CN109136389A - 一种鉴别美洲大蠊的dna条形码标准检测片段coⅱ、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及物种鉴定领域，提供一种用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，该试剂盒包括阳性对照、正反向引物、PCR反应混合液以及蒸馏水，阳性对照采用如SEQ ID NO.1的DNA条形码标准检测片段COⅡ，正反向引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。在本发明中，来源于美洲大蠊的COⅡ基因片段(SEQ ID NO.1)在美洲大蠊物种的同源性在98～100％，而与非美洲大蠊的基因同源性显著降低，进而通过引物设计和PCR扩增可准确区分美洲大蠊与其他类似品种。本发明提供的试剂盒可用于鉴别粉末状或炮制品的美洲大蠊，检测范围更广，检测准确度更高，鉴别所需时间短。

Description

一种鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段COⅡ、试剂盒及 其使用方法

技术领域

本发明涉及物种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别美洲大蠊的试剂盒及其使用方法。

背景技术

美洲大蠊(Periplaneta americana Linn.)是长期应用于民间的动物药药材，常以干燥或鲜成虫入药，主治儿童疳积、扁桃腺炎、身体包块、痈疮肿痛和蜈蚣叮咬等。近年来，研究表明美洲大蠊作为昆虫药物的临床应用记录显示，其具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、促进组织修复、抗菌、抗病毒、抗氧化、增强免疫等药理作用，美洲大蠊药物制剂在临床上的应用也越来越广泛，而对美洲大蠊药材的真伪鉴定是入药及进行药理学研究的基础。

目前在国际范围内对昆虫的种类鉴定主要是依据成虫的形态学特征，而在中国的药材市场上，美洲大蠊药材通常以粉末或炮制品等形式入药。由于传统的性状鉴别缺乏准确的内部解剖特征或者是在贮藏、加工炮制过程中形态被严重破坏，因此基于形态结构细微差别的归类描述稳定性差、可信度低，导致药用美洲大蠊的鉴定存在很大困难。同时，由于传统的性状鉴别无法准确、快速的鉴定药材市场贩售的美洲大蠊药材，导致有部分伪品(例如药效不及美洲大蠊的澳洲大蠊、德国小蠊、甚或其它科属的昆虫)在市场内流通，市场较为混乱。

常规的分类学鉴别方法需要将美洲大蠊幼虫需要培养为成虫才能鉴定，耗时较长；对与残缺不全的昆虫药材炮制品、虫体粉末则基本上不能检测；以传统分类学方法鉴定美洲大蠊要求掌握昆虫，尤其是蜚蠊属昆虫形态分类学的专业技术人员才能对美洲大蠊成虫进行药材鉴定。因此，该昆虫药物的药材鉴定及原料药饮片的质量控制等均亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类学方法的缺陷及不足。

DNA条形码技术(DNA Barcoding)是对一个标准化、较短的基因片段的序列变异进行分析的一种分子技术，具有原理简单、操作便捷、可重复性强、准确率高、利于标准化等优点，是物种鉴定、发现隐存种和研究生物遗传多样性、生物系统进化、分类学和生物保护等的有力工具。随着分子生物技术和计算机技术的发展，DNA条形码这一新兴的技术己经得到了相关领域的越来越多科学家的广泛关注。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的分子生物鉴定手段，可对传统形态鉴定方法作强有力的补充。但是，目前并没有一种准确性高的有效DNA条形码鉴别方法出现。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段COⅡ，该片段来源于美洲大蠊CO Ⅱ基因，以该片段为目的基因可以有效区分美洲大蠊与其他类似品种。

本发明为此还提供了能够扩增上述DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ的引物对，使DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ能够被有效扩增。

本发明还提供了一种以所述DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ为目的基因的鉴别试剂盒，采用该试剂盒对美洲大蠊鉴别的准确性高。

本发明还提供了一种上述试剂盒的使用方法，利用该试剂盒对美洲大蠊鉴别所需时间短，有利于对昆虫原料的快速鉴定。

为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ，所述标准检测片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种用于鉴别美洲大蠊的引物对，所述引物对用于扩增上述技术方案所述DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ，所述引物对中，正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物对、PCR反应混合液；

所述PCR反应混合液包括：0.1U Taq聚合酶、500μmol/L dNTP、20mmol/L 且pH＝8.3的Tris-HCl、100mmol/L氯化钾以及3μmol/L的氯化镁。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为前述技术方案所述DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ或美洲大蠊成虫或美洲大蠊成虫。

优选的，所述引物对中正反向引物的浓度均为10μmol/L。

本发明还提供一种利用上述技术方案所述试剂盒鉴别美洲大蠊的方法，包括以下步骤：

提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA、阳性对照DNA作为模板DNA，分别与引物对、PCR反应混合液和蒸馏水混合得到样品扩增体系和阳性扩增体系，分别进行PCR扩增；

将得到的样品PCR扩增产物和阳性PCR扩增产物分别以琼脂糖凝胶电泳分离，当待测样品的PCR扩增产物的电泳条带位于250～500bp条带位置并且与阳性对照的PCR扩增产物的电泳条带位置相同，则判断待测样品属于美洲大蠊。

优选的，所述待测样品包括待鉴定的昆虫鲜品或干品。

优选的，所述PCR扩增的反应体系共50μL：模板DNA2μL、正反向引物各2μL、PCR反应混合液25μL以及蒸馏水19μL。

优选的，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3.5min，依次进行 94℃35s、49℃35s、72℃45s的循环33个，72℃延伸5min。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：

本发明提供了一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ，该核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的美洲大蠊的CO Ⅱ(线粒体细胞色素氧化酶C亚基Ⅱ)基因片段(即SEQ ID NO.1)，该片段与美洲大蠊物种的同源性在98～100％，而与其他非美洲大蠊的CO Ⅱ基因同源性显著降低(不超过95％)。本发明选择具有高度保守的线粒体DNACO Ⅱ基因作为DNA条形码标准检测片段，本发明发现的SEQ ID NO.2所示核苷酸序列在美洲大蠊所属蜚蠊科的种间和种内间存在较大差异，能够有效区分美洲大蠊与其近似种的昆虫。针对本发明提供的DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ进行引物设计和PCR扩增可准确区分美洲大蠊与其他类似品种。

本发明提供的引物对用于扩增上述DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ，利用该引物对可以特异性扩增所述DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ，特异性强，灵敏度高。

本发明还提供了一种用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，该试剂盒包括上述技术方案所述引物对和PCR反应混合液。本发明提供的试剂盒可用于鉴别粉末状或炮制品的美洲大蠊，不必拘泥于待测样本的形态，相对于传统美洲大蠊方法的检测范围更广，检测准确度更高。

本发明还提供了一种利用上述试剂盒对美洲大蠊进行鉴别的方法，提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA、阳性对照DNA作为模板DNA，分别与引物对、PCR反应混合液以及蒸馏水混合进行PCR扩增；将得到的样品PCR扩增产物和阳性PCR扩增产物分别以琼脂糖凝胶电泳分离，当待测样品的PCR扩增产物的电泳条带位于250～500bp条带位置并且与阳性对照的PCR扩增产物的电泳条带位置相同，则判断待测样品属于美洲大蠊。采用本发明提供的方法进行美洲大蠊鉴别仅需100-150min即可完成(待测样品预处理时间另计)，鉴别时间短、速度快，检测结果准确。

附图说明

图1为实施例3中美洲大蠊实验室种群CO Ⅱ基因基因的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为实施例4中不同种属的昆虫样本的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为实施例5中不同地理来源的美洲大蠊样本的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为实施例6中不同形态的美洲大蠊样本的琼脂糖凝胶电泳图；

具体实施方式

本发明提供了一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ，所述标准检测片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明中，所述用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ的核苷酸序列来源于美洲大蠊的CO Ⅱ基因，共279bp，其核苷酸序列如下 (SEQ ID NO.1)：

agatatgaatattcagatttcgcaaaggtagaatttgattgatatataattcctcaagat 60

gaaatagatcatagtatattccgactactagatgttgataatcga120gcagttttacccata 120

aatacatttattcgaattatcgtaacagcagcagacgttttacactcatgaacaatcccg 180

agcctcggcgtaaaagctgatgcaactccaggtcgcctaaaccaagttagatttttaatt 240

aatcgacctggagttctatatggtcaatgttcagaaatt 279；

CO Ⅱ基因属于核基因，目前用于鉴别美洲大蠊的CO Ⅱ基因基因片段尚未有人报道，本发明利用美洲大蠊的CO Ⅱ基因基因片段作为DNA条形码标准序列可有效区分美洲大蠊与其他昆虫，从而提高鉴别美洲大蠊的精确度。

本发明所述美洲大蠊属于昆虫纲(Insecta)，有翅亚纲(Pterygota)，蜚蠊目(Blattodea)，蜚蠊科(Blattidae)，大蠊属(Periplaneta)昆虫美洲大蠊(Periplanetaamericana Linn)。

本发明所述待鉴别的美洲大蠊可以是昆虫的鲜品或干品，也可以是昆虫的成虫或幼虫，也可以是昆虫的全部或部分虫体，同样也可以是昆虫的炮制品。本发明所述DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ可用于检测上述待鉴别的美洲大蠊，对于传统分类学方法无法鉴别的部分虫体、干粉或炮制品也可以进行有效鉴别，扩大了待鉴别的昆虫样品的范围。

本发明提供了一种用于鉴别美洲大蠊的引物对，所述引物对用于扩增上述技术方案所述DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ，所述引物对中，正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明中，所述用于鉴别美洲大蠊的引物对包括正反向引物，正反向引物的核苷酸序列如下：

正向引物：5'-attggacatcaatgatattga-3'；

反向引物：5'-ccaccaatttctgaacattgacca-3'

本发明提供的引物对是根据上述技术方案所述的DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ核苷酸序列进行设计的，采用本发明设计的引物对能够特异性的仅扩增所述DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ，特异性强，防止扩增过程中错误的扩增到其他序列，辅助提高鉴别结果的准确性。

本发明还提供了一种用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，包括上述技术方案所述引物对和PCR反应混合液。

本发明所述PCR反应混合液包括：0.1U Taq聚合酶、500μmol/L dNTP、 20mmol/L且pH 8.3的Tris-HCl、100mmol/L氯化钾以及3μmol/L的氯化镁。

在本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为前述技术方案所述SEQID NO.1所示的DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ或美洲大蠊成虫。当阳性对照为美洲大蠊成虫时，采用与待测样品相同的DNA提取方法得到阳性对照DNA，参与后续的PCR扩增。

在本发明中，所述阳性对照采用DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ，目的是为了作为鉴定时的对比标准，并排除试剂、环境等因素造成无法检出的问题。若阳性对照的PCR扩增产物中无目的条带，或者目的条带不在279bp，则鉴定结果不可靠。

在本发明中，所述引物对中的正反向引物浓度优选为10μmol/L。

本发明还提供了一种利用上述技术方案所述试剂盒鉴别美洲大蠊的方法，包括以下步骤：

提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA、阳性对照DNA作为模板 DNA，分别与引物对、PCR反应混合液以及蒸馏水混合进行PCR扩增；

将得到的样品PCR扩增产物和阳性PCR扩增产物分别以琼脂糖凝胶电泳分离，当待测样品的PCR扩增产物的电泳条带位于250～500bp条带位置并且与阳性对照的PCR扩增产物的电泳条带位置相同，则判断待测样品属于美洲大蠊。

本发明对待测样品的DNA进行提取，对于提取DNA的方法无特殊限定，采用本领域已知的DNA提取方法即可，比如利用DNA提取试剂盒提取或苯酚-氯仿提取法等。

在本发明中，所述待测样品包括待鉴定的昆虫鲜品或干品；所述待测样品包括待鉴定的昆虫成虫或幼虫；所述待测样品包括待鉴定的昆虫全虫或部分虫体；所述待测样品包括待鉴定的昆虫干粉或昆虫炮制品。采用本发明所述方法可适宜各种不同形式的样品鉴别，相比于传统形态分类鉴别的范围更广。

提取得到待测样品的DNA和阳性对照的DNA后，本发明以待测样品的DNA和阳性对照的DNA作为模板DNA，分别与所述引物对、PCR反应混合液以及蒸馏水混合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系共50μL：模板DNA 2μL、正反向引物各2μL、PCR反应混合液25μL以及蒸馏水19μL。

在本发明中，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3.5min，依次进行94℃35s、49℃35s、72℃45s的循环33个，72℃延伸5min。

得到PCR扩增产物后，本发明以琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分离，经溴化乙锭染色后在观察电泳条带，根据扩增产物的分子量大小判断是否为美洲大蠊。本发明所述琼脂糖凝胶电泳优选为1.2％(m/v)的琼脂糖凝胶进行电泳。

当待测样品的PCR扩增产物的电泳条带位于250～500bp Marker之间，并且该电泳条带与阳性对照的PCR扩增产物的电泳条带位置相同，则判断待测样品属于美洲大蠊；不满足上述任一条件或均不满足的，则判断待测样品不属于美洲大蠊。

采用本发明提供的美洲大蠊鉴别方法仅需要100～150min即可完成，鉴别时间短。由于本发明采用的DNA条形码标准检测片段CO Ⅱ对美洲大蠊种同源性高达98～100％，对其他非美洲大蠊的昆虫同源性低于95％，存在显著差异；结合本发明涉及的特异性引物对，使得鉴别结果准确性高。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

获取用于美洲大蠊的DNA条形码标准基因

1、待测样品的采集与保存

取特种药用昆虫开发国家地方联合工程研究中心(云南省)下属的药用昆虫标准化养殖作邑基地饲养的美洲大蠊成虫，经大理大学杨自忠教授按形态学方法鉴定为美洲大蠊(Periplaneta americana Linn.)。在鉴定无误后，提取新鲜标本的部分肌肉组织保存于-20℃冰柜中。

2、实验仪器与试剂配制

2.1实验仪器与试剂

HWS12型恒温电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司，序列号 131022035)；

SIGMA 1-14ED离心机(德国西格玛公司，序列号133828)；

DYCP-31DN型电泳仪(北京市六一仪器厂，批号20130816)；

DYY-7C型电泳仪电源(北京市六一仪器厂，序列号107C/20-04)；

微波炉(乐金电子(天津)电器有限公司，序列号108TA102133)；

10μL加样枪(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，序列号HU03523)；

20μL加样枪(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，序列号9071135)；

1000μL加样枪(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，序列号DS69142)；

5mL加样枪(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，序列号YE4A180788)；

XW-80A型涡旋机(海门麒麟医用仪器厂，批号201402)；

MyCycler Thermal Cycler型PCR仪(伯乐(BIO-RAD)生命医学产品有限公司，序列号580BR 12204)；

Tris(Beijing Solarbio Science&Technology Co.Ltd，分析纯)；

SDS(Beijing Solarbio Science&Technology Co.Ltd，分析纯)；

NaCl(天津市风船化学试剂科技有限公司，批号20130307)；

EDTA(天津市风船化学试剂科技有限公司，批号0100927)；

平衡酚(天津灏洋生物制品科技有限责任公司，批号20130913)；

氯仿(云南汕滇药业有限公司，批号20100604)；

异戊醇(西陇化工股份有限公司，批号1207312)；

无水乙醇(天津市瑞金特化学品有限公司，批号20130121)；

冰乙酸(天津瑞金特化学品有限公司，批号20110704)；

RNaseA(天根生化科技(北京)有限公司，批号M1806)；

6×DNA loading Buffer(天根生化科技(北京)有限公司，批号M1315)；

蛋白酶K(天根生化科技(北京)有限公司，批号M2011)；

2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技(北京)有限公司，批号M1805)；

D2000 DNA Ladder(北京索莱宝科技有限公司)；

琼脂糖(Agarose LE；天根生化科技(北京)有限公司，批号K0108)。

2.2试剂的配制

2.2.1匀浆缓冲液

由8份A液，1份B液及1份C液组成。

A液：Tris 0.05mol/L；NaCl 0.1mol/L；EDTA 0.1mol/L；pH＝7.0～8.0；

B液：质量体积分数5％的SDS水溶液；

C液：2mg/mL的蛋白酶K。

2.2.2电泳缓冲液50×TAE的配制

由242克Tris、57.1mL冰醋酸和100mL的0.5mol/L EDTA(pH＝8.0) 混合溶解而成。

3、DNA提取及模板制备

首先对待测样品进行预处理：将样品在75％的酒精中浸泡3小时，然后将其浸没于纯水中浸泡3小时，之后用纯水将其冲洗干净。预处理后用已灭菌的手术剪把样品剪成小块，取50毫克的样品采用SDS-蛋白酶K消化，酚 -氯仿抽提和乙醇沉淀法提取总DNA，于-20℃保存备用。

3.1研磨

取样品适量迅速剪碎置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末，称重，分别装入离心管中，一般每个离心管中加入20-200毫克样品。

3.2消化

在各离心管中加入480微升A液、60微升B液、60微升C液，涡旋混匀后，置于56℃水浴1-3小时，直至混合液消化得很清亮为止。

3.3酚抽提

在混合液中加入等体积的平衡酚，上下缓慢颠倒十次，切勿剧烈振荡，在台式高速离心机上6000r/min离心10分钟，取上清液。重复上述步骤直至水相与酚相的界面处看不到白色的蛋白质层为止，取上清液。

3.4氯仿:异戊醇(24:1)抽提

在上清液中加入等体积的氯仿∶异戊醇(24:1)，上下缓慢颠倒十次，在台式高速离心机上8000r/min离心10分钟，取上清液。

3.5沉淀DNA

在上清液中加入2×体积的冷无水乙醇(预先置-20℃冰箱内)沉淀DNA，冰箱内放置10分钟，12000r/min离心10分钟，弃上清液。

3.6洗涤DNA

在留有沉淀的离心管中加入1毫升70％的冷乙醇洗涤DNA，在台式高速离心机上10000r/min离心5分钟，倾去上清液。

3.7加入超纯水或TE缓冲液溶解

按10毫克样品对应10微升TE缓冲液溶解DNA。

3.8配制0.7％琼脂糖凝胶

称取0.14克琼脂糖于三角瓶中，加入1×TAE液，微波炉中加热溶解，稍冷却后加20微升的溴化乙锭溶液(1毫克/毫升)，倒入模具内制琼脂糖凝胶，冷却50～60分钟即可。将成型的琼脂糖凝胶置于电泳槽内，注入电泳缓冲液稍稍高于凝胶。

3.9取5微升各离心管中的DNA溶液于保鲜膜上，然后取5微升载样缓冲液与其混合，加样。取DNA标记(D2000 DNA Ladder Marker)7微升加样。

4、引物合成

正向引物C2-J-3400：5'-ATTGGACATCAATGATATTGA-3'和；

反向引物C2-N-3661：5'-CCACCAATTTCTGAACATTGACCA-3'；

委托上海生工合成并测序验证。

5、PCR扩增

5.1PCR反应体系

取灭菌蒸馏水19微升(μL)、PCR反应混合液25μL、2μL正向引物、 2μL反向引物、2μLDNA模板。其中PCR反应混合液包括了0.1U Taq聚合酶，500微摩尔/升(μmol/L)的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，20毫摩尔/ 升(mmol/L)的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH＝8.3)，100mmol/L 氯化钾(KCl)，3mmol/L氯化镁(MgCl2)；正向引物和反向引物的浓度皆为10微摩尔/升(μmol/L)。

5.2扩增程序

首先在94℃预变性3.5分钟；然后94℃35秒、49℃35秒、72℃45秒扩增33个循环；最后72℃延伸5分钟，置4℃保存。

6、PCR扩增产物检测及基因序列测定

取5μL的PCR扩增产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(90V电压，电泳 40分钟)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，对条带位置在250-500bp的 PCR扩增产物委托华大基因进行测序。将测序得到的序列在NCBI中进行 BLAST检验，确定得到的是CO Ⅱ基因片段，去掉两端引物序列的SEQ ID NO.1如下所示：

AGATATGAATATTCAGATTTCGCAAAGGTAGAATTTGATTGATATAT AATTCCTCAAGATGAAATAGATCATAGTATATTCCGACTACTAGATGTTG ATAATCGA120GCAGTTTTACCCATAAATACATTTATTCGAATTATCGTAA CAGCAGCAGACGTTTTACACTCATGAACAATCCCGAGCCTCGGCGTAA AAGCTGATGCAACTCCAGGTCGCCTAAACCAAGTTAGATTTTTAATTAA TCGACCTGGAGTTCTATATGGTCAATGTTCAGAAATT；

CO Ⅱ基因片段SEQ ID NO.1的序列长度为279bp。

实施例2用于鉴别美洲大蠊的试剂盒

阳性对照：美洲大蠊成虫；

引物对：实施例1中合成的正向引物和反向引物，其中正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L；

PCR反应混合液：0.1U Taq聚合酶、500μmol/L dNTP、20mmol/L且 pH＝8.3的Tris-HCl、100mmol/L氯化钾以及3μmol/L的氯化镁混合而成；

蒸馏水38份。

实施例3

对美洲大蠊不同形态及炮制品的样品进行鉴定

1、待测样品的采集与保存：取位于云南省大理白族自治州的特种药用昆虫开发国家地方联合工程研究中心下属之药用昆虫标准化养殖作邑基地批量饲养的美洲大蠊为待测样品，包括：

刚脱出卵鞘的1日龄幼虫、幼虫、成虫，以及经烘箱快速烘干的成虫炮制品，并以药材市场购得并经大理大学杨自忠教授鉴定为美洲大蠊的成虫为阳性对照样品。

美洲大蠊批量饲养前已经权威专家复核。取阳性对照样品的部分肌肉组织与待测样品分别编号并保存于无水乙醇中。

2、实验仪器与试剂配制：同实施例1。

3、DNA提取及模板制备：首先对阳性对照样品及待测样品进行预处理。以与实施例1相同的方法对样品进行预处理及DNA提取和模板制备。

4、引物合成：同实施例1。

5、PCR扩增：同实施例1，并设置阴性对照(反应体系中不含模板DNA，以水替代模板DNA用量)。

6、PCR扩增产物检测：各取5μL的PCR扩增产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(90V电压，电泳40分钟)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图1。

如图1所示，其中，泳道M1为脱出卵鞘的1日龄幼虫的扩增产物，M2 为幼虫的扩增产物、M3为成虫的扩增产物，M6为成虫的烘干炮制品的扩增产物，M7为阳性对照的扩增产物，MA为DNA标准分子量标。

由图1可以看出，M1、M2、M3、M6和M7均位于250～500bp Marker 之间，并且M1、M2、M3、M6与M7阳性对照的扩增产物电泳条带位置相同，判断M1、M2、M3、M6属于美洲大蠊。可见，本发明所述试剂盒用于美洲大蠊的检测准确度为100％。

7、基因序列测定：委托华大基因对PCR扩增产物进行测序，测序结果显示：刚脱鞘的1日龄幼虫(样品编号：M1)、成虫炮制品(样品编号： M6)的序列与如SEQ ID NO.1所示的CO Ⅱ基因序列的同源性为98％，幼虫(样品编号：M2)、成虫(样品编号：M3)和阳性对照样品(样品编号： M7)与如SEQ ID NO.1所示的CO Ⅱ基因序列的同源性为99％。

综上，可以看出，本发明提供的试剂盒对于不同形态的美洲大蠊样本均可有效鉴别，准确率100％。

实施例4

美洲大蠊的DNA条形码分子鉴定方法之特异性检测

1、待测样品的采集与保存

分别取美洲大蠊(采自云南省红河州野生种群)、同目不同科的蜚蠊目姬蠊科Blattellidae昆虫德国小蠊Blattlla germanica Linn.(采自云南省大理白族自治州大理市)和不同目不同科的鞘翅目鳃金龟科Melolonthidae昆虫小黄鳃金龟Melubohusjuveseensbrenske(采自云南省大理白族自治州大理市)、土鳖虫(购自浙江磐安中药材市场)为待测样品，所有待测样品均经大理大学杨自忠教授鉴定。取待测样品的部分肌肉组织分别编号并保存于 -20℃冰柜中。

2、同实施例1的操作，PCR时设置阴性对照(反应体系中不含模板，水代替为模板)和阳性对照(成虫的CO Ⅱ基因基因序列SEQ ID NO.1，实施例1制备得到；样品编号：X1)。美洲大蠊(样品编号：X2)、德国小蠊(样品编号：H1和H2)、小黄鳃金龟(样品编号：J1)、土鳖虫(样品编号：J2)的1.2％琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示。

如图2所示，其中，泳道X1为阳性对照，X2为美洲大蠊，H1和H2 为德国小蠊，J1为小黄鳃金龟，J2为土鳖虫，泳道MA为DNA标准分子量标。

由图2可以看出X2与阳性对照X1在250～500bp之间呈现清晰的电泳条带，而H1、H2在100bp以上有3个条带，且位置均与X1不同，J1则在接近250bp处显示可见电泳条带但位置低于X1，J2则未显示可见电泳条带。由于待测样品H1、H2、J1和J2的未显示出与阳性对照X1相同位置的PCR 扩增产物的电泳条带，由此可以判断H1、H2、J1和J2的样品均非美洲大蠊。可以看出，采用本发明提供的鉴别方法均可以有效鉴别美洲大蠊与其它昆虫，鉴别准确率100％。

3、委托华大基因对PCR扩增产物进行测序，测序结果与实施例1提供的SEQ IDNO.1所示的DNA条形码标准基因对比：德国小蠊的3个条带中有2个条带较接近X1，但其与SEQ ID NO.1的同源性都低于80％，由于土鳖虫在100bp以上没有可见条带，故未参与测序比对，小黄鳃金龟与SEQ ID NO.1的同源性为83％，来自云南省红河州野生种群的美洲大蠊的序列与SEQ ID NO.1的同源性为99％。

综上，可以看出，本发明提供的美洲大蠊鉴别方法可以有效区分与美洲大蠊同属的其他昆虫以及同目不同科的昆虫，特异性高。

实施例5 美洲大蠊的DNA条形码分子鉴定方法之稳定性检测

1、待测样品的采集与保存：

分别取采自云南省文山州野生的美洲大蠊(鲜品)、浙江中药材市场购得的美洲大蠊(干品)、安徽亳州中药材市场购得的美洲大蠊(干品)、河北安国中药材市场购得的美洲大蠊(炮制品)为待测样品，取特种药用昆虫开发国家地方联合工程研究中心(云南省)下属的药用昆虫标准化养殖作邑基地饲养的美洲大蠊成虫(鲜品)为阳性对照。待测样品和阳性对照均经大理大学杨自忠教授鉴定，并分别编号、保存于无水乙醇中。

2、同实施例1的操作，PCR时设置阴性对照(反应体系中不含模板，水代替为模板)。阳性对照(样品编号：Y1)、云南省文山州野生的美洲大蠊鲜品(样品编号：Y4)、购自浙江中药材市场的美洲大蠊干品(样品编号： Y6)、购自安徽亳州中药材市的美洲大蠊干品(样品编号：Y7)和购自河北安国中药材市场的美洲大蠊炮制品(样品编号：Y8)的1.2％琼脂糖凝胶电泳图谱如图3所示。

如图3所示，其中，泳道Y1为阳性对照，泳道Y4为云南株，泳道Y6 为浙江中药材市场购得的美洲大蠊干品，泳道Y7安徽亳州中药材市场购得的美洲大蠊干品，泳道Y8为河北安国中药材市场购得的美洲大蠊炮制品，泳道MA为DNA标准分子量标。

由图4可以看出，Y1、Y4、Y6、Y7和Y8的电泳条带均位于250～500bp 之间，并且Y4、Y6、Y7、Y8与Y1的电泳条带在同一位置，因而可以判断 Y4、Y6、Y7和Y8均为美洲大蠊。

3、委托华大基因对PCR扩增产物进行测序，测序结果与实施例1提供的SEQ IDNO.1所示的DNA条形码标准基因对比，待测样品Y4(云南株)、 Y6(浙江株)、Y7(安徽株)、Y8(河北株)和阳性对照的序列与SEQ ID NO.1的同源性皆为99％。

综上，可以看出，本发明提供的鉴别方法对于不同地理来源的美洲大蠊均可以有效鉴别，鉴别准确率100％。

实施例6 美洲大蠊的DNA条形码分子鉴定方法之实用性检测

1、待测样品的采集与保存：

分别取粉末状美洲大蠊(取样自四川好医生攀西药业股份有限公司生产的美洲大蠊精粉)、美洲大蠊部分虫体(取样自特种药用昆虫开发国家地方联合工程研究中心下属药用昆虫标准化养殖作邑基地饲养的美洲大蠊成虫筛选药材成品后拟丢弃的残缺虫体)、美洲大蠊幼虫和成虫(取样自云南省大理州巍山县美洲大蠊专业养殖户饲养间)为待测样品，取药材市场购买的美洲大蠊成虫(干品)为阳性对照。待测样品和阳性对照经大理大学杨自忠教授鉴定；其中，粉末状样品和残缺虫体无法直接通过形态学方法进行鉴定，幼虫无法鉴定到种。将待测样品和阳性对照分别编号并保存于-20℃冰柜中。

2、同实施例1的操作，PCR时设置阴性对照(反应体系中不含模板，水代替为模板)。阳性对照(样品编号：B3)、粉末状美洲大蠊(样品编号： B6)、美洲大蠊残缺虫体(样品编号：B7)、美洲大蠊幼虫(样品编号： B11)和美洲大蠊成虫(样品编号：B12)的1.2％琼脂糖凝胶电泳图谱如图 4所示。

如图4所示，其中，泳道B3为阳性对照，泳道B6为粉末状美洲大蠊，泳道B7为美洲大蠊的残缺虫体，泳道B11为幼虫，泳道B12为成虫，泳道 MA为DNA标准分子量标。

由图4可以看出，B3、B6、B7、B11和B12的电泳条带均在250～500bp 之间，且与阳性对照的电泳条带在同一位置，因而可以判断B6、B7、B11 和B12的样品均为美洲大蠊。可以看出，无论待测样品的形态如何，采用本发明提供的鉴别方法均可以直接进行检测，有效缩短了鉴别时间，鉴别准确率100％。

3、委托华大基因对PCR扩增产物进行测序，测序结果与实施例1提供的SEQ IDNO.1所示的DNA条形码标准基因对比，待测样品B6(粉末状样品)和B11(幼虫)的序列与SEQID NO.1的同源性皆为98％，待测样品阳性对照(B3)、B7(残缺虫体)和B12(成虫)的序列与SEQ ID NO.1的同源性为99％。

4、将采集到的剩余的幼虫置于合适的环境中饲养，约45天后，对长成成虫的虫体进行形态学鉴定确认是美洲大蠊。

综上所述，利用本发明提供的鉴别试剂盒鉴别待测样品是否为美洲大蠊，其准确性高，特异性好，鉴别时间短，对于不同样本形式、不同地理来源的美洲大蠊均可有效鉴别。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 大理大学

<120> 一种鉴别美洲大蠊的DNA 条形码标准检测片段COⅡ、试剂盒及其使用方法

<130> GW2018I2509

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 279

<212> DNA

<213> Periplaneta americana Linn

<400> 1

agatatgaat attcagattt cgcaaaggta gaatttgatt gatatataat tcctcaagat 60

gaaatagatc atagtatatt ccgactacta gatgttgata atcgagcagt tttacccata 120

aatacattta ttcgaattat cgtaacagca gcagacgttt tacactcatg aacaatcccg 180

agcctcggcg taaaagctga tgcaactcca ggtcgcctaa accaagttag atttttaatt 240

aatcgacctg gagttctata tggtcaatgt tcagaaatt 279

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attggacatc aatgatattg a 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaccaattt ctgaacattg acca 24

Claims (9)

1.一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段COⅡ，所述标准检测片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于鉴别美洲大蠊的引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增权利要求1所述DNA条形码标准检测片段COⅡ，所述引物对中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，包括权利要求2所述的引物对、PCR反应混合液；

所述PCR反应混合液包括：0.1U Taq聚合酶、500μmol/L dNTP、20mmol/L且pH＝8.3的Tris-HCl、100mmol/L氯化钾以及3μmol/L的氯化镁。

4.根据权利要求3所述用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为权利要求1所述DNA条形码标准检测片段COⅡ或美洲大蠊成虫。

5.根据权利要求3或4所述的用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，其特征在于，所述引物对中正反向引物的浓度均为10μmol/L。

6.一种利用权利要求3～5任意一项所述试剂盒鉴别美洲大蠊的方法，包括以下步骤：

提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA或阳性对照DNA作为模板DNA，分别与引物对、PCR反应混合液和蒸馏水混合得到样品扩增体系和阳性扩增体系，分别进行PCR扩增；

将得到的样品PCR扩增产物和阳性PCR扩增产物分别以琼脂糖凝胶电泳分离，当待测样品的PCR扩增产物的电泳条带位于250～500bp条带位置并且与阳性PCR扩增产物的电泳条带位置相同，则待测样品属于美洲大蠊。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括待鉴定的昆虫鲜品或干品。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系共50μL：模板DNA2μL、正反向引物各2μL、PCR反应混合液25μL以及蒸馏水19μL。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3.5s，依次进行94℃35s、49℃35s、72℃45s的循环33个，72℃延伸5min。