CN108950023A - 一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明提供了一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用，涉及药材鉴定技术领域。本发明所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。利用本发明的引物对或试剂盒鉴定美洲大蠊操作简单，样品限制性低，检测特异性高，稳定性好，实用性广。针对不同来源的美洲大蠊样品，无论是鲜品或干品、昆虫药材炮制品或粉末状样品、全虫或部分虫体、幼虫或成虫都具有98％以上的准确度和精确度。

Description

一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于药材鉴定领域，具体涉及一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用。
背景技术
美洲大蠊(Periplaneta americana Linn.)是长期应用于民间的动物药药材，常以干燥或鲜成虫入药，主治儿童疳积、扁桃腺炎、身体包块、痈疮肿痛和蜈蚣叮咬等。近年来研究表明，美洲大蠊作为昆虫药物，临床应用记录显示其具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、促进组织修复、抗菌、抗病毒、抗氧化、增强免疫等药理作用，其药物制剂在临床上的应用也越来越广泛，而对美洲大蠊药材的真伪鉴定是入药及进行药理学研究的基础。目前在国际范围内对昆虫的种类鉴定主要是依据成虫的形态学特征，而在我国的药材市场，美洲大蠊药材通常以粉末或炮制品等形式入药。由于传统的性状鉴别缺乏准确的内部解剖特征或者是在贮藏、加工炮制过程中形态被严重破坏，因此基于形态结构细微差别的归类描述稳定性差、可信度低，导致药用美洲大蠊的鉴定存在很大困难。
由于传统的性状鉴别方法无法准确、快速的鉴定药材市场贩售的美洲大蠊药材，导致有部分伪品(例如药效不及美洲大蠊的澳洲大蠊、德国小蠊、甚或其它科属的昆虫)在市场内流通，市场较为混乱。因此，该昆虫药物的药材鉴定及原料药饮片的质量控制等均亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类学方法的缺陷及不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用，实现美洲大蠊作为昆虫原料药材的快速鉴定，可缩短鉴定时间，提高鉴定结果的准确性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种鉴定美洲大蠊用引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了一种鉴定美洲大蠊用试剂盒，包含上述引物对，还包括PCR Buffer。
优选的，所述PCR Buffer包括：0.1U的Taq聚合酶、500μmol/L的dNTP、20mmol/L的Tris-HCl、100mmol/L的KCl和3μmol/L的MgCl2。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在鉴定美洲大蠊中的应用。
优选的，所述鉴定包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA，得模板DNA；2)将引物对、PCRBuffer和步骤1)得到的所述模板DNA混合后进行PCR扩增，得扩增产物；3)将步骤2)得到的所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，当所述扩增产物的大小为433bp，所述样品为美洲大蠊。
优选的，所述样品包括鲜品或干品。
优选的，所述样品包括幼虫或成虫的全虫或部分虫体。
优选的，每50μL所述PCR扩增的反应体系包括：蒸馏水19μL，PCR Buffer 25μL，引物各2μL和模板DNA2μL。
优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性3.5min；94℃35s，49℃35s，72℃45s，33个循环；72℃延伸5分钟。
本发明提供了一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用，可实现美洲大蠊作为昆虫原料药材的快速鉴定，缩短鉴定时间，提高鉴定结果的准确性。在本发明实施例中，鉴定准确度达98％以上。
附图说明
图1为本发明实施例3的琼脂糖凝胶电泳图；
图2是本发明实施例4的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明实施例5的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为本发明实施例6的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴定美洲大蠊用引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.2:TATGTACTAC CATGAGGACAAATATC；和SEQ ID NO.3：ATTACACCTC CTAATTTATTAGGAAT所示。
本发明所述引物对优选根据美洲大蠊的DNA条形码基因设计，所述DNA条形码基因优选为Cyt b基因。本发明所述Cyt b基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示:ATTTTGAGGAGCAACTGTAATTACAAACCTTTTATCAGCAATTCCATACCTTGGAATTGATTTAGTACAATGAGTATGAGGTGGTTTTGCAGTAGATAATGCAACACTTAATCGATTTTTTACATTCCATTTTCTTCTCCCATTTATTGTAATAGCAGCTGTAATAGTCCATTTGCTATTTTTACACCAAACAGGATCAAATAACCCTACAGGATTAAATAGAAATATTGATAAAATCCCATTTCATCCTTATTTCACAATTAAAGATGTTGTAGGATTTCTAATCCTAATTATATTATTAACAATATTATCACTAAAAGAACCATATATTCTAGGAGATCCAGATAATTTTATCCCAGCTAATCCATTAGTTACCCCAGTCCATATTCAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATACGCAATTTTACGATCA。
本发明提供了一种鉴定美洲大蠊用试剂盒，包含上述引物对，还包括PCR Buffer。
本发明所述PCR Buffer优选包括：0.1U的Taq聚合酶、500μmol/L的dNTP、20mmol/L的Tris-HCl、100mmol/L的KCl和3μmol/L的MgCl2。
本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在鉴定美洲大蠊中的应用。
本发明所述鉴定优选包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA，得模板DNA；2)将引物对、PCRBuffer和步骤1)得到的所述模板DNA混合后进行PCR扩增，得扩增产物；3)将步骤2)得到的所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，当所述扩增产物的大小为433bp，所述样品为美洲大蠊。
本发明在鉴定所述美洲大蠊时，提取样品基因组DNA，得模板DNA。本发明对所述样品的种类或来源并没有特殊限定，优选包括鲜品或干品，也可以包括幼虫或成虫的全虫或部分虫体。本发明对所述基因组DNA的提取方法并没有特殊限定，优选包括苯酚-氯仿法。本发明所述模板DNA的浓度优选为20～50ng/μL。
得模板DNA后，本发明将引物对、PCR Buffer和模板DNA混合后进行PCR扩增，得扩增产物。当本发明所述PCR扩增体系为50μL体系时，优选包括蒸馏水19μL，PCR Buffer 25μL，引物各2μL和模板DNA2μL。本发明所述引物的浓度优选为5～15μmol/L，更优选为8～12μmol/L，最优选为10μmol/L。本发明所述PCR扩增的反应程序优选包括：94℃预变性3.5min；94℃35s，49℃35s，72℃45s，33个循环；72℃延伸5分钟。本发明在进行所述PCR扩增时，优选设置阳性对照。本发明所述阳性对照的模板DNA为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因。
得扩增产物后，本发明将所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，当所述扩增产物的大小为433bp，所述样品为美洲大蠊。本发明对所述琼脂糖凝胶电泳的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明在鉴定样品是否是美洲大蠊时，优选的将所述模板DNA的扩增产物与阳性对照的扩增产物在琼脂糖凝胶上的条带进行对比，两者在同一位置或者是扩增产物的大小为433bp，可以判断所述样品为美洲大蠊。
下面结合实施例对本发明提供的鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将美洲大蠊的肌肉组织在75％的酒精中浸泡3小时，然后将其浸没于纯水中浸泡3小时，之后用纯水将其冲洗干净。之后用已灭菌的手术剪把样品剪成小块，迅速剪碎置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末，分别装入离心管中，一般每个离心管中加入50mg样品。
在各离心管中加入SDS-蛋白酶K，置于56℃水浴消化1～3小时，直至混合液消化得很清亮为止。
在混合液中加入等体积的平衡酚，上下缓慢颠倒十次，切勿剧烈振荡，在台式高速离心机上6000r/min离心10分钟，取上清液。重复上述步骤直至水相与酚相的界面处看不到白色的蛋白质层为止，取上清液。
在上清液中加入等体积的氯仿∶异戊醇(24:1)，上下缓慢颠倒十次，在台式高速离心机上8000r/min离心10分钟，取上清液。
在上清液中加入2×体积的冷无水乙醇(预先置-20℃冰箱内)沉淀DNA，冰箱内放置10分钟，12000r/min离心10分钟，弃上清液。
在留有沉淀的离心管中加入1毫升70％的冷乙醇洗涤DNA，在台式高速离心机上10000r/min离心5分钟，倾去上清液。
按10毫克样品对应10微升TE缓冲液溶解DNA，做模板DNA。
实施例2
取灭菌蒸馏水19μL、PCR Buffer 25μL、各2μL引物和2μL模板DNA混匀后进行PCR反应，设置94℃预变性3.5min；94℃35s，49℃35s，72℃45s，33个循环；72℃延伸5分钟。
取5μL的PCR扩增产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(90V电压，电泳40分钟)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，对条带位置在250-500bp的PCR扩增产物委托华大基因进行测序。测序结果如下所示：
ATTTTGAGGAGCAACTGTAATTACAAACCTTTTATCAGCAATTCCATACCTTGGAATTGATTTAGTACAATGAGTATGAGGTGGTTTTGCAGTAGATAATGCAACACTTAATCGATTTTTTACATTCCATTTTCTTCTCCCATTTATTGTAATAGCAGCTGTAATAGTCCATTTGCTATTTTTACACCAAACAGGATCAAATAACCCTACAGGATTAAATAGAAATATTGATAAAATCCCATTTCATCCTTATTTCACAATTAAAGATGTTGTAGGATTTCTAATCCTAATTATATTATTAACAATATTATCACTAAAAGAACCATATATTCTAGGAGATCCAGATAATTTTATCCCAGCTAATCCATTAGTTACCCCAGTCCATATTCAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATACGCAATTTTACGATCA；
将测序得到的序列在NCBI中进行BLAST检验，确定得到的是Cyt b基因片段。
实施例3
取位于云南省大理白族自治州的特种药用昆虫开发国家地方联合工程研究中心下属之药用昆虫标准化养殖作邑基地批量饲养的美洲大蠊为待测样品，包括：刚脱出卵鞘的1日龄幼虫、幼虫、成虫，以及经烘箱快速烘干的成虫炮制品，并以药材市场购得并鉴定为美洲大蠊的成虫为阳性对照样品。取阳性对照样品的部分肌肉组织与待测样品分别编号并保存于无水乙醇中。
DNA提取方法通实施例1。
PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳方法同实施例2，并且设置阴性对照(反应体系中不含模板，水代替为模板)。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示，其中M1为脱出卵鞘的1日龄幼虫的扩增条带，M2为幼虫的扩增条带、M3为成虫的扩增条带，M6为成虫的烘干炮制品的扩增条带，M7为阳性对照，MA为DNAMarker。
将得到的PCR扩增产物进行测序，测序结果显示：幼虫(含刚脱鞘的1日龄幼虫)、成虫炮制品的序列与如SEQ ID NO.1所示的Cyt b基因序列的同源性为98％，成虫和阳性对照样品与如SEQ ID NO.1所示的Cytb基因序列的同源性为99％。
实施例4
分别取与美洲大蠊同属的澳洲大蠊Periplaneta australasiae Fabr.(采自云南省玉溪市元江县)、同目不同科的蜚蠊目姬蠊科Blattellidae昆虫德国小蠊Blattllagermanica Linn.(采自云南省大理白族自治州大理市)和美洲大蠊(采自云南省红河州野生种群)为待测样品。取待测样品的部分肌肉组织分别编号并保存于-20℃冰柜中。
DNA提取方法通实施例1。
PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳方法同实施例2，并且设置阴性对照(反应体系中不含模板DNA，水代替为模板)和阳性对照(成虫的Cytb基因序列SEQ ID NO.1为模板DNA)。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图2所示，其中W2为美洲大蠊的扩增条带，W3和W4为德国小蠊的扩增条带，W6和W7为澳洲大蠊的扩增条带。
对PCR扩增产物进行测序，测序结果与实施例1提供的SEQ ID NO.1所示的DNA条形码标准基因对比：澳洲大蠊的序列与SEQ ID NO.1的同源性为89％，德国小蠊与SEQ IDNO.1的同源性为86％，来自云南省红河州野生种群的美洲大蠊的序列与SEQ ID NO.1的同源性为98％。
实施例5
分别取采自云南省文山州野生的美洲大蠊(鲜品)、浙江中药材市场购得的美洲大蠊(干品)、安徽亳州中药材市场购得的美洲大蠊(干品)、河北安国中药材市场购得的美洲大蠊(炮制品)为待测样品，取特种药用昆虫开发国家地方联合工程研究中心(云南省)下属的药用昆虫标准化养殖作邑基地饲养的美洲大蠊成虫(鲜品)为阳性对照。将待测样品分别编号并保存于-20℃冰柜中。
DNA提取方法通实施例1。
PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳方法同实施例2。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图3所示，其中Y1为阳性对照的扩增条带，Y4为云南省文山州野生的美洲大蠊鲜品扩增条带，Y6为浙江中药材市场的美洲大蠊干品扩增条带，Y7为安徽亳州中药材市的美洲大蠊干品扩增条带，Y8为河北安国中药材市场的美洲大蠊炮制品扩增条带。
对PCR扩增产物进行测序，测序结果与核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA条形码标准基因对比，待测样品Y4(云南株)、Y6(浙江株)、Y7(安徽株)、Y8(河北株)的序列与SEQID NO.1的同源性都为98％，而阳性对照的序列与SEQ ID NO.1的同源性为99％。
实施例6
分别取粉末状美洲大蠊(取样自四川好医生攀西药业股份有限公司生产的美洲大蠊精粉)、美洲大蠊部分虫体(取样自特种药用昆虫开发国家地方联合工程研究中心下属药用昆虫标准化养殖作邑基地饲养的美洲大蠊成虫筛选药材成品后拟丢弃的残缺虫体)、美洲大蠊幼虫和成虫(取样自云南省大理州巍山县美洲大蠊专业养殖户饲养间)为待测样品，取药材市场购买的美洲大蠊成虫(干品)为阳性对照。将待测样品和阳性对照分别编号并保存于-20℃冰柜中。
DNA提取方法通实施例1。
PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳方法同实施例2。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图4所示，其中B3为阳性对照的扩增条带，B6为粉末状美洲大蠊的扩增条带，B7为美洲大蠊残缺虫体的扩增条带，B11为美洲大蠊幼虫的扩增条带，B12为美洲大蠊成虫的扩增条带。
对PCR扩增产物进行测序，测序结果与核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA条形码标准基因对比，待测样品B6(粉末状样品)、B11(幼虫)和阳性对照(B3)的序列与SEQ IDNO.1的同源性皆为98％，待测样品B7(残缺虫体)和B12(成虫)的序列与SEQ ID NO.1的同源性为99％。
将采集到的剩余的幼虫置于合适的环境中饲养，约45天后，对长成成虫的虫体进行形态学鉴定确认是美洲大蠊。
综上所示，本发明提供了一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用，鉴定美洲大蠊操作简单，样品限制性低，检测特异性高，稳定性好，实用性广。针对不同来源的美洲大蠊样品，无论是鲜品或干品、昆虫药材炮制品或粉末状样品、全虫或部分虫体、幼虫或成虫都具有98％以上的准确度和精确度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 大理大学
<120> 一种鉴定美洲大蠊用引物对、试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 433
<212> DNA
<213> Periplaneta americana
<400> 1
attttgagga gcaactgtaa ttacaaacct tttatcagca attccatacc ttggaattga 60
tttagtacaa tgagtatgag gtggttttgc agtagataat gcaacactta atcgattttt 120
tacattccat tttcttctcc catttattgt aatagcagct gtaatagtcc atttgctatt 180
tttacaccaa acaggatcaa ataaccctac aggattaaat agaaatattg ataaaatccc 240
atttcatcct tatttcacaa ttaaagatgt tgtaggattt ctaatcctaa ttatattatt 300
aacaatatta tcactaaaag aaccatatat tctaggagat ccagataatt ttatcccagc 360
taatccatta gttaccccag tccatattca acctgaatga tatttcctat ttgcatacgc 420
aattttacga tca 433
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatgtactac catgaggaca aatatc 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attacacctc ctaatttatt aggaat 26

Claims (9)

1.一种鉴定美洲大蠊用引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
2.一种鉴定美洲大蠊用试剂盒，包含权利要求1所述引物对，还包括PCR Buffer。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述PCR Buffer包括：0.1U的Taq聚合酶、500μmol/L的dNTP、20mmol/L的Tris-HCl、100mmol/L的KCl和3μmol/L的MgCl2。
4.权利要求1所述引物对或权利要求2～3任一项所述试剂盒在鉴定美洲大蠊中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鉴定包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA，得模板DNA；2)将引物对、PCR Buffer和步骤1)得到的所述模板DNA混合后进行PCR扩增，得扩增产物；3)将步骤2)得到的所述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，当所述扩增产物的大小为433bp，所述样品为美洲大蠊。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样品包括鲜品或干品。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述样品包括幼虫或成虫的全虫或部分虫体。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，每50μL所述PCR扩增的反应体系包括：蒸馏水19μL，PCR Buffer 25μL，引物各2μL和模板DNA 2μL。
9.根据权利要求5或8所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性3.5min；94℃35s，49℃35s，72℃45s，33个循环；72℃延伸5分钟。
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