CN102559928A - 特异性引物组、包含其的试剂盒、使用方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种真鲷虹彩病毒检测试剂盒，其包括：设计好的真鲷虹彩病毒检测用的特异性引物组，所述特异性引物组是由如下6条特异性引物构成的：正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)。本发明的试剂盒利用环介导等温扩增技术，以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因全基因序列为基础设计6条引物，使目的片段通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，从而达到检测的目的，这种检测真鲷虹彩病毒的试剂盒快速、高效，能满足现场、即时检测的要求，为我国水产养殖业和国际鱼类贸易中的真鲷虹彩病毒的快速检测提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于病毒学、分子生物学领域，尤其涉及一种真鲷虹彩病毒检测试剂盒。
背景技术
真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridovirus，RSIV)属于虹彩病毒科(Iridoviridae)，细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)，主要感染真鲷、花鲈、条石鲷等海水鱼类，该病最早爆发于日本，随后，在东亚、东南亚相继爆发。该病在自然界暴发时大多数很突然，致死率高，是目前对各国海水养殖危害最为严重的疾病之一，同时该病还严重影响经济鱼类的进出口贸易。该病被列为必须向世界动物卫生组织(OIE)上报的疫病，我国农业部将其列为二类疫病，并每年两次对我国沿海海域进行该病的监控。
已有的真鲷虹彩病毒的检测方法一般分为四种：细胞分离培养、电镜观察、免疫学方法和分子生物学方法。
细胞分离培养与分子生物学方法被认为是水生动物病毒性疫病检测与鉴定的黄金法，但目前，用于分离真鲷虹彩病毒的细胞系很少，且敏感性差。
电镜观察方法是通过对感染病毒的细胞或组织(肝、脾、肾、脑)进行电镜观察，可以直接观察包涵体和病毒的形态特征，对病毒进行初步的分类和诊断，但该方法同样需要进一步的免疫学或分子生物学的方法进行确诊，且操作繁琐，不适合快速诊断。
免疫学方法可以确诊虹彩病毒的不同属，但属间经常有交叉反应，由于水生动物作为一种低等脊椎动物，免疫反应远逊色与哺乳动物，只能进行抗原的检测，该方法不适合低剂量病毒感染的检测与病毒监控的应用，对于不同的宿主，其灵敏度和特异性不尽相同。
PCR方法是世界动物卫生组织(OIE)谨慎推荐的一种水生动物疫病诊断的分子生物学方法，可以从感染虹彩病毒的水生动物的细胞系和有关组织(肝、脾、脑、肾)的核酸中扩增出目的片断，但该方法需要对扩增片段进行测序以对扩增结果进行进一步的确定，同时，要设立阳性和阴性对照，防止假阳性和假阴性的出现，检测周期长。就目前来讲，PCR方法是虹彩病毒检测较为适用的方法，但该方法仍存在一定的缺陷，PCR扩增产物须进行测序，耗时长，该方法需要进一步的改善。
真鲷虹彩病毒的检测靶序列有很多，包括DNA聚合酶(DPOL)基因、ATP酶基因、Pst I限制性位点、核酸还原酶小亚基(RNRS)基因、主要衣壳蛋白(MCP)基因等。MCP基因在决定病毒衣壳蛋白结构过程中具有重要作用，对决定病毒的血清型、基因型具有重要作用，该基因通常特异、保守，常被做为病毒分型与检测的依据，适合做为虹彩病毒检测与系统分类的依据，针对该序列设计的引物具有很好的特异性，以此为基础建立的检测方法具有很好的特异性。
环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)，是一种敏感性高、特异性强的靶DNA快速检测方法，该方法针对靶DNA的6个区域设计特异性引物，检测过程中不需要昂贵的仪器，检测条件恒温，快速、简便，检测结果可通过肉眼直接判断，检测灵敏度较常规PCR高。环介导等温扩增技术目前已被广泛应用于检测水生动物的病原体，如鱼类病毒(鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒)、对虾病毒(对虾白斑综合症病毒、黄头病毒)、细菌(迟钝爱德华氏菌)等。据检索，目前尚未见采用环介导等温扩增技术对真鲷虹彩病毒进行快速检测的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是在于需要提供一种新型的真鲷虹彩病毒检测试剂盒及其应用，利用环介导等温扩增技术，以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因全基因序列为基础设计6条引物，使目的片段通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，从而达到检测的目的，这种检测真鲷虹彩病毒的试剂盒快速、高效、简便，能满足现场、即时检测的要求，为我国水产养殖业和国际鱼类贸易中的真鲷虹彩病毒的快速检测提供技术支持。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种真鲷虹彩病毒检测用的特异性引物组，所述特异性引物组是由如下6条特异性引物构成的：正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)。
其中，所述6条特异性引物构成的特异性引物组序列分别为，
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种真鲷虹彩病毒检测试剂盒，其包括：设计好的上述的特异性引物组。
其中，所述试剂盒进一步包括：缓冲液Thermoplol buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸镁溶液(MgSO4)、甜菜碱Betaine(Sigma)、UNG酶、待检测样品的DNA模板以及水。
其中，所述正向外引物(F3)和所述反向外引物(B3)的浓度可以均是7μM～13μM，添加量可以均为0.3μL～0.7μL；所述正向环引物(LF)和所述反向环引物(LB)的浓度可以均是7μM～13μM，添加量可以均为0.3μL～0.7μL；所述正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)的浓度均可以是7μM～13μM，添加量可以均为1μL～3μL；所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的浓度优选为5mM～15mM，添加量可以为3μL～4μL；所述10×Thermoplol buffer的添加量可以为2μL～3μL；所述硫酸镁溶液(MgSO4)的浓度均可以是0.05M～0.15M，添加量可以均为0.5μL～1.5μL；所述UNG酶浓度为0.8～1.2U/μL UNG酶，添加量可以为0.4μL～0.8μL；所述待测样品DNA模板的添加量可以是1μL～3μL；所述甜菜碱Betaine(Sigma)的浓度可以是5M～15M，添加量可以为2μL～3μL。
其中，所述试剂盒中各试剂进一步分别为2.5μL的10×Thermoplol buffer、2μL的浓度为10μM的正向内引物(FIP)、2μL的浓度为10μM的反向内引物(BIP)、0.5μL的浓度为10μM的正向外引物(F3)、0.5μL的浓度为10μM的反向外引物(B3)、0.5μL的浓度为10μM的正向环引物(LF)、0.5μL的浓度为10μM的反向环引物(LB)，2.5μL的浓度为10M的甜菜碱Betaine(Sigma)、3.5μL的浓度为10mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、1μL的浓度为0.1M的硫酸镁溶液(MgSO4)，0.6μL浓度为1U/μL的UNG酶，2μL的待检测样品的DNA模板，加水补至24μL。
其中，所述试剂盒中还应包括添加量为0.5μL～1.5μL，浓度为6U/μL～10U/μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种上述的真鲷虹彩病毒检测试剂盒的使用方法，其包括：
第一步，待检测样品的DNA的提取；
第二步，将提取的DNA模板在所述试剂盒中进行环介导等温扩增反应；
第三步，对第二步反应获得的产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化。
其中，所述第二步进一步包括：
a、以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因全序列为基础，设计6条特异性引物构成的特异性引物组，建立环介导等温扩增反应体系和反应程序；
b、将所述六条特异性引物与缓冲液Thermoplol buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸镁溶液(MgSO4)、甜菜碱Betaine(Sigma)、UNG酶、所述第一步中提取的待检测样品的DNA以及水混合并加热反应；
c、将b步骤反应的产物冷却后加入链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillusstearothermophilus DNA polymerase，简称Bst DNA聚合酶)进一步加热反应，获得产物。
其中，所述6条特异性引物构成的特异性引物组分别为正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)。
其中，所述6条特异性引物构成的特异性引物组序列分别为，
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’。
其中，所述b步骤中，反应首先加热到40℃～60℃，反应2min～4min，随后将温度进一步升高至90℃～100℃，反应4min～6min。
其中，所述c步骤中，将b步骤反应后的产物冷却4min～6min，随后加入0.5μL～1.5μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)，进一步在60℃～65℃下反应50min～70min，随后加热到80℃～85℃下反应5min～15min，终止反应。
其中，所述第三步中产物的测定方法可以采用琼脂糖凝胶电泳法或荧光染料法(SYBR Green I)。
其中，所述第三步中的琼脂糖凝胶电泳法进一步包括：取1μL～5μL的第二步获得的产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，因为环介导等温扩增反应形成各种不同长度的茎环状结构片段，则产物经琼脂糖凝胶电泳后可观察到明显梯形扩增带，表明发生了扩增反应，若没有观察到梯形扩增带，则无扩增。
所述第三步中的荧光染料法(SYBR Green I)进一步包括：通过在第二步获得的产物中加入1μL～3μL的荧光染料100×SYBR Green I来肉眼判定，若发生扩增反应，则颜色为绿色，若为橙色，则没有发生扩增反应。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法，其包括：
第一步，待检测样品的DNA的提取；
第二步，将提取的DNA模板进行环介导等温扩增反应；
第三步，对第二步反应获得的产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化；
所述第二步进一步包括，
a、以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因全序列为基础，利用PrimerExplorer V3软件设计6条特异性引物构成的特异性引物组，建立环介导等温扩增反应体系和反应程序，所述6条特异性引物构成的特异性引物组分别为正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)，所述6条特异性引物构成的特异性引物组序列可以分别为，
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’；
b、将所述六条特异性引物与缓冲液Thermoplol buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸镁溶液(MgSO4)、甜菜碱Betaine(Sigma)、UNG酶、所述第一步中提取的待检测样品的DNA以及水混合，首先加热到40℃～60℃，反应2min～4min，随后将温度进一步升高至90℃～100℃，反应4min～6min；
c、将b步骤反应后的产物冷却4min～6min，随后加入0.5μL～1.5μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)，进一步在60℃～65℃下反应50min～70min，随后加热到80℃～85℃下反应5min～15min，终止反应；
所述第三步中产物的测定方法可以采用琼脂糖凝胶电泳法或荧光染料法(SYBR Green I)；
当采用琼脂糖凝胶电泳法测定时，因为环介导等温扩增反应形成各种不同长度的茎环状结构片段，则产物经琼脂糖凝胶电泳后可观察到明显梯形扩增带，表明发生了扩增反应，若没有观察到梯形扩增带，则无扩增；
当采用荧光染料法(SYBR Green I)时，通过在第二步获得的产物中加入荧光染料SYBR Green I来肉眼判定，若发生扩增反应，则颜色变成绿色，为真鲷虹彩病毒阳性，若保持橙色不变若为橙色，则没有发生扩增反应。
为解决上述技术问题，本发明还提供了上述的环介导等温扩增检测方法在水产养殖中的应用。
本发明的有益效果：
现对于现有技术，本发明的真鲷虹彩病毒检测的试剂盒具有如下优点：
1、本发明的试剂盒在大约1小时内即可完成，检测时间短；
2、本发明不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需一恒定温度就能反应，能满足现场及时检测的要求，操作简单简便；
3、本发明扩增真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白基因靶序列的6个区段，针对该6个区域设计3对特异性引物，因此该方法具有高度特异性；
4、通过对该试剂盒灵敏度的检测，本发明的检测限可到达模板浓度为20fg；通过与常规PCR的对比，检测限高出两个数量级，环介导等温扩增方法灵敏度高；
5、本发明的环介导等温扩增方法的扩增产物可以与荧光染料结合，肉眼观察就可以进行结果判定，简便高效。
附图说明
图1A和图1B为本发明和常规PCR方法对梯度稀释的真鲷虹彩病毒MCP基因重组质粒分别进行检测，检测产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2A和图2B为真鲷虹彩病毒LAMP方法特异性实验检测图；
图3A和图3B为本发明和OIE推荐的PCR方法在我国进行的真鲷虹彩病毒病毒调查过程中检出的4例阳性样品的结果图。
图中：
图1A和图1B中，1A为LAMP结果，1B为PCR扩增结果，M泳道是DL2000marker；1-8泳道的质粒稀释度为10-1～10-8；B泳道是空白对照；
图2A和图2B中，2A为电泳检测，2B为SYBR Green I检测，B泳道为空白对照；1泳道为RSIV MCP重组质粒，2泳道为流行性造血器官坏死病毒(epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV)核酸，3泳道为淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus，LCDV)核酸，4泳道为蛙病毒3(frog virus3，FV3)核酸，5泳道为甲鱼虹彩病毒(soft-shelled turtle iridovirus，STIV)的核酸；
图3A和图3B中，3A为本发明检测结果，3B为OIE方法检测结果，M泳道是DL2000marker；1泳道是阳性对照；2-5泳道是RSIV阳性样品；B泳道是空白对照。
具体实施方式
本发明提供了一种真鲷虹彩病毒检测用的特异性引物组，所述特异性引物组是由如下6条特异性引物构成的：正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)。
其中，所述6条特异性引物构成的特异性引物组序列分别为，
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’。
本发明还提供了一种真鲷虹彩病毒检测试剂盒，其包括：设计好的6条特异性引物构成的特异性引物组，分别为正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)。
其中，所述6条特异性引物构成的特异性引物组序列分别为，
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’。
其中，所述试剂盒进一步包括：缓冲液Thermoplol buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸镁溶液(MgSO4)、甜菜碱Betaine(Sigma)、UNG酶、待检测样品的DNA模板以及水。
所述缓冲液Thermoplol buffer由纽英伦生物技术(北京)有限公司提供，其成分为200mM Tris HCl，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4，0.1％Triton X-100(pH 8.8)。
所述UNG酶由上海闪晶公司提供。
所述正向外引物(F3)和所述反向外引物(B3)的浓度可以均是7μM～13μM，添加量可以均为0.3μL～0.7μL；所述正向环引物(LF)和所述反向环引物(LB)的浓度可以均是7μM～13μM，添加量可以均为0.3μL～0.7μL；所述正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)的浓度均可以是7μM～13μM，添加量可以均为1μL～3μL；所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的浓度优选为5mM～15mM，添加量可以为3μL～4μL；所述10×Thermoplol buffer的添加量可以为2μL～3μL；所述硫酸镁溶液(MgSO4)的浓度可以是0.05M～0.15M，添加量可以均为0.5μL～1.5μL；所述UNG酶浓度为0.8～1.2U/μL，添加量可以为0.4μL～0.8μL；所述待测样品DNA模板的添加量可以是1μL～3μL；所述甜菜碱Betaine(Sigma)的浓度可以是5M～15M，添加量可以为2μL～3μL。
其中，所述试剂盒中各试剂进一步分别为2.5μL的10×Thermoplol buffer、2μL的浓度为10μM的正向内引物(FIP)、2μL的浓度为10μM的反向内引物(BIP)、0.5μL的浓度为10μM的正向外引物(F3)、0.5μL的浓度为10μM的反向外引物(B3)、0.5μL的浓度为10μM的正向环引物(LF)、0.5μL的浓度为10μM的反向环引物(LB)，2.5μL的浓度为10M的甜菜碱Betaine(Sigma)、3.5μL的浓度为10mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、1μL的浓度为0.1M的硫酸镁溶液(MgSO4)，0.6μL浓度为1U/μL的UNG酶，2μL的待检测样品的DNA模板，加水补至24μL。
其中，所述试剂盒中还应包括添加量为0.5μL～1.5μL，浓度为6U/μL～10U/μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)。进一步优选链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)的浓度为8U/μL，添加量为1μL。
本发明还提供了一种真鲷虹彩病毒检测试剂盒的使用方法，其包括：
第一步，待检测样品的DNA的提取；
第二步，将提取的DNA模板在所述试剂盒中进行环介导等温扩增反应；
第三步，对第二步反应获得的产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化。
其中，所述第二步进一步包括：
a、以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因全序列为基础，设计6条特异性引物构成的特异性引物组，建立环介导等温扩增反应体系和反应程序；
b、将所述六条特异性引物与缓冲液Thermoplol buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸镁溶液(MgSO4)、甜菜碱Betaine(Sigma)、UNG酶、所述第一步中提取的待检测样品的DNA以及水混合并加热反应；
c、将b步骤反应的产物冷却后加入链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillusstearothermophilus DNA polymerase，简称Bst DNA聚合酶)进一步加热反应，获得产物。
其中，所述6条特异性引物构成的特异性引物组分别为正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)。
其中，所述6条特异性引物构成的特异性引物组序列分别为，
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’。
其中，所述b步骤中，反应首先加热到40℃～60℃，反应2min～4min，随后将温度进一步升高至90℃～100℃，反应4min～6min。
其中，所述c步骤中，将b步骤反应后的产物冷却4min～6min，随后加入0.5μL～1.5μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)，进一步在60℃～65℃下反应50min～70min，随后加热到80℃～85℃下反应5min～15min，终止反应。
其中，所述第三步中产物的测定方法可以采用琼脂糖凝胶电泳法或荧光染料法(SYBR Green I)。
其中，所述第三步中的琼脂糖凝胶电泳法进一步包括：取1μL～5μL的第二步获得的产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，若为真鲷虹彩病毒阳性，因为环介导等温扩增反应形成各种不同长度的茎环状结构片段，则产物经琼脂糖凝胶电泳后可观察到明显梯形扩增带，表明发生了扩增反应，若没有观察到梯形扩增带，则无扩增，真鲷虹彩病毒为阴性。
所述第三步中的荧光染料法(SYBR Green I)进一步包括：通过在第二步获得的产物中加入1μL～3μL的荧光染料100×SYBR Green I来肉眼判定结果，若发生扩增反应，则颜色为绿色，检测结果为真鲷虹彩病毒阳性，若为橙色，则没有发生扩增反应，检测结果为真鲷虹彩病毒阴性。
本发明提供了一种真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法，其包括：
第一步，待检测样品的DNA的提取；
第二步，将提取的DNA模板在上述的试剂盒中进行环介导等温扩增反应；
第三步，将第二步反应获得的产物进行检测，从而检测真鲷虹彩病毒。
所述第一步中，待检测样品的DNA可以采用任何商业化的试剂盒，如TAKDARA DV811A DNA提取试剂盒，或者传统的方法，如CTAB方法，去提取。
所述第二步进一步包括：
a、以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因全序列为基础，设计6条特异性引物构成的特异性引物组，建立环介导等温扩增反应体系和反应程序；
b、将所述六条特异性引物与缓冲液Thermoplol buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸镁溶液(MgSO4)、甜菜碱Betaine(Sigma)、UNG酶、所述第一步中提取的待检测样品的DNA以及水混合并加热反应；
c、将b步骤反应的产物冷却后加入链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillusstearothermophilus DNA polymerase，简称Bst DNA聚合酶)进一步加热反应，获得产物。
所述6条特异性引物构成的特异性引物组分别为正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)。
所述6条特异性引物构成的特异性引物组序列可以分别为：
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’。
所述a步骤中是通过Primer Explorer V3软件设计的6条特异性引物构成的特异性引物组。
所述b步骤中，所述正向外引物(F3)和所述反向外引物(B3)的浓度可以均是7μM～13μM，进一步优选为10μM，添加量可以均为0.3μL～0.7μL，进一步优选为0.5μL。
所述b步骤中，所述正向环引物(LF)和所述反向环引物(LB)的浓度可以均是7μM～13μM，进一步优选为10μM，添加量可以均为0.3μL～0.7μL，进一步优选为0.5μL。
所述b步骤中，所述正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)的浓度均可以是7μM～13μM，进一步优选为10μM，添加量可以均为1μL～3μL，进一步优选为2μL。
所述b步骤中，所述10×Thermoplol buffer的添加量可以为2μL～3μL，进一步优选为2.5μL。
所述b步骤中，所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)优选由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸三钠(dGTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)和脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)构成，所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)优选由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸三钠(dGTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)和脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的体积比优选为VdATP∶VdGTP∶VdCTP∶VdUTP＝1∶1∶1∶2。
所述b步骤中，所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的浓度优选为5mM～15mM，进一步优选为10mM，添加量可以为3μL～4μL，进一步优选为3.5μL。
所述b步骤中，所述硫酸镁溶液(MgSO4)的浓度均可以是0.05M～0.15M，进一步优选为0.1M，添加量可以均为0.5μL～1.5μL，进一步优选为1μL。
所述b步骤中，所述待测样品DNA模板的添加量可以是1μL～3μL，进一步优选为2μL。
所述b步骤中，所述甜菜碱Betaine(Sigma)的浓度均可以是5M～15M，进一步优选为10M，添加量可以均为2μL～3μL，进一步优选为2.5μL。
所述b步骤中，加入0.8U/μL～1.2U/μL UNG酶，添加量可以为0.4μL～0.8μL，进一步优选为1U/μL的UNG酶0.6μL。
所述b步骤中，反应首先加热到40℃～60℃，反应2min～4min，随后将温度进一步升高至90℃～100℃，反应4min～6min。
所述b步骤中，反应进一步优选首先加热到50℃，反应3min，随后将温度进一步升高至95℃，反应5min。
所述c步骤中，将b步骤反应后的产物冷却4min～6min，随后加入0.5μL～1.5μL，浓度为6U/μL～10U/μL，进一步优选为8U/μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)，进一步在60℃～65℃下反应50min～70min，随后加热到80℃～85℃下反应5min～15min，终止反应。
所述c步骤中，进一步优选将b步骤反应后的产物冷却5min，随后加入1μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)，进一步在63℃下反应60min，随后加热到82℃下反应10min，终止反应。
所述第三步中产物的检测方法可以采用琼脂糖凝胶电泳法或荧光染料法(SYBR Green I)。
所述第三步中的琼脂糖凝胶电泳法进一步包括：取1μL～5μL，进一步优选为3μL的第二步获得的产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，若为真鲷虹彩病毒阳性，因为环介导等温扩增反应形成各种不同长度的茎环状结构片段，则产物经琼脂糖凝胶电泳后可观察到明显梯形扩增带，表明发生了扩增反应，若没有观察到梯形扩增带，则无扩增，表明真鲷虹彩病毒为阴性。
所述第三步中的荧光染料法(SYBR Green I)进一步包括：通过在第二步获得的产物中加入1μL～3μL，进一步优选为2μL的荧光染料100×SYBRGreen I来肉眼判定结果，若发生扩增反应，则颜色变成绿色，为真鲷虹彩病毒阳性，若为橙色，则没有发生扩增反应，为真鲷虹彩病毒阴性。
本发明还提供了一种真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法，其包括：
第一步，待检测样品的DNA的提取；
第二步，将提取的DNA模板进行环介导等温扩增反应；
第三步，将第二步反应获得的产物进行检测，从而检测真鲷虹彩病毒；
所述第二步进一步包括，
a、以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因全序列为基础，PrimerExplorer V3软件设计6条特异性引物构成的特异性引物组，建立环介导等温扩增反应体系和反应程序，所述6条特异性引物构成的特异性引物组分别为正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)，所述6条特异性引物构成的特异性引物组序列可以分别为，
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’；
b、将所述六条特异性引物与缓冲液Thermoplol buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸镁溶液(MgSO4)、甜菜碱Betaine(Sigma)、UNG酶、所述第一步中提取的待检测样品的DNA以及水混合，首先加热到40℃～60℃，反应2min～4min，随后将温度进一步升高至90℃～100℃，反应4min～6min；
c、将b步骤反应后的产物冷却4min～6min，随后加入0.5μL～1.5μL浓度为6U/μL～10U/μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)，进一步在60℃～65℃下反应50min～70min，随后加热到80℃～85℃下反应5min～15min，终止反应；
所述第三步中产物的检测方法可以采用琼脂糖凝胶电泳法或荧光染料法(SYBR Green I)；
当采用琼脂糖凝胶电泳法检测时，若为真鲷虹彩病毒阳性，因为环介导等温扩增反应形成各种不同长度的茎环状结构片段，则产物经琼脂糖凝胶电泳后可观察到明显梯形扩增带，表明发生了扩增反应，若没有观察到梯形扩增带，则无扩增，表明真鲷虹彩病毒阴性；
当采用荧光染料法(SYBR Green I)时，通过在第二步获得的产物中加入荧光染料SYBR Green I来肉眼判定结果，若发生扩增反应，则颜色变成绿色，为真鲷虹彩病毒阳性，若为橙色，则没有发生扩增反应，为真鲷虹彩病毒阴性。
所述第一步中，待检测样品的DNA可以采用任何商业化的试剂盒或者传统的方法去提取。
所述b步骤中，所述正向外引物(F3)和所述反向外引物(B3)的浓度可以均是7μM～13μM，进一步优选为10μM，添加量可以均为0.3μL～0.7μL，进一步优选为0.5μL。
所述b步骤中，所述正向环引物(LF)和所述反向环引物(LB)的浓度可以均是7μM～13μM，进一步优选为10μM，添加量可以均为0.3μL～0.7μL，进一步优选为0.5μL。
所述b步骤中，所述正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)的浓度均可以是7μM～13μM，进一步优选为10μM，添加量可以均为1μL～3μL，进一步优选为2μL。
所述b步骤中，所述10×Thermoplol buffer的添加量可以为2μL～3μL，进一步优选为2.5μL。
所述b步骤中，所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)优选由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸三钠(dGTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)和脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)构成，所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)优选由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸三钠(dGTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)和脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的体积比优选为VdATP∶VdGTP∶VdCTP∶VdUTP＝1∶1∶1∶2。
所述b步骤中，所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的浓度优选为5mM～15mM，进一步优选为10mM，添加量可以为3μL～4μL，进一步优选为3.5μL。
所述b步骤中，所述硫酸镁溶液(MgSO4)的浓度均可以是0.05M～0.15M，进一步优选为0.1M，添加量可以均为0.5μL～1.5μL，进一步优选为1μL。
所述b步骤中，所述待测样品DNA模板的添加量可以是1μL～3μL，进一步优选为2μL。
所述b步骤中，所述甜菜碱Betaine(Sigma)的浓度均可以是5M～15M，进一步优选为10M，添加量可以均为2μL～3μL，进一步优选为2.5μL。
所述b步骤中，加入0.8U/μL～1.2U/μL UNG酶，添加量可以为0.4μL～0.8μL，进一步优选为1U/μL的UNG酶0.6μL。
所述b步骤中，反应进一步优选首先加热到50℃，反应3min，随后将温度进一步升高至95℃，反应5min。
所述c步骤中，进一步优选将b步骤反应后的产物冷却5min，随后加入1μL 8U/μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)，进一步在63℃下反应60min，随后加热到82℃下反应10min，终止反应。
本发明还提供了一种真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法，其包括：
(1)待检样品的DNA的提取：
用商业化的试剂盒或者传统的方法提取待检样品的DNA。
(2)进行真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增反应：
首先取一个1mL的聚丙烯塑料管，按下列体系与反应程序进行操作：
2.5μL 10×Thermoplol buffer，2μL 10μM FIP、BIP，0.5μL 10μM F3、B3，0.5μL 10μM LF、LB，2.5μL 10M甜菜碱Betaine(Sigma)、3.5μL 10mM dNTP(VdATP∶VdGTP∶VdCTP∶VdUTP＝1∶1∶1∶2)，0.6μL 1U/μL UNG酶，1μL 0.1MMgSO4，2μL模板，加水补至24μL。
50℃，反应3min；95℃，反应5min；冷却5min后加入1μL 8U Bst DNA聚合酶，将该反应混合物在63.0℃分别反应60min，然后82℃10min终止反应。
(3)结果的判定
方法一：琼脂糖凝胶电泳法
若为真鲷虹彩病毒阳性，则扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后可观察到明显梯形扩增带，反之则无扩增带。
方法二：SYBR Green I方法
通过在反应产物中加入2μL 100×的SYBR Green I来肉眼判定结果，真鲷虹彩病毒阳性颜色为绿色，否则为橙色。
本发明的检测方法的主要原理是：
首先以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因全基因序列为基础设计6对引物，使目的片段通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，从而达到检测的目的。基本程序是针对靶基因的6个区域，设计2对特异性引物，同时可以设计1-2条环引物以加快反应速度，利用一种链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearothermophilus DNA polymerase，简称BstDNA聚合酶)，在恒温65℃左右反应约1h。Bst DNA聚合酶有两大特性：一是具有5′-3′聚合酶活性，能在恒温状态下扩增DNA核酸；二是Bst DNA聚合酶具有链置换活性，能将新合成的核酸单链从新生成的DNA双链上置换(取代)下来，形成两条独立的核酸单链以开启下一轮的DNA核酸合成，进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。环介导等温扩增反应过程中，一对引物的5′端含有一段与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就可形成一个类似哑铃状的回文结构，这种结构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，Bst DNA聚合酶发挥链置换活性，后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链，从而保证了扩增的持续进行。环介导等温扩增反应形成一系列不同长度的具有茎环结构的DNA产物，可以通过荧光染料进行检测。
本发明的真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法以对各种鱼类特别是鲈鱼、石鲽、牙鲆、大菱鲆、真鲷等样品进行快速检测。
本发明还提供了上述的环介导等温扩增检测方法在水产养殖中的应用。
以下结合实施例和附图来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
试剂：Premix Taq(含DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture，D331A，TAKARA)；DNA提取试剂盒(DV811A，TAKARA)；Bst DNA Polymerase、10×Thermoplol buffer购自纽英伦生物技术(北京)有限公司；甜菜碱Betaine(Sigma)(Sigma)；UNG酶(上海闪晶公司)；DL2000 DNA marker(TAKARA)；SYBR Green I(Roche)。
实施例1：
将本实验室所保存的含有真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白全基因重组质粒进行10倍系列的梯度稀释，采用本发明对其进行检测，确定该本发明的检测限，采用的引物序列如下：
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’
引物由大连宝生物公司合成。
按下列程序进行真鲷虹彩病毒环介导等温扩增反应：
取一个0.2mL eppendorf管，加入如下试剂：2.5μL10×Thermoplol buffer，2μL 10μM FIP、BIP，0.5μL 10μM F3、B3，0.5μL 10μM LF、LB，2.5μL 10M甜菜碱Betaine(Sigma)、3.5μL 10mM dNTP(VdATP∶VdGTP∶VdCTP∶VdUTP＝1∶1∶1∶2)，1μL 0.1M MgSO4，0.6μL 1U/μL UNG酶，2μL待测样品的DNA模板，加水补至24μL。按下列程序操作：50℃，反应3min；95℃，反应5min；冷却5min后加入1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，将该反应混合物在63.0℃反应60min，然后82℃10min终止反应。
同时利用本发明一对外引物F3和B3对梯度稀释的重组质粒进行常规PCR检测，比较两种检测方法的灵敏度。
常规PCR采用LAMP的外引物F3和B3进行扩增，扩增片段长度为188bp。反应体系为：Premix Taq 12.5μL，10μM F3、B3各1μL，模板2μL，加H2O至终体积为25μL。反应程序为94℃预变性5min，之后94℃30s，56℃30s，72℃1min共进行40个循环，最后72℃延伸10min。
两种检测方法的检测结果通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，比较其灵敏度，见图1，其中，1A为LAMP结果，1B为PCR扩增结果，M泳道是DL2000marker；1-8泳道的质粒稀释度为10-1～10-8；B泳道为空白对照。
实施例2：
分析真鲷虹彩病毒环介导等温扩增检测方法的特异性；作为对照，采用与真鲷虹彩病毒亲缘关系较近的其他病毒，利用环介导等温扩增检测方法进行检测，这些病毒都属于虹彩病毒科，它们是流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、淋巴囊肿病毒(LCDV)、蛙病毒3(FV 3)、软壳龟虹彩病毒(STIV)；检测步骤同实施例1，只是将待测样品的DNA换成流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、淋巴囊肿病毒(LCDV)、蛙病毒3(FV 3)、软壳龟虹彩病毒(STIV)的DNA；检测结果显示，真鲷虹彩病毒环介导等温扩增检测方法引物只对真鲷虹彩病毒有扩增，对EHNV、LCDV、FV3、STIV均无扩增反应，反应产物通过琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I(Roche)两种方法来检测。通过琼脂糖凝胶电泳可见仅真鲷虹彩病毒MCP重组质粒呈梯型扩增带，其他病毒核酸无扩增带；SYBR Green I结果检测方法显示仅真鲷虹彩病毒MCP重组质粒呈绿色，其他病毒核酸反应产物呈橙黄色，见图2，其中，2A电泳检测，2B为SYBR Green I检测，B泳道为空白对照；1泳道为RSIV MCP重组质粒，2泳道为流行性造血器官坏死病毒(epizootichaematopoietic necrosis virus，EHNV)核酸，3泳道为淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus，LCDV)核酸，4泳道为蛙病毒3(frog virus 3，FV3)核酸，5泳道为甲鱼虹彩病毒(soft-shelled turtle iridovirus，STIV)的核酸，图2表明本发明特异性好，与其他病毒无交叉反应。
实施例3：
抽取山东海域养殖场鲈鱼、石蝶、大菱鲆，每种鱼类样品40批，共120批样品，每批样品30尾，进行真鲷虹彩病毒的检测，所抽取样品无典型临床症状。
按下述程序进行操作：
1、样品DNA的提取
每批样品30尾，分别取其脑、脾、肾组织，匀浆，采用DNA提取试剂盒(DV811A，TAKARA)，按说明书提取样品的DNA。
2、真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增反应
取一个0.2mL的聚丙烯塑料管，加入步骤(1)提取的样品的DNA 1.0μL，再加入其它反应成分与步骤同实施例1。
将上述塑料管置于63℃的恒温水浴锅中，放置60min进行环介导等温扩增反应；之后将水浴锅温度再调到82℃，放置3min以终止反应，取出含扩增产物的塑料管待检。
3、扩增产物的检测
在步骤(2)的的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据有无梯型扩增带，对待测样品的检测结果进行判断。4例样品呈梯型扩增带，为真鲷虹彩病毒阳性。
此120批样品采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的PCR方法进行检测，将两种方法进行比较，反应条件如下：反应引物为1-F(5’-CTCAAACACTCTGGCTCATC-3’)，1-R(5’-GCACCAACACATCTCCTATC-3’)扩增片段570bp；反应体系为Premix Taq 12.5μL，10μM上下游引物各1μL，模板DNA 2uL，加dH2O至终体积为25μL。反应条件为：94℃30s，58℃60s，72℃60s反应30个循环，72℃延伸5min。
两种检测方法检测结果相同，见图3，其中，3A为本发明检测结果，3B为OIE方法检测结果，其中M泳道是DL2000marker；1泳道是阳性对照；2-5泳道是RSIV阳性检出样品；B泳道是空白对照。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种真鲷虹彩病毒检测用的特异性引物组，其特征在于：所述特异性引物组是由如下6条特异性引物构成的：正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)。
2.如权利要求1所述的特异性引物组，其特征在于：
所述6条特异性引物构成的特异性引物组序列分别为，
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’。
3.一种真鲷虹彩病毒检测试剂盒，其特征在于，包括：设计好的权利要求1或2所述的特异性引物组。
4.如权利要求3所述的真鲷虹彩病毒检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒进一步包括：缓冲液Thermoplol buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸镁溶液(MgSO4)、甜菜碱Betaine(Sigma)、UNG酶、待检测样品的DNA模板以及水。
5.如权利要求3或4所述的真鲷虹彩病毒检测试剂盒，其特征在于：所述正向外引物(F3)和所述反向外引物(B3)的浓度可以均是7μM～13μM，添加量可以均为0.3μL～0.7μL；所述正向环引物(LF)和所述反向环引物(LB)的浓度可以均是7μM～13μM，添加量可以均为0.3μL～0.7μL；所述正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)的浓度均可以是7μM～13μM，添加量可以均为1μL～3μL；所述脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的浓度优选为5mM～15mM，添加量可以为3μL～4μL；所述10×Thermoplol buffer的添加量可以为2μL～3μL；所述硫酸镁溶液(MgSO4)的浓度可以是0.05M～0.15M，添加量可以均为0.5μL～1.5μL；所述待测样品DNA模板的添加量可以是1μL～3μL；所述甜菜碱Betaine(Sigma)的浓度可以是5M～15M，添加量可以为2μL～3μL，所述UNG酶浓度可以是0.8U/μL～1.2U/μL，添加量可以为0.4μL～0.8μL。
6.如权利要求3至5所述的真鲷虹彩病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还可以包括0.5μL～1.5μL浓度为6U/μL～10U/μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)。
7.一种权利要求3至6的真鲷虹彩病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：
第一步，待检测样品的DNA的提取；
第二步，将提取的DNA模板在所述试剂盒中进行环介导等温扩增反应；
第三步，将第二步反应获得的产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化。
8.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述第二步进一步包括：
a、以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因全序列为基础，设计6条特异性引物构成的特异性引物组，建立环介导等温扩增反应体系和反应程序；
b、将所述六条特异性引物与缓冲液Thermoplol buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸镁溶液(MgSO4)、甜菜碱Betaine(Sigma)、UNG酶、所述第一步中提取的待检测样品的DNA以及水混合并加热反应；
c、将b步骤反应的产物冷却后加入链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillusstearothermophilus DNA polymerase，简称Bst DNA聚合酶)进一步加热反应，获得产物。
9.如权利要求7或8所述的使用方法，其特征在于：所述第三步中产物的检测方法可以采用琼脂糖凝胶电泳法或荧光染料法(SYBR Green I)。
10.一种真鲷虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法，其特征在于：
第一步，待检测样品的DNA的提取；
第二步，将提取的DNA模板进行环介导等温扩增反应；
第三步，将第二步反应获得的产物进行测定，观察等温扩增反应导致的变化；
所述第二步进一步包括，
a、以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因全序列为基础，PrimerExplorer V3软件设计6条特异性引物构成的特异性引物组，建立环介导等温扩增反应体系和反应程序，所述6条特异性引物构成的特异性引物组分别为正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)，所述6条特异性引物构成的特异性引物组序列可以分别为，
RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；
RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；
RSIV-FIP：
5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；
RSIV-BIP：
5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；
RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；
RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’；
b、将所述六条特异性引物与缓冲液Thermoplol buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸镁溶液(MgSO4)、甜菜碱Betaine(Sigma)、UNG酶、所述第一步中提取的待检测样品的DNA以及水混合，首先加热到40℃～60℃，反应2min～4min，随后将温度进一步升高至90℃～100℃，反应4min～6min；
c、将b步骤反应后的产物冷却4min～6min，随后加入0.5μL～1.5μL的链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bst DNA)，进一步在60℃～65℃下反应50min～70min，随后加热到80℃～85℃下反应5min～15min，终止反应；
所述第三步中产物的检测方法可以采用琼脂糖凝胶电泳法或荧光染料法(SYBR Green I)；
当采用琼脂糖凝胶电泳法检测时，因为环介导等温扩增反应形成各种不同长度的茎环状结构片段，则产物经琼脂糖凝胶电泳后可观察到明显梯形扩增带，表明发生了扩增反应，若没有观察到梯形扩增带，则无扩增；
当采用荧光染料法(SYBR Green I)时，通过在第二步获得的产物中加入荧光染料SYBR Green I来肉眼判定，若发生扩增反应，则颜色变成绿色，若为橙色，则没有发生扩增反应。
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