CN104651519A - 一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

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潘艳
李军
冯世文
彭昊
陈泽祥
陶立
胡帅
杨威
钟舒红
谢宇舟
禤雄标
马春霞
柳锋
谢永平
许力干
韦志锋
秦若甫
兰美益
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Abstract

本发明公开一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和牛支原体DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3与B3和内引物FIP与BIP。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的LAMP检测方法可实时监测反应并且定量检测出牛支原体的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测牛支原体带来便利。

Description

一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用
技术领域
 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测牛支原体的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
背景技术
牛支原体( My cop lasma bovis) 是感染牛的一种重要的致病性病原体，1961年Hale 在美国首次从患乳腺炎的牛乳中分离到该病原，1976年首次报道与牛呼吸系统疾病有关。目前已证实牛支原体除导致牛肺炎、乳腺炎外，还可导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病。
该病在世界范围内存在，欧洲每年约有25%~33%的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，相当于每年损失1.44亿~1.92亿欧元，其中英国每年有190万头牛患牛支原体肺炎， 死亡达15.7万头。美国每年由于牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成损失达1.4亿美元，单个牛场最高感染率达70%。在我国，1983年黎济申首次报道从乳腺炎牛乳中牛分离到牛支原体，此后只有零星临床报道证实牛支原体导致奶牛乳腺炎。2008年以来，我国部分地区新从外地引进肉牛暴发了以坏死性肺炎为主要特征的传染性牛支原体肺炎疫情，发病率为50%~100%，病死率高达10%~50%，给我国养牛业造成了巨大的经济损失。
对牛支原体的准确、快速检测，有利于养殖场对牛支原体病做出正确的处理措施，以及有利于日常的防治。牛支原体的病原检测，病原分离是牛支原体确诊的“金标准”，但其分离鉴定难度大、灵敏度低、耗时、需要复杂的设备及培养条件。聚合酶链式反应（PCR）法等虽然特导性和敏感性都较高，但却需要昂贵的PCR仪、电泳槽等精密仪器，不适用于基层开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测牛支原体的方法，公开一种快速、实时定量的检测牛支原体环介导等温扩增试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和牛支原体DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）和内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）；
其中引物的序列分别为：
F3   AGGAGGAGAAAAAAGCCTAT
B3  GCTAAAACTGAAGCTTGCA
FIP  CGCCACTTAATGTATGTGGATATCTGGCCTTTTGGAAAGATTTGG
BIP  ACAATGGTTGTTGCTTTAAAACCACAGTTGGATCTAAAGCAGTAG；
所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
所述的牛支原体DNA模板，是使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取的牛支原体培养物或疑似感染牛支原体的临床病变肺组织的基因组DNA。
所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 25-60mM、KCL 15-40mM、MgSO4 10-20mM、(NH4)2SO4 15-25mM、Tween20 0.3-0.8℅、Betaine 1.5-4M 和dNTPs 2.5-5mM，其配制方法在pH为8.5左右条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测疑似牛支原体或检测疑似感染牛支原体的临床病变肺组织是否存在牛支原体，具体检测步骤包括：
（1）LAMP引物的设计与合成
（2）牛支原体DNA模板的提取
（3）LAMP反应体系建立
（4）LAMP检测方法。
所述的LAMP反应体系建立以25μL计，
2×反应缓冲液                        12.5 μL
Bst DNA聚合酶                      1 μL
FIP                                 40 pmol
BIP                                  40 pmol
F3                                   5 pmol
B3                                   5 pmol
牛支原体DNA                         2 μL
超纯水                                补足25 μL。
所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
所述的LAMP检测方法采用Loopamp LA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控。
本发明的实质性特点和显著的进步是：
1）特异性强
本发明的LAMP方法特异性检测出牛支原体，所检测的阴性对照支原体、细菌和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。
2）灵敏度高
普通PCR检测方法的灵敏度为2.29×10-3 ng/μL，而使用本发明的LAMP检测方法，检测限约为2.29×10-5 ng/μL，是普通PCR的100倍。
3）迅速获得结果
普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线显像分析来判读结果，从基因组DNA提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在25分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便--，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像或者开盖加入荧光染料进行来判读结果，从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
4）不造成污染
目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖，有效的避免污染试验环境。此外，本发明的LAMP检测方法在结果判读上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
5）可实时定量
本发明利用Tubidimeter real-time LA-320 浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的牛支原体拷贝数，达到定量检测产物的目的。
附图说明
图1是本发明LAMP方法特异性检测结果；其中1：牛支原体；2：绵羊肺炎支原体；3：中度无胆甾原体；4：丝状支原体；5：大肠杆菌；6：2型链球菌；7：沙门氏菌；8：波氏杆菌；9：空白对照（水）。牛支原体反应管出现浊度的上升曲线，为阳性结果，3 株对照支原体反应管、4株对照细菌反应管和水对照反应管均无扩增，为阴性结果。
图2和图3是分别使用本发明LAMP方法和普通PCR方法进行的牛支原体敏感性检测的结果，其中1：2.29×102 ng/μL；2：2.29×101 ng/μL；3：2.29×100ng/μL；4：2.29×10-1ng/μL； 5：2.29×10-2ng/μL；6：2.29×10-3ng/μL；7：2.29×10-4ng/μL；8：2.29×10-5ng/μL；9：2.29×10-6 ng/μL；
10：2.29×10-7 ng/μL；11：water。牛支原体原始DNA的起始浓度为2.29×102 ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的LAMP法检测限约为2.29×10-5ng/μL，而普通PCR方法检测限约为2.29×10-3ng/μL。
图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以牛支原体基因组DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
图5是本发明牛支原体定量标准曲线；利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的牛支原体拷贝数。
具体实施方式
1、材料的准备
牛支原体、绵羊肺炎支原体、中度无胆甾原体、丝状支原体、大肠杆菌、链球菌2型、沙门氏菌和波氏杆菌，为广西兽医研究所分离鉴定和保存。LAMP DNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204；细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0552。
2 、LAMP引物的设计与合成
根据GenBank 中的牛支原体OPPD/F基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4 软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3 为外引物，FIP、BIP 为内引物，其中 F3、B3为牛支原体PCR检测引物，其中
F3  AGGAGGAGAAAAAAGCCTAT
B3 GCTAAAACTGAAGCTTGCA
FIP        CGCCACTTAATGTATGTGGATATCTGGCCTTTTGGAAAGATTTGG
BIP ACAATGGTTGTTGCTTTAAAACCACAGTTGGATCTAAAGCAGTAG
3、细菌基因组DNA提取
使用康为世纪生物科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒，提取牛支原体DNA或者疑似牛支原体感染的肺组织的基因组DNA，以及对照菌株的基因组DNA。
4、LAMP反应体系建立
按照试剂盒说明书，按25μL体系配置：
 2×反应缓冲液                        12.5 μL
Bst DNA聚合酶                      1 μL
FIP                                 40 pmol
BIP                                  40 pmol
F3                                   5 pmol
B3                                   5 pmol
牛支原体DNA                         2 μL
超纯水                                补足25 μL
 LAMP反应在以实时浊度仪( LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以63℃做为反应温度。
5、LAMP检测方法
1）特异性检测
使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取牛支原体、绵羊肺炎支原体、中度无胆甾原体、丝状支原体、大肠杆菌、2型链球菌、沙门氏菌和波氏杆菌的基因组DNA，作为LAMP反应的模板，进行各LAMP扩增，同时以水作为空白对照，检验LAMP方法的特异性。
2）敏感性检测
提取的牛支原体基因组DNA，测定其浓度，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释成10个稀释度，以各DNA稀释度作为模板，进行本发明的LAMP方法扩增和常规PCR扩增，对比本发明的LAMP方法和普通PCR对检测牛支原体的敏感性。
3）荧光可视化检测
根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应60分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。
实施例1 LAMP检测方法的特异性结果
对1株牛支原体、3 株对照支原体、4株对照细菌和水对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，牛支原体反应管在20 分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，3 株对照支原体反应管、4株对照细菌反应管和水对照反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。
实施例2 LAMP检测方法的敏感性结果
牛支原体原始DNA的起始浓度为2.29×102 ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行LAMP和PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的LAMP法检测限约为2.29×10-5ng/μL，而常规PCR 法检测限为2.29×10-3ng/μL。
实施例3 LAMP检测方法的荧光可视化检测结果
根据浊度仪监控优化的条件，反应器加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为以牛支原体基因组DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，建立的LAMP方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃ 60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
实施例4牛支原体定量标准曲线的绘制
以牛支原体DNA为模板，以本LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认后，测定重组质粒pMD18-T-oppD的起始浓度，作为标准样品，用RNA-Free Water进行连续10倍倍比稀释8个稀释度，取各稀释度2 μL作为模板进行LAMP扩增，
设置对照：浓度为3.685×101 ng/μL、3.685×100 ng/μL、3.685×10-1 ng/μL、3.685×10-2 ng/μL、3.685×10-3ng/μL、3.685×10-4 ng/μL、3.685×10-5 ng/μL、3.685×10-6 ng/μL、3.685×10-7 ng/μL和3.685×10-8 ng/μL的重组质粒pMD18-T-oppD标准样品各一个，因为样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=0.2379x-8.5486，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0.9993，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10-y，再乘以基数3.685，即为3.685x10-y ng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL=（6.02 x 1023 x (ng/ul x 10-9)） / (DNA length x 660)，DNA length为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+220=2913 bp，将其换算成拷贝数（copies/μL）：6.02 x 1023 x（3.685x10-y x 10-9）/ (2913 x 660)，简化之后为：1.15 x 109 x 10-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为35分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于-0.2221，则浓度为100.2221，再乘以基数3.685，即为该试验样品的浓度3.685×100.2221ng/μL，则其拷贝数为：3.13 x 108 x 3.685 x100.2221=1.15 x 109.2221copies/μL，从而达到定量的效果。
表1
时间（min） 31.7 35.7 40.5 44.4 48.4 52.7
标准值（-LOG） -1 0 1 2 3 4

Claims (8)

1.一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和牛支原体DNA模板，所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）和内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）；
其中引物的序列分别为：
F3  AGGAGGAGAAAAAAGCCTAT
B3  GCTAAAACTGAAGCTTGCA
FIP  CGCCACTTAATGTATGTGGATATCTGGCCTTTTGGAAAGATTTGG
BIP  ACAATGGTTGTTGCTTTAAAACCACAGTTGGATCTAAAGCAGTAG；
所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
2.根据权利要求1所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的牛支原体DNA模板，是使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取的牛支原体培养物或疑似感染牛支原体的临床病变肺组织的基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
4.根据权利要求1所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 25-60mM、KCL 15-40mM、MgSO4 10-20mM、(NH4)2SO4 15-25mM、Tween20 0.3-0.8℅、Betaine 1.5-4M 和dNTPs 2.5-5mM。
5.一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，用于检测疑似牛支原体或检测疑似感染牛支原体的临床病变肺组织是否存在牛支原体，具体检测步骤包括：
（1）LAMP引物的设计与合成
（2）牛支原体DNA模板的提取
（3）LAMP反应体系建立
（4）LAMP检测方法。
6.根据权利要求5所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP反应体系建立以25μL计，
2×反应缓冲液                        12.5 μL
Bst DNA聚合酶                      1 μL
FIP                                 40 pmol
BIP                                  40 pmol
F3                                   5 pmol
B3                                   5 pmol
牛支原体DNA                         2 μL
超纯水                                补足25 μL。
7.根据权利要求5所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
8.根据权利要求5所述的牛支原体环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
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