CN107177680A - 美洲大蠊特异性coi引物、含有其的试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体提供了美洲大蠊特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。本发明根据美洲大蠊mtDNA的保守序列，设计了一对美洲大蠊特异性COI引物JmF1和JmR1(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，经检测，该引物仅对美洲大蠊具有特异性扩增能力，扩增产物大小为452bp，灵敏度DNA浓度检出限为0.390625ng/uL。本发明利用PCR检测技术，由特异性引物扩增得到特异性单一条带，操作简单，具有高效、价廉、特异性强的特点，提高了检测的准确性。

Description

美洲大蠊特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及美洲大蠊特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。

背景技术

美洲大蠊(Periplaneta Americana L.)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，是我国重要的传统药材。其入药始载于《神农本草经》，并把它列为中品，谓“味咸、寒，有毒，治：血瘀症坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。《本草纲目》上记载其主治“瘀血，症坚，寒热，下气，利血脉”。《中国药学大辞典》、《中药大辞典》、《中国药用动物志》、《全国中草药汇编》等近、现代药学专著均记载蜚蠊有“活血、散瘀、化积、消疳、解毒、利尿、消肿”等功能。现代药理研究表明美洲大蠊具有多种药理作用，比如抗肿瘤、改善微循环、提高免疫力和促进组织修复等作用。

对美洲大蠊品种的鉴定是入药的基础，目前对药用美洲大蠊的鉴定大多采用的是活体鉴别的方法，主要是依据其外部形态特征进行判断。但是由于昆虫类药材大多外部形态相似，组织特征无特异性，而且经过产地粗加工和饮片炮制后，难以看出物种本身的形态和颜色，给准确的药材鉴定带来许多困难，所以传统的形态学特征识别方法存在识别困难与识别错误的问题。因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、高速快速等特点，再加上特异性引物可扩增得到物种特异性的条带，用此检测方法可不受形态的控制。本发明即提供了一种高效便捷的分子检测方法，利用特异性引物，根据预期DNA条带的有无来鉴定美洲大蠊，为准确、快速鉴定美洲大蠊药材提供有效手段支撑。

发明内容

本发明的目的是提供美洲大蠊特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。

为了实现本发明目的，本发明根据美洲大蠊的线粒体DNA序列，设计筛选得到一对美洲大蠊特异性COI引物JmF1和JmR1(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，其包括：

正向引物JmF1：5’-TGCTGAGCTCGGGCAACCA-3’；

反向引物JmR1：5’-CTACTGATCATACGAAAAGGGGA-3’。

本发明还提供含有引物JmF1和JmR1的用于检测美洲大蠊的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。优先地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供含有引物JmF1和JmR1，以及含有引物JmF1和JmR1的试剂盒在检测美洲大蠊中的应用。

本发明还提供一种美洲大蠊的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：

1)供试品前处理；

2)提取样品DNA；

3)以步骤2)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物JmF1和 JmR1进行PCR扩增反应；

4)分析PCR产物。

PCR扩增反应体系以25ul计为：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2.5ul、10× dNTPs 2.0ul、Taq酶(5单位/ul)0.2ul、模板DNA 2.0ul、正，反向引物(5umol/L) 各1.0ul、无菌双蒸水16.3ul。

PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s， 72℃延伸45s，共35个循环。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为452bp的DNA条带(SEQ IDNo.3)，则判定样品为美洲大蠊。

本发明的有益效果在于：

本发明根据GenBank中公布的美洲大蠊线粒体COI基因序列(AccesionNo.HM577152.1)，设计一对特异性COI引物JmF1和JmR1(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，该引物具有物种特异性，仅对美洲大蠊具有扩增效果、扩增产物大小为452bp，灵敏度DNA浓度检出限为0.390625ng/uL，而对其它蜚蠊目物种如澳洲大蠊、褐斑大蠊、菱叶斑蠊、双纹小蠊、德国小蠊、中华拟歪尾蠊、苏里南蔗蠊、多毛真鳖蠊、中华真地鳖无扩增能力。

本发明在美洲大蠊药材检测方面具有很高的价值，尤其当美洲大蠊药材处于粉末状态的情况下，本发明不仅节约时间而且准确性高，在实际应用中具有重要的意义。本发明利用PCR检测技术，由特异性引物扩增得到特异性单一条带，操作简单，具有高效、价廉、特异性强的特点，提高了检测的准确性。

附图说明

图1为本发明实施例1中美洲大蠊特异性引物JmF1和JmR1(SEQ ID No.1 和SEQ IDNo.2)在各蜚蠊物种中的检测结果；其中“M”代表DNAMarker，“-”代表阴性对照。

图2为本发明实施例2中美洲大蠊特异性引物JmF1和JmR1(SEQ ID No.1 和SEQ IDNo.2)的DNA浓度滴度检测结果；其中“M”代表DNA Marker，1-11 代表模板DNA浓度依次2倍稀释浓度滴度；“-”代表阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规试验条件，如Smabrook等分子克隆实验手册(J Sambrook, David RussellMolecular Cloning ALaboratory Manual Third Edition，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1美洲大蠊特异性引物JmF1和JmR1对美洲大蠊的扩增效果

1、供试品前处理

试验样本在基因组制备前，首先使用75％乙醇擦拭样本表面消除外源性污染，待乙醇挥发后，选取腹部肌肉组织进行充分磨碎后作为基因组提取样本。

2、美洲大蠊基因组的制备

采用DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司))提取美洲大蠊模板DNA，用微量分光光度计检测提取的美洲大蠊模板 DNA的浓度，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1ug/ul-0.2ug/ul。

3、合成美洲大蠊特异性COI引物序列

美洲大蠊特异性COI引物序列序列如下：

正向引物JmF1：5’-TGCTGAGCTCGGGCAACCA-3’；

反向引物JmR1：5’-CTACTGATCATACGAAAAGGGGA-3’。

4、PCR扩增

反应体系为25ul，包括：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2.5ul、10×dNTPs 2.0 ul、Taq酶(5单位/ul)0.2ul、模板DNA2.0ul、正，反向引物(5umol/L)各 1.0ul、无菌双蒸水16.3ul。

PCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s， 72℃延伸45s，共35个循环。PCR扩增仪型号为美国Applied Biosystems 9700 型。

5、PCR产物鉴定

取PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳分离，以其他常见蜚蠊目物种澳洲大蠊、褐斑大蠊、菱叶斑蠊、双纹小蠊、德国小蠊、中华拟歪尾蠊、苏里南蔗蠊、多毛真鳖蠊、中华真地鳖样品(见表1)为对照进行PCR扩增，，结果如图 1所示，仅有1、2泳道对应的美洲大蠊扩增出452bp的目的条带，说明本发明的引物特异性强。回收上述452bp的目的条带，进行测序，其序列如SEQ ID No.3 所示。

表1引物特异性检测中所涉及的蜚蠊目昆虫种类

科	亚科	属	序号	种类	拉丁学名
						蜚蠊科	蜚蠊亚科	大蠊属	1	美洲大蠊	Periplaneta americana L.
蜚蠊科	蜚蠊亚科	大蠊属	2	黑胸大蠊	Periplaneta fuliginosa Serville
						蜚蠊科	蜚蠊亚科	大蠊属	3	澳洲大蠊	Periplaneta australasiae(Fabricius)
蜚蠊科	蜚蠊亚科	大蠊属	4	褐斑大蠊	Periplaneta brunnea Burmeister
						蜚蠊科	蜚蠊亚科	斑蠊属	5	菱叶斑蠊	Neostylopyga rhombifolia(Stoll)
姬蠊科	姬蠊亚科	小蠊属	6	双纹小蠊	Blattella bisignata(Brunner v.W.)
						姬蠊科	姬蠊亚科	小蠊属	7	德国小蠊	Blattella germanica L.
姬蠊科	姬蠊亚科	拟歪尾蠊属	8	中华拟歪尾蠊	Episymploce sinensis(Walker)
						硕蠊科	蔗蠊亚科	蔗蠊属	9	苏里南蔗蠊	Pycnoscelus surinamensis L.
地鳖蠊科	地鳖蠊亚科	真鳖蠊属	10	多毛真鳖蠊	Eucorydia dasytoides(Walker)
						地鳖蠊科	地鳖蠊亚科	真鳖蠊属	11	中华真地鳖	Eupolyphaga sinensis(Walker)

实施例2引物JmF1和JmR1对美洲大蠊最低检出量的测定。

按实施例1提取美洲大蠊基因组DNA，按照实施例1中所述体系反应体系与PCR反应条件进行扩增。然后原模板溶液(DNA溶液浓度为50ng/ul)以2 倍进行递减梯度稀释，取2ul稀释后溶液作为PCR扩增的模板，直接加到PCR 反应体系中，反应体系同实施例1中的描述。直至稀释到检测不到条带为止。

利用引物JmF1和JmR1(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)做出最低检出量的测定，以不同稀释倍数的美洲大蠊基因组DNA为模板进行PCR扩增，如图 2所示，泳道2的DNA浓度为50ng/ul，以2倍法递减稀释的DNA模板进行扩增，结果显示泳道9为DNA浓度最低检出限，DNA浓度检出限为0.390625ng/uL (图2)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均落入本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川好医生攀西药业有限责任公司

<120> 美洲大蠊特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用

<130> 20

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 美洲大蠊

<400> 1

tgctgagctc gggcaacca 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 美洲大蠊

<400> 2

ctactgatca tacgaaaagg gga 23

<210> 3

<211> 452

<212> DNA

<213> 美洲大蠊

<400> 3

tgctgagctc gggcaaccag gttcactaat tggagatgat caaatttata atgtaatcgt 60

tactgcccat gccttcatta taattttctt tatagtaata ccaatcataa ttgggggatt 120

tggtaattga ttagtaccac taatattagg agccccagat atagccttcc cacgaataaa 180

taatataaga ttctgattat taccaccttc attaacttta ttactagcta gtagtatagt 240

agaaagaggt gccggaacag gatgaacagt atacccacca ctagcaagag gcattgctca 300

tgccggagca tctgttgatc tagcaatttt ttcattacat ctagcaggtg tatcctcaat 360

tctaggagct gtaaatttta tctccacaac aattaatata aaacctatta atataaaacc 420

agaacgaatt ccccttttcg tatgatcagt ag 452

Claims (8)

1.美洲大蠊特异性COI引物，其特征在于：其序列是：

正向引物JmF1：5’-TGCTGAGCTCGGGCAACCA-3’；

反向引物JmR1：5’-CTACTGATCATACGAAAAGGGGA-3’。

2.用于检测美洲大蠊的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

5.根据权利要求1所述引物或者权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测美洲大蠊中的应用。

6.美洲大蠊的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)供试品前处理；

2)提取样品DNA；

3)以步骤2)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物JmF1和JmR1进行PCR扩增反应；

4)分析PCR产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以25ul计为：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2.0ul、10×dNTPs 2.0ul、Taq酶(5单位/ul)0.2ul、模板DNA 2.0ul、正，反向引物(5umol/L)各1.0ul、无菌双蒸水补足至25ul。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环。