CN106148566A

CN106148566A - 一种大鲵虹彩病毒cpa检测引物及应用

Info

Publication number: CN106148566A
Application number: CN201510197194.3A
Authority: CN
Inventors: 徐进; 曾令兵; 周勇
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2015-04-23
Filing date: 2015-04-23
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2035-04-23
Also published as: CN106148566B

Abstract

本发明公开了一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物及应用。一种大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒，包括以下成分：10×ThermoPol^® Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶；dNTPs；交叉引物CPF、CPR；检测引物DF、DR；剥离引物DPF、DPR；MgSO₄；Betaine；核酸检测试纸条。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，结果判定客观、直观，且成本低，使用方便，对人和环境都非常安全。本发明不仅可以在专业实验室使用，还可以应用于野外的现场快速检测，仅需一个金属浴或水浴锅，即可在1.5小时内准确检测出样品中的大鲵虹彩病毒。

Description

一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物及应用

技术领域

本发明属于两栖类动物病毒检测技术领域，具体涉及一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物，还涉及该引物的应用。

背景技术

大鲵(Andrias davidianus)俗称娃娃鱼，是我国特有的珍稀两栖类动物，1988年被列为国家二级保护动物，2007年《濒危野生动植物物种国际贸易公约》(CITES)中被列为Ⅰ类濒危物种。因大鲵具有极高的营养价值和药用价值，我国自上世纪80年代突破了大鲵的人工繁育技术以后，开始了大鲵的规模化人工养殖。目前大鲵已作为重点开发的养殖品种，在全国多个省市被广泛养殖。由于养殖集约化发展，大鲵种质下降，养殖环境恶化等问题，导致大鲵养殖中病害频发，除了细菌性病原以外，由大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus，GSIV)感染引起大鲵虹彩病毒病是目前唯一发现的大鲵病毒性疾病，该病给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失，已成为制约大鲵养殖业健康可持续发展的瓶颈。

对于大鲵虹彩病毒，目前的诊断方法有细胞培养分离、电镜技术、聚合酶链式反应(PCR)、TaqMan实时荧光定量PCR、环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。细胞培养法不能直接对病毒进行检测，只能利用细胞培养物的病变特征进行初步判定并进行进一步病毒检测才能进行准确诊断；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低。常规PCR和TaqMan实时荧光定量PCR技术依赖昂贵的仪器设备，上述方法均只适合在专业实验室的应用。LAMP法是一种现场的快速诊断技术，但通常其检测结果依靠人肉眼对反应液颜色的变化进行判断，具有一定的主观性。可见，上述方法都有各自的局限性，为了及早发现和确诊大鲵虹彩病毒病，有必要建立一种不仅准确、快速、灵敏，而且结果判断客观、直观的检测方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为大鲵养殖业的健康发展提供技术保障。

交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification，CPA)是由杭州优思达公司发明的一种新型的恒温核酸扩增方法(发明专利授权号：ZL 200810134583.1)，针对靶基因设计特异性引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)在恒温条件下反应一小时即可完成核酸扩增反应。通过标记特异性探针使其扩增产物可用一次性核酸检测装置进行检测，有效防止扩增产物带来的污染，减少假阳性结果。该技术作为一种基础方法，在应用到具体检测对象时，需要针对检测对象基因结构的特点，针对性地选择靶基因及扩增位点，合理设计交叉引物、检测引物及剥离引物以提高方法的特异性与灵敏度，并且优化各引物浓度比例以及反应体系中其他物质的浓度，获得最佳反应条件，进而才能获得较好的检测效果。本发明将该技术应用到GSIV的检测中，根据GSIV的特点进行方法的优化，建立了GSIV的CPA检测方法。本方法通过在引物设计环节进行改进以及对反应体系部分物质浓度进行优化，以提高方法的特异性和检测结果的准确性。本发明具有很高的特异性和灵敏度，快速、简便，结果判定直观、客观、准确可靠，适合大鲵虹彩病毒病的现场快速检测。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物，根据GenBank公布的GSIV毒株的主衣壳蛋白基因(MCP)编码序列(JN516141)设计CPA引物，同时对部分碱基进行改变以避免引物间错配进而提高反应的特异性，利用CPA技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对大鲵虹彩病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明的另一个目的在于提供了一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物在制备大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒中的应用。利用本发明提供的试剂盒，仅需一个金属浴或水浴锅即可在1.5小时内准确检测出样品中的GSIV，能检测GSIV感染的病鲵组织，能检测GSIV感染的细胞培养物(如EPC细胞)，特别适用于GSIV的现场快速检测。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物：

CPF:5’-GCCTCAGCGAACAGCGTGGCACCACCTCTACTCCTAT-3’

CPR:5’-GGCACCACCTCTACTCCTATGCCTCAGCGAACAGCGT-3’

DF:5’-(Biotin)CCTCAGCCTACAGCACCC-3’

DR:5’-(FITC)CTGGCGTTGGTCAGTCCG-3’

DPF:5’-TCCATCCCAGTCAGCA-3’

DPR:5’-TACCCAGAGTCGTCACCT-3’。

一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物在制备大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒中的应用，所述的试剂盒包括：Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶；dNTPs；MgSO₄；Betaine；交叉引物CPF、CPR；检测引物DF、DR；剥离引物DPF、DPR；核酸检测试纸条。

CPF:5’-GCCTCAGCGAACAGCGTGGCACCACCTCTACTCCTAT-3’

CPR:5’-GGCACCACCTCTACTCCTATGCCTCAGCGAACAGCGT-3’

DF:5’-(Biotin)CCTCAGCCTACAGCACCC-3’

DR:5’-(FITC)CTGGCGTTGGTCAGTCCG-3’

DPF:5’-TCCATCCCAGTCAGCA-3’

DPR:5’-TACCCAGAGTCGTCACCT-3’。

利用大鲵虹彩病毒CPA检测引物或试剂盒非诊断性检测大鲵虹彩病毒的方法：

1、病毒DNA的获取：

2、CPA扩增：

采用25μL反应体系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，检测引物DF、DR各0.2～1.0μM，剥离引物DPF、DPR各0.2～1.0μM，MgSO₄4～12mM，dNTPs 0.2～1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至25μL；55～65℃的温度范围，反应30～90分钟后，80℃灭活2分钟。

3、检测结果判定，可以用下述二种方法之一进行结果的判定：

1)取扩增产物，用2.0％(W/V)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示CPA特征性梯状条带，则结果为阳性；无任何条带，则结果为阴性。

2)取扩增产物，用核酸检测试纸条检测，仅在质控区C出现一条红线，表示样品检测结果阴性。出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品检测结果阳性。在质控区C无红色线条出现，表明核酸检测试纸条失效，检测结果无效。

以上所述的步骤，步骤2的CPA扩增中，其体系优选为：

采用25μL反应体系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，检测引物DF、DR各0.4μM，剥离引物DPF、DPR各0.4μM，MgSO₄8.0mM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至25μL；63℃反应60分钟后，80℃灭活2分钟。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、特异性好，能有效检测出大鲵虹彩病毒；

2、快速高效，检测时间约1.5小时，非常适用于GSIV的现场快速检测；

3、不依赖昂贵的仪器设备和专业检测人员，检测成本低；

4、检测结果判定简单、客观、直观。

5.灵敏度高，可检测至10copies/μL的GSIV。

具体实施方式

下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均已公开或来源于商业渠道。

实施例1：

一种大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒，包括：

Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶(NEB)；dNTPs；MgSO₄；Betaine(Sigma)；交叉引物CPF、CPR；检测引物DF、DR；剥离引物DPF、DPR；核酸检测试纸条(杭州优思达公司)。

CPF:5’-GCCTCAGCGAACAGCGTGGCACCACCTCTACTCCTAT-3’

CPR:5’-GGCACCACCTCTACTCCTATGCCTCAGCGAACAGCGT-3’

DF:5’-(Biotin)CCTCAGCCTACAGCACCC-3’

DR:5’-(FITC)CTGGCGTTGGTCAGTCCG-3’

DPF:5’-TCCATCCCAGTCAGCA-3’

DPR:5’-TACCCAGAGTCGTCACCT-3’。

实施例2：

一种大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒中不同引物浓度及比例的优化：

一、取待检样品提取病毒DNA：

取感染GSIV(中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO:V201134)的病鲵脾、肾组织匀浆液300μL，用试剂或Viral DNA Kit试剂盒，按照说明书提取DNA，最后溶于30μL灭菌水，-20℃保存备用。

二、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，在PCR管中加病毒DNA模板1μL，ReactionBuffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR，检测引物DF、DR，剥离引物DPF、DPR，MgSO₄8.0mM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，无核酸酶水补足至25μL。同时设置空白对照。

其中交叉引物(CPF、CPR)，检测引物(DF、DR)，剥离引物(DPF、DPR)采用不同的浓度比例：

1)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.2μM，DPF/R：0.2μM

2)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.4μM，DPF/R：0.4μM

3)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.6μM，DPF/R：0.6μM

4)CPF/R：1.0μM，DF/R：0.8μM，DPF/R：0.8μM

5)CPF/R：1.0μM，DF/R：1.0μM，DPF/R：1.0μM

三、CPA扩增的反应条件：

反应管于63℃温育60min，80℃灭活2min。

四、检测结果判定：

取5μL扩增产物，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示引物浓度组合2扩增效果最好，即：CPF/R：1.0μM，DF/R：0.4μM，DPF/R：0.4μM。

实施例3：

一种大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒中不同浓度的MgSO₄的优化：

一、取待检样品提取病毒DNA：

制备方法同实施例2。

二、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，在PCR管中加入病毒DNA模板1μL，ReactionBuffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.4μM，DPF/DPR 0.4μM，MgSO₄，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，无核酸酶水补足至25μL。同时设置空白对照。

其中MgSO₄的浓度分别为4.0、6.0、8.0、10.0、12.0mM。

三、CPA扩增的反应条件：

反应管于63℃温育60min，80℃灭活2min。

四、检测结果判定：

取5μL扩增产物，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示MgSO₄的浓度为8.0mM时效果最好。

实施例4：

一种大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒中不同浓度dNTPs的优化：

一、取待检样品提取病毒DNA：

制备方法同实施例2。

二、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，在PCR管中加病毒DNA模板1μL，Reaction Buffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.4μM，DPF/DPR 0.4μM，MgSO₄8.0mM，dNTPs，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，无核酸酶水补足至25μL。同时设置空白对照。

其中dNTPs的浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mM。

三、CPA扩增的反应条件：

反应管于63℃温育60min，80℃灭活2min。

四、检测结果判定：

取5μL扩增产物，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示dNTPs浓度为1.0mM时效果最好。

实施例5：

一种大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒中不同反应温度的优化：

一、取待检样品提取病毒DNA：

制备方法同实施例2。

二、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，在PCR管中加病毒DNA模板1μL，Reaction Buffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.4μM，DPF/DPR 0.4μM，MgSO₄8.0mM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，无核酸酶水补足至25μL。同时设置空白对照。

三、CPA扩增的反应条件：

反应管分别置于55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃温育60min后，80℃灭活2min。

四、检测结果判定：

取5μL扩增产物，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示反应温度为63℃时效果最好。

实施例6：

一种大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒的特异性：

1、取待检样品提取病毒DNA或细菌核酸：

GSIV感染的病鲵脾、肾组织匀浆液，鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)(徐进，曾令兵，杨德国，等.鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定[J].中国水产科学,2013,20(6):1303-1309)感染的病鱼鳃、脾、肾等组织匀浆液、锦鲤疱疹病毒(KHV)(朱霞,李新伟,王好,等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报,2011,33(5):340-343)感染的Koi-Fin细胞、鳗疱疹病毒(HVA)(Jakob E,Neuhaus H,Steinhagen D,et al.Monitoring of Herpesvirus anguillae(HVA)infections in European eel,Anguilla anguilla(L.),in northern Germany[J].JFish Dis,2009,32(6):557-561)感染的EPC细胞、白斑综合征病毒(WSSV)(徐进，范玉顶，周勇，等.常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒[J].淡水渔业，2008，38(6)：52－54.)感染的病虾组织匀浆液，于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清300μL，用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于30μL灭菌水，-20℃保存备用。

另外培养分离自大鲵的一种致病菌：嗜水气单胞菌(Ah)(孟彦，曾令兵，杨焱清，等.大鲵腹水病病原菌的分离与鉴定研究[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)，2009，37(3)：77－81.)常规细菌培养，直接以菌液(10⁹CFU/mL)作为模板检测。

2、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，CPF/R 1.0μM，DF/R 0.4μM，DPF/DPR 0.4μM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，MgSO₄8.0mM，模板DNA 1μL，无核酸酶水补足至25μL。

3、CPA扩增的反应条件：

反应管分别置于63℃温育60min后，80℃灭活2min。

4、检测结果判定：

用核酸检测试纸条检测，试纸条下端滴加5～8μL扩增产物，再加缓冲液(杭州优思达公司)3滴，3～5min后可用肉眼判读。核酸检测试纸条显示，针对GSIV设计的特异性CPA引物组能保证对GSIV的特异性检测，GSIV检测结果阳性，而CyHV-2、KHV、HVA、WSSV、Ah、空白对照(水)均为阴性。

实施例7：

一种大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒灵敏度：

1、GSIV Sph基因克隆及标准重组质粒构建：

提取GSIV病毒总DNA(制备方法同实施例2)，PCR扩增MCP基因(JN516141)全长序列，并克隆进pMD19-T质粒，构建GSIV MCP基因标准重组质粒。提取并纯化重组质粒，测定质粒浓度，计算质粒拷贝数，并用纯水将标准质粒浓度调整到10¹⁰copies/μL。灵敏度测定时，将标准质粒用纯水进行10倍梯度稀释，使质粒浓度范围为10⁹copies/μL～10⁰copies/μL，作为CPA反应的模板DNA。

2、CPA扩增的反应体系：

采用25μL反应体系，包括：Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，检测引物DF、DR各0.4μM，剥离引物DPF、DPR各0.4μM，MgSO₄8.0mM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至25μL。

3、CPA扩增的反应条件：

反应管于63℃温育60min，80℃灭活2min。

4、检测结果判定：

用核酸检测试纸条检测，试纸条下端滴加5～8μL扩增产物，再加缓冲液3滴，3～5min后可用肉眼判读。核酸检测试纸条显示最低能够检测到10copies/μL的GSIV。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物及应用

<130> 一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcctcagcga acagcgtggc accacctcta ctcctat 37

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggcaccacct ctactcctat gcctcagcga acagcgt 37

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cctcagccta cagcaccc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctggcgttgg tcagtccg 18

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tccatcccag tcagca 16

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tacccagagt cgtcacct 18

Claims

1.一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物：

CPF: 5’-GCCTCAGCGAACAGCGTGGCACCACCTCTACTCCTAT-3’

CPR: 5’-GGCACCACCTCTACTCCTATGCCTCAGCGAACAGCGT-3’

DF: 5’-(Biotin) CCTCAGCCTACAGCACCC-3’

DR: 5’-(FITC) CTGGCGTTGGTCAGTCCG-3’

DPF: 5’-TCCATCCCAGTCAGCA-3’

DPR: 5’-TACCCAGAGTCGTCACCT-3’。

2.权利要求1所述的大鲵虹彩病毒CPA检测引物在制备大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒，包括：

10×ThermoPol^®Reaction Buffer；Bst DNA 聚合酶；dNTPs；MgSO₄；Betaine；交叉引物CPF、CPR；检测引物DF、DR；剥离引物DPF、DPR；核酸检测试纸条；

CPF: 5’-GCCTCAGCGAACAGCGTGGCACCACCTCTACTCCTAT-3’

CPR: 5’-GGCACCACCTCTACTCCTATGCCTCAGCGAACAGCGT-3’

DF: 5’-(Biotin) CCTCAGCCTACAGCACCC-3’

DR: 5’-(FITC) CTGGCGTTGGTCAGTCCG-3’

DPF: 5’-TCCATCCCAGTCAGCA-3’

DPR: 5’-TACCCAGAGTCGTCACCT-3’。

4.利用权利要求1所述引物非诊断性检测大鲵虹彩病毒的方法：

1、病毒DNA的获取：

2、CPA扩增：

采用25μL反应体系，包括：10×ThermoPol^®Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，检测引物DF、DR各0.2~1.0μM，剥离引物DPF、DPR各0.2~1.0μM，MgSO₄4~12mM，dNTPs 0.2~1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至25μL；55~65℃的温度范围，反应30~90分钟后，80℃灭活2分钟；

1）取扩增产物，用2.0%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示CPA特征性梯状条带，则结果为阳性；无任何条带，则结果为阴性；

2）取扩增产物，用核酸检测试纸条检测，仅在质控区C出现一条红线，表示样品检测结果阴性；出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品检测结果阳性；在质控区C无红色线条出现，表明核酸检测试纸条失效，检测结果无效。

5.根据权利要求4所述的方法，步骤2的CPA扩增反应体系和反应条件为：

采用25μL反应体系，包括：10×ThermoPol^®Reaction Buffer 2.5μL，交叉引物CPF、CPR各1.0μM，检测引物DF、DR各0.4μM，剥离引物DPF、DPR各0.4μM，MgSO₄8.0mM，dNTPs 1.0mM，Betaine 0.6M，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至25μL；63℃反应60分钟后，80℃灭活2分钟。