT-3’；

下游引物Pbru-R：5’-AGGGCACCAGATATAGCATTCCCG-3’；

所述的德国小蠊引物的DNA序列为：

上游引物B ger-F：5’-CCGAGCAGAGCTAAATCAACCTGGT-3’；

下游引物B ger-R：5’-TCCTCTTTCGACAAGGCTACTAGCTAAT-3’；

所述的地鳖引物的DNA序列为：

上游引物E sin-F：5’-CTAATCCGAGCAGAATTAGGCCAG-3’；

下游引物E sin-R：5’-ACTGCACCTAAAATTGATCTA-3’。

上述的多重PCR引物用于鉴定美洲大蠊、黑胸大蠊、澳洲大蠊、褐斑大蠊、德国小蠊和地鳖及其混合物。

一种利用上述的多重PCR引物快速鉴定蜚蠊目昆虫及其混合物品种的方法，方法如下：

1)提取待检测蜚蠊目昆虫样品以及混合样品的基因组DNA，无菌超纯水溶解DNA，调节DNA浓度为50ng/ul，制备样品DNA；

2)利用上述的多重PCR引物对样品DNA进行多重PCR扩增；

3)PCR反应结束后，取PCR产物做琼脂糖凝胶(2％)电泳检测；使用50bp DANMarker作为参照，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测蜚蠊目昆虫的种类：如果出现大小为452bp的条带说明样品为美洲大蠊；如果出现大小为125bp的条带说明样品为黑胸大蠊、如果出现大小为160bp的条带说明样品为澳洲大蠊、如果出现大小为284bp的条带说明样品为褐斑大蠊、如果出现大小为253bp的条带说明样品为德国小蠊；如果出现大小为380bp的条带说明样品为地鳖。

上述步骤2)中多重PCR体系为：2×TSINGKE^TM Master Mix Buffer(擎科生物技术有限公司)30ul；浓度为2umol/L的引物P ame-F和P ame-R各0.4ul；浓度为2umol/L的引物Pful-F和P ful-R各0.75ul；浓度为2umol/L的引物Paus-F和Paus-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物Pbru-F和Pbru-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物B ger-F和B ger-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物E sin-F和E sin-R各0.9ul；DNA模板1ul；最后，在反应体系中加入无菌超纯水补齐到50ul。

上述步骤2)中中所述多重PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃延伸10min。

本发明的有益效果在于：本发明利用来自蜚蠊目昆虫的线粒体基因组COI基因序列设计合成了六对针对不同蜚蠊目昆虫品种的特异性PCR引物，并利用此引物建立一个多重PCR反应，实现了利用分子生物学方法快速鉴定六种蜚蠊目昆虫品种的新方法。本发明主要应用于蜚蠊目昆虫种质资源保护、遗传育种以及相关中药材产品鉴定等领域。本发明具有操作简单、可重复性强、成本低等优点。

附图说明

图1为六种蜚蠊目昆虫单体多重PCR电泳结果示意图：蜚蠊目昆虫种类从左到右依次为：1-美洲大蠊，2-黑胸大蠊，3-澳洲大蠊，4-褐斑大蠊，德国小蠊、6-土鳖虫，“-”阴性对照。

图2为六种蜚蠊目昆虫的不同混合群体多重PCR电泳结果示意图：不同蜚蠊目昆虫混合群体从左到右依次为：1-美洲大蠊和黑胸大蠊；2-美洲大蠊和澳洲大蠊；3-美洲大蠊和褐斑大蠊；4-美洲大蠊和德国小蠊；5-美洲大蠊和土鳖虫；6-美洲大蠊、澳洲大蠊和黑胸大蠊；7-美洲大蠊、褐斑大蠊和德国小蠊；8-美洲大蠊、土鳖虫和德国小蠊；9-美洲大蠊、褐斑大蠊、澳洲大蠊和黑胸大蠊；10-美洲大蠊、土鳖虫、褐斑大蠊和德国小蠊；11-美洲大蠊、土鳖虫、褐斑大蠊和澳洲大蠊；12-美洲大蠊、褐斑大蠊、德国小蠊、澳洲大蠊和黑胸大蠊；13-六种蜚蠊目昆虫混合DNA样品；“-”阴性对照。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明进一步的说明，但并不因此而限制本发明。若未特别指明，实施例均按照常规试验条件，如Smabrook等分子克隆实验手册(J Sambrook,DavidRussell Molecular Cloning A Laboratory Manual Third Edition，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1：六种蜚蠊目昆虫的单体及不同混合群体基因组DNA的提取

1)六种蜚蠊目昆虫的单体基因组DNA提取：六种已知种蜚蠊目昆虫试验样本在基因组制备前，首先使用75％乙醇擦拭样本表面消除外源性污染，待乙醇挥发后，选取腹部肌肉组织进行充分磨碎后作为基因组提取样本。采用DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNAKit(北京天根生化科技有限公司))分别提取六种已知种蜚蠊目昆虫单体基因组DNA，用微量分光光度计检测提取的模板DNA的浓度，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到50ng/ul，-20℃保存DNA。

2)六种蜚蠊目昆虫的不同混合群体基因组DNA提取：取每一已知种的蜚蠊目昆虫腹部肌肉组织大约10mg，根据试验设计进行混合(混合的组合有：美洲大蠊和黑胸大蠊；美洲大蠊和澳洲大蠊；美洲大蠊和褐斑大蠊；美洲大蠊和德国小蠊；美洲大蠊和土鳖虫；美洲大蠊、澳洲大蠊和黑胸大蠊；美洲大蠊、褐斑大蠊和德国小蠊；美洲大蠊、土鳖虫和德国小蠊；美洲大蠊、褐斑大蠊、澳洲大蠊和黑胸大蠊；美洲大蠊、土鳖虫、褐斑大蠊和德国小蠊；美洲大蠊、土鳖虫、褐斑大蠊和澳洲大蠊；美洲大蠊、褐斑大蠊、德国小蠊、澳洲大蠊和黑胸大蠊；六种蜚蠊目昆虫混合。采用DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司))分别提取以上混合群体样品基因组DNA，用微量分光光度计检测提取的模板DNA的浓度，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到50ng/ul，-20℃保存DNA。

实施例2：PCR体系及程序：进行两组PCR的扩增，其中一组以六种单体蜚蠊目昆虫基因组DNA为模板，另一组以13种混合的蜚蠊目昆虫群体基因组DNA为模板。

1)六种单体蜚蠊目昆虫基因组DNA多重PCR体系为：2×TSINGKE^TMMaster MixBuffer(擎科生物技术有限公司)30ul；浓度为2umol/L的引物P ame-F和P ame-R各0.4ul；浓度为2umol/L的引物P ful-F和P ful-R各0.75ul；浓度为2umol/L的引物Paus-F和Paus-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物Pbru-F和Pbru-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物B ger-F和B ger-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物E sin-F和E sin-R各0.9ul；DNA模板1ul；无菌超纯水补齐到50ul。

2)六种蜚蠊目昆虫的不同混合群体基因组DNA多重PCR体系为：2×TSINGKE^TMMaster Mix Buffer(擎科生物技术有限公司)30ul；浓度为2umol/L的引物P ame-F和Pame-R各0.4ul；浓度为2umol/L的引物P ful-F和P ful-R各0.75ul；浓度为2umol/L的引物Paus-F和Paus-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物Pbru-F和Pbru-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物B ger-F和B ger-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物E sin-F和E sin-R各0.9ul；不同混合群体样品DNA模板各1ul；无菌超纯水补齐到50ul。

3)多重PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃延伸10min。

实施例3：PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，使用50bp DAN Marker作为参照，进行PCR产物大小判断待检蜚蠊目昆虫单体以及混合群体中所含蜚蠊目昆虫的种类：美洲大蠊为452bp、黑胸大蠊为125bp、澳洲大蠊为160bp、褐斑大蠊为284bp、德国小蠊为253bp和地鳖为380bp(见图1和图2)。同时，为了进一步证实该鉴定方法的可靠性，分别将各蜚蠊目昆虫相应的PCR目的条带送至擎科生物技术有限公司(成都)进行测序，测序得到的DNA片段的序列与NCBI数据库中已经存在的各相对于的蜚蠊目昆虫物种序列均具有非常高的同源性(97％以上)，故而进一步证实了通过该方法鉴定出的物种的准确性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 四川好医生攀西药业有限责任公司

<120> 一种快速鉴定蜚蠊目昆虫品种的多重PCR引物及方法

<130> 2017

<141> 2017-10-18

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctgagctc gggcaacca 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctactgatca tacgaaaagg gga 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctattacta gcaagcagta tg 22

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtgtagtga aaaaattgct aggtcgact 29

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attactatta gcgagcagca tg 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atttacggct cctagaattg aagag 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggttatacc aattataatt ggaggt 26

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agggcaccag atatagcatt cccg 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgagcagag ctaaatcaac ctggt 25

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcctctttcg acaaggctac tagctaat 28

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctaatccgag cagaattagg ccag 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

actgcaccta aaattgatct a 21

Claims

1.一种基于多重PCR引物快速鉴定蜚蠊目昆虫美洲大蠊、黑胸大蠊、澳洲大蠊、褐斑大蠊、德国小蠊和地鳖的方法，其特征在于方法如下：

1)提取待检测蜚蠊目昆虫样品以及混合群体样品的基因组DNA，无菌超纯水溶解DNA，调节DNA浓度为50ng/ul，制备样品DNA；

2)利用多重PCR引物对样品DNA进行多重PCR扩增，所述的多重PCR引物由美洲大蠊引物、黑胸大蠊引物、澳洲大蠊引物、褐斑大蠊引物、德国小蠊引物和地鳖引物组成；

所述的美洲大蠊引物的DNA序列为：

上游引物P ame-F：5’-TGCTGAGCTCGGGCAACCA-3’；

下游引物P ame-R：5’-CTACTGATCATACGAAAAGGGGA-3’；

所述的黑胸大蠊引物的DNA序列为：

上游引物P ful-F：5’-TCTATTACTAGCAAGCAGTATG-3’；

下游引物P ful-R：5’-AGTGTAGTGAAAAAATTGCTAGGTCGACT-3’；

所述的澳洲大蠊引物的DNA序列为：

上游引物Paus-F：5’-ATTACTATTAGCGAGCAGCATG-3’；

下游引物Paus-R：5’-ATTTACGGCTCCTAGAATTGAAGAG-3’；

所述的褐斑大蠊引物的DNA序列为：

上游引物Pbru-F：5’-TGGTTATACCAATTATAATTGGAGGT-3’；

下游引物Pbru-R：5’-AGGGCACCAGATATAGCATTCCCG-3’；

所述的德国小蠊引物的DNA序列为：

上游引物B ger-F：5’-CCGAGCAGAGCTAAATCAACCTGGT-3’；

下游引物B ger-R：5’-TCCTCTTTCGACAAGGCTACTAGCTAAT-3’；

所述的地鳖引物的DNA序列为：

上游引物E sin-F：5’-CTAATCCGAGCAGAATTAGGCCAG-3’；

下游引物E sin-R：5’-ACTGCACCTAAAATTGATCTA-3’；

3)PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，使用50bp DAN Marker作为参照，进行PCR产物大小判断待检蜚蠊目昆虫的种类：美洲大蠊为452bp、黑胸大蠊为125bp、澳洲大蠊为160bp、褐斑大蠊为284bp、德国小蠊为253bp和地鳖为380bp。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述多重PCR扩增的反应体系为：2×TSINGKETM Master Mix Buffer 30ul；浓度为2umol/L的引物P ame-F和P ame-R各0.4ul；浓度为2umol/L的引物P ful-F和P ful-R各0.75ul；浓度为2umol/L的引物Paus-F和Paus-R 各0.5ul；浓度为2umol/L的引物Pbru-F和Pbru-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物Bger-F和B ger-R各0.5ul；浓度为2umol/L的引物E sin-F和E sin-R各0.9ul；DNA模板1ul；最后，在反应体系中加入无菌超纯水补齐到50ul。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述多重PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃延伸10min。