CN110042174A - 海鲈虹彩病毒的检测方法与试剂盒 - Google Patents

海鲈虹彩病毒的检测方法与试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明的一种海鲈虹彩病毒的检测方法和试剂盒，通过引物自身的序列结构设计和引物间浓度比例的合理设置，同时结合对反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、DNA聚合酶浓度、反应温度和时间的合理设置以及从以上各因素整体角度的合理配合，实现了海鲈虹彩病毒CPA检测特异性和灵敏度。最低检测限度可达到102copies/μL，检测灵敏度较常规PCR高约10倍，且不与其他常见的水生病毒及水生常见细菌发生交叉反应，在待测样品的快速筛选检测方面具有明显优势。

Description

海鲈虹彩病毒的检测方法与试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种海鲈虹彩病毒的检测方法与试剂盒。
背景技术
海鲈(Lateolabrax maculatus)亦称鮨。鲈形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)，别名花鲈,是一种海产名贵经济鱼类。体长椭圆形而侧扁，略成纺锤形，头中等大，尖吻，口大，上下须有绒毛状牙群。背部稍隆起，其鳞为栉鳞，鳞较大，体色银白，背部呈是灰色，近似正方形。海鲈生性凶猛，以鱼、虾为食，耐低温、最适生长水温为16℃～27℃，最适生长盐度为16‰～17‰，是一种广盐性浅海岸中下层肉食鱼类。海鲈鱼在海洋中的分布比较广，亚洲的日本海、黄海、渤海是主要产地，在我国主要分布于黄海、东海、南海，台湾省。
在水产养殖业里，海鲈养殖占有重要地位，随着海鲈集约化养殖规模不断扩大，加之受管理技术相对滞后和养殖水环境污染严重等诸多因素的影响，海鲈养殖业病害频发且日趋严重。病害已给养殖生产造成了极大的经济损失，严重威胁了海鲈养殖业的稳定与发展。
海鲈的疾病可分为病毒类、细菌类、真菌类、寄生虫类等，其中病毒性流行病发病急往往来不及诊治就已经开始蔓延，且常常呈暴发式传播，传播范围广以及防治困难等特点，是目前困扰海鲈养殖发展的突出问题。细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)虹彩病毒，是目前发现的危害鱼类健康的重要病毒性病原之一，该属代表毒株是鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)和真鲷虹彩病毒(Red seabream iridovirus,RSIV)，此外，还分离到赤点石斑鱼虹彩病毒(Orange-spotted grouperiridovirus,OSGIV)，大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)，大黄鱼虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus,LYCIV)，牙鲆虹彩病毒(Koreanflounder iridovirus,FLIV)，矮鲈虹彩病毒(Dwarf gourami iridovirus,DGIV)，尖吻鲈虹彩病毒(Giant seaperch iridovirus,GSIV)，笋壳鱼虹彩病毒(Marble gobyiridovirus,MGIV)等等不同宿主来源的虹彩病毒；目前发现易感的养殖品种有鲈形目、鳕形目、鲽形目和鲀形目中的近百种海水、淡水鱼类。细胞肿大病毒属虹彩病毒的最适流行水温是28℃～30℃，所以多为春秋季节爆发，最高死亡率可达100％，也有研究表明。当水温低于18℃或者高于34℃时该病毒可感染鱼类而不出现任何临床症状。细胞肿大病毒属虹彩病毒的广泛分布性使得该属病毒可感染近百种淡水、海水鱼类且极可能造成大面积死亡，给水产养殖者造成重大经济损失。前期实验中我们分离到一株海鲈源虹彩病毒(Lateolabraxmaculatus iridovirus，LMIV)，具有较强的毒力，因此建立一种快速、灵敏、适合基层临床诊断的检测方法对该病毒的防控具有重要意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种高效、快速、灵敏的海鲈虹彩病毒的检测方法与试剂盒。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
一种海鲈虹彩病毒的CPA检测试剂盒，包含有检测引物：LMIV-F3，核苷酸序列为SEQ ID NO.1；LMIV-B3，核苷酸序列为SEQ ID NO.2；LMIV-B2，核苷酸序列为SEQ ID NO.3；LMIV-B1，核苷酸序列为SEQ ID NO.4；LMIV-CPF，核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
本发明还提供了一种非诊断目的的海鲈虹彩病毒的检测方法，具体技术方案如下：
一种非诊断目的的海鲈虹彩病毒的检测方法，采用如上所述的检测引物检测海鲈虹彩病毒。
在其中一些实施例中，包括以下步骤：
(1)以待测样品为模板，以如上所述的检测引物LMIV-F3、LMIV-B3、LMIV-B2、LMIV-B1、LMIV-CPF，进行CPA扩增：所述CPA扩增体系中，检测引物的浓度比，以μmol/L计，LMIV-F3：LMIV-B3：LMIV-B2：LMIV-B1：LMIV-CPF为0.4:0.4：(0.6～0.8)：(0.8～1.0)：1，DNA聚合酶的浓度为0.256U/μL～0.384U/μL，Mg2+浓度为4mM/L～8mM/L，甜菜碱浓度为0.4mol/L～0.6mol/L，dNTPs浓度为0.6mM/L～0.7mM/L；扩增条件为57℃～60℃下扩增30～60min；
(2)检测扩增产物。
基于上述技术方案，本发明具有以下效果：
本发明针对海鲈虹彩病毒，采用交叉引物等温扩增技术(CPA)，设计得到具有5条引物的引物组，用于海鲈虹彩病毒的CPA扩增及特异性检测，该引物具有良好的灵敏性和特异性。
本发明提供的一种海鲈虹彩病毒的检测方法，通过引物自身的序列结构设计和引物间浓度比例的合理设置，同时结合对反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、DNA聚合酶浓度、反应温度和时间的合理设置以及从以上各因素整体角度的合理配合，实现了海鲈虹彩病毒CPA检测特异性和灵敏度。最低检测限度可达到102copies/μL，检测灵敏度较常规PCR高约10倍，且不与其他常见的水生病毒及水生常见细菌发生交叉反应，在待测样品的快速筛选检测方面具有明显优势。
本发明的CPA技术具备其反应迅速、灵敏、精确、对检测设备要求低的优势，不需要专门的温度循环仪器，只需简单的恒温装置就可进行快速扩增，大大降低了经济成本。本发明采用交叉引物恒温扩增技术并结合一次性核酸试纸条，可大大提高海鲈虹彩病毒检测效率，降低检测成本的投入。
附图说明
图1为LMIV-CPA基础扩增体系电泳结果；
图2为不同引物浓度组合LMIV-CPA产物电泳结果；
图3为不同Bst聚合酶浓度下LMIV-CPA产物电泳结果；
图4为不同Mg2+浓度下LMIV-CPA产物电泳结果；
图5为不同Betaine浓度下LMIV-CPA产物电泳结果；
图6为不同dNTPs浓度LMIV-CPA产物电泳结果；
图7为不同反应温度下LMIV-CPA产物电泳结果；
图8为不同反应时间LMIV-CPA产物电泳结果；
图9为LMIV-CPA交叉反应电泳结果；
图10为LMIV-CPA灵敏度检测反应产物电泳结果；
图11为以DNA为模板的LMIV-CPA灵敏度反应结果电泳结果；
图12为以DNA为模板的PCR灵敏度反应结果电泳结果；
图13为LMIV-CPA交叉反应产物可视化试纸条检测结果；
图14为LMIV-CPA灵敏度检测反应产物可视化试纸条检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种海鲈虹彩病毒的CPA检测试剂盒，包含有检测引物：LMIV-F3，核苷酸序列为SEQ ID NO.1；LMIV-B3，核苷酸序列为SEQ ID NO.2；LMIV-B2，核苷酸序列为SEQID NO.3；LMIV-B1，核苷酸序列为SEQ ID NO.4；LMIV-CPF，核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
进一步地，其中对LMIV-B1和LMIV-B2的5’端分别标记有荧光基团，优选为FAM和Biotin，以便使用一次性核酸试纸条装置对LMIV-CPA扩增产物进行可视化检测。
本发明所述的CPA检测试剂盒中还可以包含有缓冲液、甜菜碱、Mg2+溶液和DNA聚合酶中的至少一种。便于在进行CPA扩增时，配制CPA反应体系，调整合适的反应浓度。可以理解的是，缓冲液、甜菜碱、Mg2+溶液或DNA聚合酶，并非是试剂盒中必要的组成试剂，均可以由其他合适的市售产品代替。
本发明还提供了采用如上所述的检测引物LMIV-F3、LMIV-B3、LMIV-B2、LMIV-B1、LMIV-CPF对海鲈虹彩病毒进行检测的方法。
具体地，包括以下步骤：(1)以待测样品为模板，以检测引物LMIV-F3、LMIV-B3、LMIV-B2、LMIV-B1、LMIV-CPF的检测引物，进行CPA扩增：所述CPA扩增体系中，检测引物的浓度比，以μmol/L计，LMIV-F3：LMIV-B3：LMIV-B2：LMIV-B1：LMIV-CPF为0.4:0.4：(0.6～0.8)：(0.8～1.0)：1，DNA聚合酶的浓度为0.256U/μL～0.384U/μL，Mg2+浓度为4mM/L～8mM/L，甜菜碱浓度为0.4mol/L～0.6mol/L，dNTPs浓度为0.6mM/L～0.7mM/L；扩增条件为57℃～60℃下扩增30～60min；(2)检测扩增产物。
优选地，LMIV-F3：LMIV-B3：LMIV-B2：LMIV-B1：LMIV-CPF为0.4:0.4:0.8:0.8:1。
优选地，所述DNA聚合酶的浓度为0.256U/μL和/或所述Mg2+浓度为6mM/L和/或所述甜菜碱浓度为0.4mol/L和/或所述dNTPs浓度为0.6mM/L和/或所述CPA扩增的扩增条件为58℃下扩增45min。
优选地，所述的检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法和/或核酸试纸条法。
具体地，采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物时，结果判定方法为：取扩增产物，琼脂糖凝胶电泳后，置于紫外灯或凝胶成像系统中观察，观察到CPA特征性梯状条带，则结果为阳性；无任何条带，则结果为阴性。采用核酸试纸条法检测扩增产物时，结果判定方法为：取扩增产物，用核酸试纸条检测，观察到只有一条质控线，则结果为阴性；同时观察到质控线和检测线，则结果为阳性；未观察到质控线，则检测结果无效。以上两种检测扩增产物用于判断海鲈虹彩病毒是否为阳性的方法可以根据条件选择其中一种使用；必要时，可以采用两种方法进行检测，相互验证检测结果。
本发明中所涉及的交叉引物恒温扩增技术，根据体系中交叉引物的数量可以分为单交叉引物恒温扩增(Single Cross priming amplification，Single-CPA)和双交叉引物恒温扩增(Double Cross priming amplification，Double-CPA)，Single-CPA一般由5条引物组成，包括1条交叉引物和4条短引物，Double-CPA则多了一条交叉引物。
单交叉恒温扩增的原理：交叉引物包含了对侧链的部分碱基序列，外引物剥离模板固定末端，在DNA聚合酶作用下标记引物与交叉引物不断地置换，延伸，这种链置换的特点就使得标记引物在反应进行到一定的阶段的时候会从同侧链变为异侧链，那么主要产物将获得两个标记成为双标引物。该技术可结合一次性核酸试纸条达到检测结果可视化，在DNA聚合酶下发生置换作用，整个过程耗时约一个小时，大大缩短了检测时间，为生产养殖中疫病的有效控制争取了时间，同时CPA也不需要像PCR那样需要复杂的循环温度，只需要一个恒定的温度，一般的金属浴和水浴锅都可满足要求，这符合现场检测满足不了高精尖的技术设备的实际情况。
本发明实施例中所使用的病毒和样品中：
海鲈虹彩病毒(LMIV)，锦鲤疱疹病毒(KHV)，鲤浮肿病毒(CEV)大肠杆菌，无乳链球菌，肺炎克雷伯菌，嗜水气单胞菌，由广东省农业科学院动物卫生研究所实验室保存；
中华鳖虹彩病毒(STIV)，斑点叉尾鮰疱疹病毒(CCV)，流行性造血器官坏死病毒(EHNV)由中国检科院惠赠。
本发明实施例中所使用的主要试剂和仪器包括：
常用仪器有恒温水浴锅，凝胶成像系统；
TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取试剂盒，购于TIANGEN生物工程有限公司；
Bst聚合酶，10xThermopol Reaction Buffer Mgso4，dNTP，Betaine购于NEB公司；
一次性核酸试纸条及配套缓冲液购于杭州优思达生物公司。
下面将结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例1
1、引物设计及合成
根据LMIV保守片段ATPase设计出三套单交叉引物，(一对外引物F3/B3，一对探针引物B1/B2，一个交叉引物CPF)，送交生工生物工程(广州)股份有限公司合成，稀释为10μmol·L-1备用。最终选定表1序列。
表1 LMIV-CPA引物1
表2 LMIV-CPA引物2
表3 LMIV-CPA引物3
2、LMIV病毒质粒DNA模板的制备
提取LMIV质粒DNA，测定浓度并计算质粒拷贝数，提取的质粒DNA浓度经测定为114μg/mL，质粒长度为720bp，经计算，该质粒浓度为3.92×1010copies/μL。然后将该质粒DNA进行梯度稀释，作为后续试验的DNA模板及阳性对照。
3、LMIV-CPA基础扩增反应体系的建立
建立一个基础反应体系，确定基础反应体系能产生预期的阳性反应再进行反应体系的优化。其中，以步骤2、LMIV病毒质粒DNA模板的制备中提取的LMIV质粒DNA为阳性对照，以ddH2O为阴性对照。反应产物经电泳后紫外灯下观察，阳性模板有特征性的梯形条带，阴性对照无梯形条带，见图1，其中，M：DNA相对分子质量标准Marker；1：表1引物扩增的阴性对照，2：表1引物扩增的阳性对照，3：表2引物扩增的阴性对照，4：表2引物扩增的阳性对照，5：表3引物扩增的阴性对照，6：表3引物扩增的阳性对照。结果表明，表1的引物序列扩增效果最佳，LMIV-CPA基础反应体系能对LMIV进行有效扩增。
表4 LMIV-CPA基础扩增体系
4、不同扩增反应体系的影响
不同引物浓度组合对海鲈虹彩病毒检测效果的影响
表5 LMIV-CPA不同引物浓度组合
LMIV-CPA基础扩增反应体系的条件为基准，控制变量，不同引物浓度配比的LMIV-CPA产物电泳结果如图2所示。其中，M：DNA相对分子质量标准Marker；1：阴性对照；2-12分别对应(见表3)中1-11不同引物浓度组合。可见，第6泳道和第8泳道(引物浓度组合5和组合7)扩增产物量较多，条带较清晰；其中第6泳道的引物浓度组合5(交叉引物CPF为1.0μmol·L-1，剥离引物F3和B3均为0.4μmol·L-1，探针引物B1(FAM)和B2(Biotin)均为0.8μmol·L-1)扩增产物量多，条带最清晰，为最佳浓度组合。
不同Bst聚合酶浓度对海鲈虹彩病毒检测效果的影响
反应体系中不同浓度的Bst聚合酶对于1.5LMIV-CPA法检测海鲈虹彩病毒的效果存在影响，本实验将Bst聚合酶浓度梯度依次设置为：0.064U/μL、0.128U/μL、0.192U/μL、0.256U/μL、0.32U/μL、0.384U/μL；不同Bst聚合酶浓度下LMIV-CPA产物电泳结果如图3所示。其中，M：DNA相对分子质量标准Marker；1为阴性对照；2-7分别为反应体系中加入了6个反应梯度依次为0.064U/μL、0.128U/μL、0.192U/μL、0.256U/μL、0.32U/μL、0.384U/μL的Bst聚合酶的PCR产物电泳结果。可见，在0.064～0.192U/μL范围内，条带较不清晰，而在0.256U/μL～0.384U/μL浓度范围内，条带清晰，而因为Bst聚合酶工作浓度在0.256U/μL梯形条带已足够清晰，达到检测要求，考虑成本，所以Bst聚合酶最佳工作浓度为0.256U/μL。
不同Mg2+浓度对海鲈虹彩病毒检测效果的影响
本实验设置11个Mg2+浓度梯度依次为：0mM/L、1mM/L、2mM/L、3mM/L、4mM/L、5mM/L、6mM/L、7mM/L、8mM/L、9mM/L、10mM/L；不同Mg2+浓度下LMIV-CPA产物电泳结果如图4所示，其中，M：DNA相对分子质量标准Marker，1为阴性对照，2-12为浓度梯度依次为：0mM/L、1mM/L、2mM/L、3mM/L、4mM/L、5mM/L、6mM/L、7mM/L、8mM/L、9mM/L、10mM/L的不同浓度的Mg2+反应体系PCR产物的电泳结果。可见，第6-10泳道可见条带(4mM/L～8mM/L)，而第8泳道的条带(6mM/L)最清晰，MgSO4最佳工作浓度为6mM/L。
不同Betaine浓度对海鲈虹彩病毒检测效果的影响
不同Betaine浓度下LMIV-CPA产物电泳结果如图5所示，其中，M：DNA相对分子质量标准Marker，1、3、5、7、9、11、13、15为阴性对照，2、4、6、8、10、12、14、16分别设置8个Betaine浓度梯度依次为0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L；可见，第6泳道(0.4mol/L)和第7泳道(0.6mol/L)的条带亮度较大，其中，第6泳道(0.4mol/L)亮度最大，Betaine的最佳工作浓度为0.4mol/L。
不同dNTPs浓度对海鲈虹彩病毒检测效果的影响
不同dNTPs浓度下LMIV-CPA产物电泳结果如图6所示，其中，M：DNA相对分子质量标准Marker，1为阴性对照，2-11设置10个dNTPs浓度梯度依次为0mM/L、0.1mM/L、0.2mM/L、0.3mM/L、0.4mM/L、0.5mM/L、0.6mM/L、0.7mM/L、0.8mM/L、0.9mM/L。可见，第8泳道(0.6mM/L)和第9泳道(0.7mM/L)的条带亮度较大，第8泳道(0.6mM/L)的亮度最大，dNTPs的最佳工作浓度为0.6mM/L。
不同反应温度、时间对海鲈虹彩病毒检测效果的影响
不同反应温度下LMIV-CPA产物电泳结果如图7所示，其中，M：DNA相对分子质量标准Marker，反应温度优化：1、3、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21为阴性对照，2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22设置11个反应温度梯度依次为56℃；57℃；58℃；59℃；60℃；61℃；62℃；63℃；64℃；65℃；66℃。图7可见泳道6(58℃)时，条带清晰且亮度较大。不同反应时间LMIV-CPA产物电泳结果如图8所示，其中，M：DNA相对分子质量标准Marker，反应时间优化：1、3、5、7、9、11为阴性对照，2、4、6、8、10、12设置6个反应时间梯度依次为15min、30min、45min、60min、75min、90min。可见，第4、6、8泳道的条带清晰(反应时间依次为30min、45min、60min)，第6泳道(45min)的条带最清晰，亮度最大。LMIV-CPA最适反应条件为58℃扩增45分钟。
综上，本发明针对海鲈虹彩病毒(LMIV)设计得到一套LMIV-CPA引物，其中对LMIV-B1和LMIV-B2的5’端分别标记FAM和Biotin，以便使用一次性核酸试纸条装置对LMIV-CPA扩增产物进行可视化检测。本实验中(LMIV-CPF:LMIV-F3:LMIV-B3:LMIV-B1:LMIV-B2)的浓度比例为(1：0.4：0.4：0.8：0.8)，剥离引物LMIV-F3和LMIV-B3需要量最少，其次到探针引物LMIV-B1和LMIV-B2，交叉引物LMIV-CPF所需量最多。在此基础上，合理设置体系中Betaine的含量能提高对目的基因的选择性，降低非目的基因对核酸扩增的干扰，实现特异性扩增。甜菜碱浓度为0.4mol/L时，扩增效率最佳，随着甜菜碱浓度的增加，扩增效率逐渐下降；Mg2+能与Bst聚合酶上的活性位点相结合，起催化作用，可影响Bst聚合酶活性，当Mg2+浓度过低时，对Bst聚合酶几乎没有催化作用，酶的活性降低，但Mg2+浓度过高时，又会抑制Bst聚合酶的活性而导致扩增产物减少，因此需要合理调节体系中的Mg2+浓度。温度也会影响Bst聚合酶的活性，从而影响扩增效率。扩增时间也是影响扩增效率的一大因素。因此，本发明通过引物自身的序列结构设计和引物间浓度比例的设置，同时结合对引物浓度比例、MgSO4浓度、dNTPs浓度、Bst聚合酶量、反应温度和时间的合理设置及合理配合，实现了LMIV-CPA检测特异性和灵敏度。
实施例2 LMIV-CPA方法交叉反应检测
本申请分别采用水生鱼类常见病毒毒株海鲈虹彩病毒(LMIV)，锦鲤疱疹病毒(KHV)，鲤浮肿病毒(CEV)，中华鳖虹彩病毒(STIV)，斑点叉尾鮰疱疹病毒(CCV)，流行性造血器官坏死病毒(EHNV)及水生鱼类常见细菌病菌株无乳链球菌，肺炎克雷伯菌，嗜水气单胞菌作为反应模板，用实施例1中所述的最佳LMIV-CPA反应体系进行交叉实验。反应体系如表4所示。
表4 LMIV-CPA基础扩增体系
扩增产物电泳结果如图9所示，其中，M：DNA相对分子质量标准Marker；1为阴性对照；2为海鲈虹彩病毒攻毒感染海鲈后提取的组织DNA；3为海鲈虹彩病毒质粒DNA；4为锦鲤疱疹病毒(KHV)；5为鲤浮肿病毒(CEV)；6为中华鳖虹彩病毒(STIV)；7为斑点叉尾鮰疱疹病毒(CCV)；8为流行性造血器官坏死病毒(EHNV)；9为无乳链球菌；10为肺炎克雷伯菌；11为嗜水气单胞菌。可见，只有第2、第3泳道LMIV质粒和海鲈虹彩病毒DNA出现了典型的梯状条带，其余均无条带。说明建立的LMIV-CPA方法检测海鲈虹彩病毒的特异性较好，与其他病毒或病原细菌不具有交叉反应。
实施例3 LMIV-CPA方法灵敏度实验
用无核酸酶水调整实施例1步骤2、LMIV病毒质粒DNA模板的制备中提取的LMIV质粒DNA浓度为3.97×1010copies/μL，3.97×109copies/μL，3.97×108copies/μL，3.97×107copies/μL，3.97×106copies/μL，3.97×105copies/μL，3.97×104copies/μL，3.97×103copies/μL，3.97×102copies/μL，3.97×101copies/μL用实施例1中建立的最佳LMIV-CPA反应体系(表4)对上述不同浓度质粒DNA进行扩增；
LMIV-CPA灵敏度检测反应产物电泳结果如图10所示，其中，M：DNA相对分子质量标准Marker，1为阴性对照，2-10依次为：LMIV质粒DNA3.97×1010copies/μL，3.97×109copies/μL，3.97×108copies/μL，3.97×107copies/μL，3.97×106copies/μL，3.97×105copies/μL，3.97×104copies/μL，3.97×103copies/μL，3.97×102copies/μL，3.97×101copies/μL。图10可见，建立的LMIV-CPA方法检测时，LMIV质粒DNA浓度在3.97×1010～3.97×102copies/μL时，均有大量扩增，阴性对照和3.97×101copies/μL无扩增，即建立的LMIV-CPA方法最低检出限为3.97×102copies/μL。
用无核酸酶水调整从海鲈虹彩病毒攻毒感染海鲈后提取的组织DNA浓度，梯度稀释10倍，共稀释5个梯度，用实施例1中建立的最佳LMIV-CPA反应体系(表4)和常规PCR法对上述不同浓度组织DNA进行扩增，比较灵敏度差异。常规PCR的反应条件：PCR反应总体系为25μL，包括阳性模板1μL，上下游引物各1μL，灭菌双蒸水9.5μL，Taq酶12.5μL。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性30s、58℃退火1min、72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。常规PCR法参照世界动物卫生组织(OIE)《水生动物疾病诊断手册》推荐的方法，所使用的引物序列为：4F(5’-CGGGGGCAATGACGACTACA-3’，SEQ ID NO.16)和4R(5’-CCGCCTGTGCCTTTTCTGGA-3’，SEQ ID NO.17)扩增产物大小568bp。图11可见LMIV-CPA能检出103倍稀释的组织DNA，图12可见PCR方法只能检出102倍稀释液的组织DNA，LMIV-CPA方法的灵敏度较常规PCR方法高出10倍。即建立的LMIV-CPA方法时常规PCR法的10倍。
实施例4 LMIV-CPA可视化试纸条检测
取实施例2和实施例3中LMIV-CPA法的扩增产物，用核酸试纸条检测装置检测，带有探针的反应产物采用一次性核酸试纸条检测装置进行检测，在3～5min内即可通过是否出现特征性条带而达到反应结果可视化。
对实施例2中LMIV-CPA交叉反应产物可视化试纸条检测结果如图12所示，其中，1：阴性对照，2：海鲈虹彩病毒攻毒感染海鲈后提取的组织DNA，3：海鲈虹彩病毒质粒DNA，4：锦鲤疱疹病毒(KHV)，5：鲤浮肿病毒(CEV)，6：中华鳖虹彩病毒(STIV)，7：斑点叉尾鮰疱疹病毒(CCV)，8：流行性造血器官坏死病毒(EHNV)，9：无乳链球菌，10：肺炎克雷伯菌，11：嗜水气单胞菌。交叉反应产物中，仅海鲈虹彩病毒病毒DNA和海鲈虹彩病毒质粒DNA阳性对照结果显示为阳性，其余为阴性，与琼脂糖凝胶电泳结果(图9)一致，具有海鲈虹彩病毒检测的特异性，与其他病毒或病原细菌不具有交叉反应。
对实施例3中LMIV-CPA灵敏度检测反应产物可视化试纸条检测结果如图13所示，其中，1：阴性对照，2-11：LMIV质粒DNA3.97×1010copies/μL，3.97×109copies/μL，3.97×108copies/μL，3.97×107copies/μL，3.97×106copies/μL，3.97×105copies/μL，3.97×104copies/μL，3.97×103copies/μL，3.97×102copies/μL，3.97×101copies/μL。可见，LMIV质粒DNA浓度在3.97×1010～3.97×102copies/μL时，检测结果为阳性，阴性对照和3.97×101copies/μL为阴性。灵敏度检测结果与琼脂糖凝胶电泳结果(图12)一致，最低检出限为3.97×102copies/μL。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 海鲈虹彩病毒的检测方法与试剂盒
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtggctcat gttgatcttt g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtgtaacc ttttccatca acg 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaaataaaa agataccgtc tatac 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaatgtctgc tttggtatgt tgccc 25
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaatgtctgc tttggtatgt tgcccatgga taacgccaag atg 43
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
attgcagcca agcggcacat a 21
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttatgaccag aacattccag tgacg 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctcagggtc cacattcttt agtg 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caaagatcaa catgagccac 20
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caaagatcaa catgagccac tcaggctccg aggaggccaa cc 42
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcggtgctaa tcaaatctat c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcccattctt gaacaggtcc at 22
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagtgctcag ggtccacatt cttta 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgtgattaaa catcttggcg ttatc 25
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgtgattaaa catcttggcg ttatctgtac aacaagtttg acgctg 46

Claims (10)

1.一种海鲈虹彩病毒的CPA检测试剂盒，其特征在于，包含有检测引物：LMIV-F3，核苷酸序列为SEQ ID NO.1；LMIV-B3，核苷酸序列为SEQ ID NO.2；LMIV-B2，核苷酸序列为SEQID NO.3；LMIV-B1，核苷酸序列为SEQ ID NO.4；LMIV-CPF，核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
2.根据权利要求1所述的CPA检测试剂盒，其特征在于，所述LMIV-B2的5’端和所述的LMIV-B1的5’端分别标记有荧光基团；LMIV-B2的5’端标记的荧光基团与LMIV-B1的5’端标记的荧光基团不同。
3.根据权利要求1或2所述的CPA检测试剂盒，其特征在于，还包括：缓冲液、甜菜碱、Mg2+溶液和DNA聚合酶中的至少一种。
4.一种非诊断目的的海鲈虹彩病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测样品为模板，以如权利要求1～3任一项所述的检测引物，进行CPA扩增：所述CPA扩增体系中，检测引物的浓度比，以μmol/L计，LMIV-F3：LMIV-B3：LMIV-B2：LMIV-B1：LMIV-CPF为0.4：0.4：(0.6～0.8)：(0.8～1.0)：1；
(2)检测扩增产物。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测样品为模板，以如权利要求1～3任一项所述的检测引物，进行CPA扩增：所述CPA扩增体系中，检测引物的浓度比，以μmol/L计，LMIV-F3：LMIV-B3：LMIV-B2：LMIV-B1：LMIV-CPF为0.4:0.4：(0.6～0.8)：(0.8～1.0)：1，DNA聚合酶的浓度为0.256U/μL～0.384U/μL，Mg2+浓度为4mM/L～8mM/L，甜菜碱浓度为0.4mol/L～0.6mol/L，dNTPs浓度为0.6mM/L～0.7mM/L；扩增条件为57℃～60℃下扩增30～60min；
(2)检测扩增产物。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测引物的浓度比，以μmol/L计，LMIV-F3：LMIV-B3：LMIV-B2：LMIV-B1：LMIV-CPF为0.4:0.4:0.8:0.8:1。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶的浓度为0.256U/μL；和/或
所述Mg2+浓度为6mM/L；和/或
所述甜菜碱浓度为0.4mol/L；和/或
所述dNTPs浓度为0.6mM/L。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述CPA扩增的扩增条件为58℃下扩增45min。
9.根据权利要求4～8任一项所述的检测方法，步骤(2)所述的检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法和/或核酸试纸条法。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述检测扩增产物的结果判定包括以下至少一种：
(1)取扩增产物，琼脂糖凝胶电泳后，置于紫外灯或凝胶成像系统中观察，观察到CPA特征性梯状条带，则结果为阳性；无任何条带，则结果为阴性；
(2)取扩增产物，用核酸试纸条检测，观察到只有一条质控线，则结果为阴性；同时观察到质控线和检测线，则结果为阳性；未观察到质控线，则检测结果无效。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1827778A (zh) * 2005-03-02 2006-09-06 国家海洋局第三海洋研究所 鱼类虹彩病毒实时荧光定量pcr检测方法
CN101845516A (zh) * 2009-12-04 2010-09-29 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种真鲷虹彩病毒的实时定量pcr检测方法
CN102559928A (zh) * 2011-12-28 2012-07-11 中国海洋大学 特异性引物组、包含其的试剂盒、使用方法及检测方法
KR20150062851A (ko) * 2013-11-29 2015-06-08 한국해양과학기술원 이리도바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 검출방법
KR101642783B1 (ko) * 2016-01-15 2016-07-27 대한민국 참돔 이리도바이러스병 원인바이러스의 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 검출 방법
CN106148566A (zh) * 2015-04-23 2016-11-23 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种大鲵虹彩病毒cpa检测引物及应用
CN108342511A (zh) * 2018-05-08 2018-07-31 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及其应用
CN108950067A (zh) * 2018-07-03 2018-12-07 杭州奥盛仪器有限公司 检测对虾虹彩病毒的lamp引物组、试剂盒及其方法
CN109234451A (zh) * 2018-09-26 2019-01-18 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种罗非鱼细小病毒TiPV CPA检测引物及应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1827778A (zh) * 2005-03-02 2006-09-06 国家海洋局第三海洋研究所 鱼类虹彩病毒实时荧光定量pcr检测方法
CN101845516A (zh) * 2009-12-04 2010-09-29 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种真鲷虹彩病毒的实时定量pcr检测方法
CN102559928A (zh) * 2011-12-28 2012-07-11 中国海洋大学 特异性引物组、包含其的试剂盒、使用方法及检测方法
KR20150062851A (ko) * 2013-11-29 2015-06-08 한국해양과학기술원 이리도바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 검출방법
CN106148566A (zh) * 2015-04-23 2016-11-23 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种大鲵虹彩病毒cpa检测引物及应用
KR101642783B1 (ko) * 2016-01-15 2016-07-27 대한민국 참돔 이리도바이러스병 원인바이러스의 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 검출 방법
CN108342511A (zh) * 2018-05-08 2018-07-31 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及其应用
CN108950067A (zh) * 2018-07-03 2018-12-07 杭州奥盛仪器有限公司 检测对虾虹彩病毒的lamp引物组、试剂盒及其方法
CN109234451A (zh) * 2018-09-26 2019-01-18 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种罗非鱼细小病毒TiPV CPA检测引物及应用

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN XINHUA等: "Diagnosis of iridovirus in large yellow croaker by PCR", 《海洋学报（英文版）》 *
GO J等: "The molecular epidemiology of iridovirus in Murray cod (Maccullochella peelii peelii) and dwarf gourami (Colisa lalia) from distant biogeographical regions suggests a link between trade in ornamental fish and emerging iridoviral diseases.", 《MOL CELL PROBES》 *
S等: "Rapid diagnosis of red sea bream iridovirus infection using the polymerase chain reaction", 《DIS AQUAT ORGAN》 *
吴成龙等: "鱼类细胞肿大虹彩病毒病研究进展", 《动物医学进展》 *
李聪慧等: "锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增检测方法的建立", 《水产学报》 *
林端等: "鱼类虹彩病毒PCR快速检测试剂盒的准确度评价及其应用", 《海洋环境科学》 *
贾坤同等: "海水养殖鱼类中虹彩病毒无症状感染的套式PCR分析", 《中国水产科学》 *
赵玉然等: "真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用", 《渔业科学进展》 *
陈新华等: "大黄鱼虹彩病毒PCR快速检测试剂盒的研制", 《生物技术》 *

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