CN103436626B - 一种鸡常见食源性细菌四重荧光pcr检测试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒及使用方法，试剂盒包含了荧光PCR反应液以及产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌的标准品，其中荧光PCR反应液含有Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTPs、四对细菌的特异性引物和相应的四种荧光探针。本发明运用四重荧光PCR，能快速、准确地检测产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和空肠弯曲杆菌4种鸡携带的主要食源性病原菌，可用于细菌的鉴定、疾病的诊断和流行病学调查。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒，还涉及一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒的使用方法。
背景技术
产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌是鸡携带的4种最常见的食源性致病细菌，它们不仅严重危害我国养禽业，而且通过食品污染感染人类，给人类健康造成威胁。
产气荚膜梭菌为人畜共患病病原，也是食源性病原菌。鸡群为产气荚膜梭菌的主要宿主之一，产气荚膜梭菌在鸡体内为条件性致病菌，可引起鸡坏死性肠炎，也有很多带菌不发病的情况。人类误食该菌污染的鸡肉制品等，可引起食物中毒。产气荚膜梭菌是引起人食物中毒和气肿疽的主要病原体。
沙门氏菌是一种常见的人畜共患病病原，该菌不仅能引起鸡白痢、禽伤寒和禽副伤寒等禽类疾病，危害养禽业，还能够感染人类，引起胃肠炎、伤寒、败血症及肠外灶性感染等多种疾病。据统计，沙门氏菌引起的食物中毒常列世界各国细菌性食物中毒榜首，我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。其中沙门氏菌感染禽是经食物链传染给人类的一个重要中介。
大肠杆菌O157:H7感染是一种食源性疾病，该菌可从鸡肉、牛肉、奶牛或奶制品、蔬菜、饮料及水中分离到，其中鸡群也是该菌的宿主之一。该菌为一种肠道出血性大肠杆菌，是食物中毒的原因之一。感染者通常发生出血性腹泻，尤其在年轻儿童和年长者中，有时导致肾衰竭。世界各地多次爆发大肠杆菌O157:H7感染，严重危害了公共卫生安全。
空肠弯曲菌是一种食源性人畜共患病病原菌，其中家禽特别是鸡群为空肠弯曲杆菌的主要宿主之一，通常成年鸡感染空肠弯曲杆菌无明显症状，然而食入空肠弯曲杆菌污染的鸡肉制品等，极易引起人类感染，导致急性肠胃炎，随后还可以引起自身免疫性并发症，如格巴氏综合征和关节炎。空肠弯曲菌也是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因之一。
鸡群是以上4种细菌的主要宿主之一，然而这些细菌通常被鸡携带却未表现出对鸡的致病性，或无明显的病变，容易被被养殖者忽视，但是这些病原菌一旦污染鸡肉等食品，则会引起食品安全问题。世界各国已对食品安全高度重视，对鸡肉制品等食品中微生物携带提出了明确的要求，从养殖开始控制与清除这些食源性细菌是避免食品污染的关键。因此迫切需要一种可同时快速、准确地检测鸡群或鸡肉制品中多种食源性致病菌的检测方法。目前实验室的诊断方法主要是依靠细菌的分离鉴定，但是该方法检测时间长、操作繁琐，也难以大批量进行。目前也有针对单个病原建立的PCR等检测方法，但是尚未有能系统检测鸡或鸡肉制品中多种食源性致病菌的方法与标准。实时荧光PCR快速、高效、敏感性好、特异性强，而且可以同时进行多种病原菌的检测，已成为病原菌检测的一种重要的方法。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒由荧光PCR反应液、阳性对照（产气荚膜梭菌标准品、沙门氏菌标准品、大肠杆菌O157:H7标准品和空肠弯曲杆菌标准品）以及阴性对照品组成。以往在家禽中检测病原菌多通过细菌的分离鉴定或运用针对单个菌的PCR检测，本检测试剂盒针对鸡源最常见的4种食源性细菌，设计并筛选出互不干扰的4对检测引物与4条探针，4种鸡主要食源性细菌检测在一个反应中完成，更为高效，且敏感性好，特异性强，检测下限达到10cfu。
本发明还有一个目的是在于提供了一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，方法简单，快速，所有检测步骤可在2个小时内完成。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒，含有以下成分：
荧光PCR反应液：Taq DNA聚合酶、不含Mg2+的PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTPs、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌这4种细菌的特异性引物和相应的4种荧光探针。试剂盒中包含4对引物和4条探针序列如下：
表1特异性引物序列表
表2特异性探针序列表
阳性对照：为产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌标准品，或产气荚膜梭菌标准品为产气荚膜梭菌cpa基因阳性质粒、沙门氏菌标准品为沙门氏菌invA基因阳性质粒、大肠杆菌O157:H7标准品为大肠杆菌O157:H7rfbB基因阳性质粒和空肠弯曲杆菌标准品为空肠弯曲噶杆菌ccoN基因阳性质粒。
阴性对照：为灭菌的无酶双蒸水。
一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：
1、样品的处理与DNA模板的提取：
肠道是以上4种致病菌的主要寄生部位，活禽取样主要通过采集肛门棉拭子，死禽可取肠道内容物，肉制品可直接取小块组织。所取样品使用德国QIAGEN公司QIAxtractor高通量核酸纯化工作站提取DNA模板，也可使用其它DNA提取试剂盒提取，具体步骤参照说明书，取5μl作为待测样品。每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。
2、反应体系与反应参数：
反应体系如下：
荧光PCR反应在多通道荧光定量PCR仪上进行，选择荧光信号FAM、TAMRA、ROX和HEX，（分别检测产气荚膜梭菌—FAM，沙门氏菌—TAMRA，大肠杆菌O157:H7—ROX，空肠弯曲杆菌—HEX）反应参数为：95℃10min，然后95℃10sec，60℃45sec，进行45个循环，其中在60℃进行四重荧光检测。阈值设置为阈值线刚好超过正常阴性样品的最高点。
3、结果的判断：
根据荧光定量各探针的Ct值（threshold cycle，每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）以及扩增曲线判断结果。
（1）质控标准:
阴性对照：无Ct值，无扩增曲线
阳性对照：Ct值≤30，扩增曲线明显呈对数增长。
如果阴性对照或者阳性对照有一项不符合标准则本次检测无效。
（2）判定结果：
4种探针均无Ct值、无扩增曲线的样本为检测结果阴性；1种或者几种探针Ct值≤35的样本，检测结果则为各自探针对应细菌的阳性，表示检测样本含有阳性结果探针对应的靶细菌；Ct值在35～40之间为灰值区域，重做后Ct值＜37且有扩增曲线的为阳性，其余判断为阴性。
标准曲线显示DNA拷贝数在10～106cfu之间线性关系良好，因此根据实验获得的标准曲线，在10～106cfu范围内也可计算出待测样本中的细菌含量。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
现有技术以细菌分离鉴定为主，部分菌株建立有PCR检测方法，但是针对鸡或鸡肉制品中多种食源性致病菌，目前没有能快速、灵敏且系统地检测方法与标准。本发明运用Taqman探针法多重实时荧光定量PCR技术，针对鸡源常见的4种严重危害人类健康的食源性细菌（产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌）开发研制了四重荧光PCR检测试剂盒。该发明通过一个PCR反应，可从样品中同时检测以上4种细菌，检测反应灵明度高，特异性强，检测下限可达10CFU/反应体系，且检测过程快速，高效，适合进行大批量检测。本发明提供的试剂盒可用于鸡等活禽肛门拭子的检测，可在不对检测动物造成伤害的情况下进行大量样本的临床检测，有利于临床的推广。本试剂盒也可用于肉制品加工过程中的细菌污染检测。该试剂盒为养殖业以及食品卫生中以上四种细菌的检测与防控提供了工具与方法。
附图说明：
图1为一种四种菌株混合同时进行四重荧光PCR检测的示意图。
A为产气荚膜梭菌、B为沙门氏菌、C为大肠杆菌O157:H7、D为空肠弯曲杆菌。
图2为一种利用本发明试剂盒及其检测方法检测产气荚膜梭菌扩增曲线图。
图3为一种产气荚膜梭菌标准品标准曲线图。
系列1,2,3分别为3个平行重复
图4为一种利用本发明试剂盒及其检测方法检测沙门氏菌扩增曲线图。
图5为一种沙门氏菌标准品标准曲线图。
系列1,2,3分别为3个平行重复
图6为一种利用本发明试剂盒及其检测方法检测大肠杆菌O157:H7扩增曲线图。
图7为一种大肠杆菌O157:H7标准品标准曲线图。
系列1,2,3分别为3个平行重复
图8为一种利用本发明试剂盒及其检测方法检测空肠弯曲杆菌扩增曲线图。
图9为一种空肠弯曲杆菌标准品标准曲线图。
系列1,2,3分别为3个平行重复
具体实施方法
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：
鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒：
一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：不含Mg2+的荧光PCR反应液和产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌的标准品。其中荧光PCR反应液包括以下成分：rTaq DNA聚合酶（TaKaRa Ltd）、10×PCR反应缓冲液（TaKaRaLtd）、25mM Mg2+（TaKaRa Ltd）、10mM dNTPs（TaKaRa Ltd）、四对细菌的特异性引物（CP01、CP02、SE01、SE02、EC01、EC02、CJ01、CJ02）和相应的四种荧光探针（CPP、SEP、ECP、CJP）。
特异性引物序列包括：
CP01 5’TGTAAGGCGCTTATTTGTGCT3’
CP02 5’CCCTTGAGTTACAATCATAGCATG3’
SE01 5’GCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGC3’
SE02 5’CCAGTACGATATTCAGTGCGATC3’
EC01 5’TTCATGATGCTGTGGAAAACA3’
EC02 5’TGCTTGCAGAAGCCATATCA3’
CJ01 5’TACAGATTGGATTCCAGGACA3’
CJ02 5’CTATACCTGTGGTTTGGATCCA3’
特异性探针序列包括：
CPP5’[FAM]-ACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTGG-[BHQ1]3’
SEP5’[TAMRA]-TCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTAC-[BHQ2]3’
ECP5’[ROX]-TTCTCCGAATGTTGTTGTTTGGGGAAG-[BHQ2]3’
CJP5’[HEX]-TTCATGATGGAACATTAGGTTGGGTAGGAT-[BHQ2]3’
实施例2：
鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测方法的特异性与敏感性：
一、材料与方法
（1）菌株
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens CVCC43）、沙门氏菌（Salmonella enteritidisCVCC 3375）、大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli CICC21530）和空肠弯曲杆菌（Campylobacter.jejuni ATCC33291）标准菌株均购自中国微生物菌种保藏中心。
（2）引物与探针
从美国NCBI数据库下载产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌核酸序列，并进行序列比对，根据菌株保守且特异性强的基因序列区域设计，并筛选出各菌株之间互不干扰的特异性的引物和Taqman探针，序列如下：
特异性引物序列包括：
CP01 5’TGTAAGGCGCTTATTTGTGCT3’
CP02 5’CCCTTGAGTTACAATCATAGCATG3’
SE01 5’GCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGC3’
SE02 5’CCAGTACGATATTCAGTGCGATC3’
EC01 5’TTCATGATGCTGTGGAAAACA3’
EC02 5’TGCTTGCAGAAGCCATATCA3’
CJ01 5’TACAGATTGGATTCCAGGACA3’
CJ02 5’CTATACCTGTGGTTTGGATCCA3’
特异性探针序列包括：
CPP5’[FAM]-ACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTGG-[BHQ1]3’
SEP5’[TAMRA]-TCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTAC-[BHQ2]3’
ECP5’[ROX]-TTCTCCGAATGTTGTTGTTTGGGGAAG-[BHQ2]3’
CJP5’[HEX]-TTCATGATGGAACATTAGGTTGGGTAGGAT-[BHQ2]3’
引物和探针由上海生工生物工程股份有限公司合成。
（3）细菌计数与细菌DNA的提取
细菌计数采用活菌平板计数法，液体培养的细菌采用连续10倍梯度稀释后涂平板，通过计算平板上菌落数计算细菌的CFU，同时从10倍稀释到107倍稀释样本中，每个稀释梯度取样提取细菌DNA，用于荧光PCR检测。细菌DNA按照说明书步骤使用QIAxtractor高通量核酸纯化工作站提取DNA。取5μl作为PCR反应模板。
（4）荧光PCR反应条件
经过一系列优化后，反应总体积为50μl，体系如下：
在多通道荧光定量PCR仪上进行检测，选择荧光信号FAM、TAMRA、ROX和HEX，反应参数为：95℃10min，然后95℃10sec，60℃45sec，进行45个循环，其中在60℃进行四重荧光检测。阈值设置为阈值线刚好超过正常阴性样品的最高点，本实施例中各阈值的设置为：FAM——60.20，TAMRA——23.33，ROX——48.19，HEX——28.78。
（5）四重荧光PCR反应的特异性检测
选择产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌标准菌株和实验室分离菌株，副鸡嗜血杆菌、大肠杆菌O78、大肠杆菌DH5α、结肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌以及鸡肉组织，提取DNA，进行多重荧光PCR检测。
（6）四重荧光PCR反应的敏感性检测
将经过活菌计数的产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌分别倍比稀释后提取基因组DNA，平行进行荧光PCR反应，检测其敏感性和最低检测限，每个稀释梯度做3个检测重复。
二试验结果
（1）标准品四重荧光PCR的检测结果
在一个反应体系中同时加入产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌标准品样本，如图1所示，扩增出4种荧光的扩增曲线，A为产气荚膜梭菌、B为沙门氏菌、C为大肠杆菌O157:H7、D为空肠弯曲杆菌，显示一个反应体系可同时检测含4种菌株的样品，且互不干扰检测结果。
分别用荧光PCR检测产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌标准品，如图2、4、6、8所示，产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌标准品样本Ct值分别为22.99、23.41、19.51、21.83，且扩增曲线明显呈对数增长。
（2）四重荧光PCR反应的特异性
将前述13种菌株以及鸡肉组织运用本发明检测后，只有产气荚膜梭菌（FAM）、沙门氏菌（TAMRA）、大肠杆菌O157:H7（ROX）和空肠弯曲杆菌（HEX）有荧光信号，检测结果如下表：
表3四重荧光PCR特异性分析
（3）四重荧光PCR反应的敏感性
产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌标准菌株样品经过倍比稀释后进行荧光PCR扩增，绘制标准曲线，如图3、5、7、9所示，针对各种细菌的检测结果Ct值线性关系菌大于0.99，各重复之间重复性好，且4种细菌的最低检测限均能达到10cfu/反应。
实施例3：
四重荧光PCR对实验室送检鸡的检测
运用建立的四重荧光PCR方法对养殖户送检的22只白羽肉鸡进行了检测（可在2个小时内完成）。
一、细菌DNA模板的制备
用灭菌棉拭子取待检活鸡的肛门拭子，用200μl PBS稀释后，取100μl稀释物用QIAxtractor高通量核酸纯化工作站提取细菌DNA，用试剂盒中提供的产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌标准品作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。
二、按下列组成配制四重荧光PCR检测反应体系：
特异性引物序列包括：
CP01 5’TGTAAGGCGCTTATTTGTGCT3’
CP02 5’CCCTTGAGTTACAATCATAGCATG3’
SE01 5’GCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGC3’
SE02 5’CCAGTACGATATTCAGTGCGATC3’
EC01 5’TTCATGATGCTGTGGAAAACA3’
EC02 5’TGCTTGCAGAAGCCATATCA3’
CJ01 5’TACAGATTGGATTCCAGGACA3’
CJ02 5’CTATACCTGTGGTTTGGATCCA3’
特异性探针序列包括：
CPP5’[FAM]-ACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTGG-[BHQ1]3’
SEP5’[TAMRA]-TCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTAC-[BHQ2]3’
ECP5’[ROX]-TTCTCCGAATGTTGTTGTTTGGGGAAG-[BHQ2]3’
CJP5’[HEX]-TTCATGATGGAACATTAGGTTGGGTAGGAT-[BHQ2]3’
引物和探针由上海生工生物工程股份有限公司合成。
三、PCR反应条件：
在多通道荧光定量PCR仪上进行检测，选择荧光信号FAM、TAMRA、ROX、和HEX，反应参数为：95℃10min，然后95℃10sec，60℃45sec，进行45个循环，其中在60℃进行四重荧光检测。阈值设置为阈值线刚好超过正常阴性样品的最高点(FAM——35.20，TAMRA——24.31，ROX——44.15，HEX——28.38)。
四、检测结果：
检测结果显示共有8份样品为核酸阳性样品，其中产气荚膜梭菌核酸阳性1份，沙门氏菌核酸阳性1份，大肠杆菌O157:H7核酸阳性1份，空肠弯曲杆菌核酸阳性4份。细菌分离鉴定结果也证实了四重荧光PCR检测结果的正确性。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒及使用方法
<130> 一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒及使用方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.1
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<211> 21
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gctgctttct ctacttaaca gtgc 24
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ccagtacgat attcagtgcg atc 23
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ttcatgatgc tgtggaaaac a 21
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ttcatgatgg aacattaggt tgggtaggat 30
Claims (1)
1.一种鸡常见食源性细菌四重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：荧光PCR反应液、阳性对照，四对细菌的特异性引物：CP01、CP02、SE01、SE02、EC01、EC02、CJ01、CJ02和四种荧光探针：CPP、SEP、ECP、CJP；
所述的荧光PCR反应液为：rTaq DNA聚合酶、不含Mg2+的10×PCR反应缓冲液、25mM Mg2+和10mM dNTPs；
所述的阳性对照为：产气荚膜梭菌；沙门氏菌；大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌的标准品或产气荚膜梭菌cpa基因阳性质粒；沙门氏菌invA基因阳性质粒；大肠杆菌O157:H7rfbB基因阳性质粒和空肠弯曲杆菌ccoN基因阳性质粒；
所述的特异性引物为：
CP01：5’TGTAAGGCGCTTATTTGTGCT 3’
CP02：5’CCCTTGAGTTACAATCATAGCATG 3’
SE01：5’GCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGC 3’
SE02：5’CCAGTACGATATTCAGTGCGATC 3’
EC01：5’TTCATGATGCTGTGGAAAACA 3’
EC02：5’TGCTTGCAGAAGCCATATCA 3’
CJ01：5’TACAGATTGGATTCCAGGACA 3’
CJ02：5’CTATACCTGTGGTTTGGATCCA 3’
所述的特异性探针为：
CPP：5’FAM-ACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTGG-BHQ1 3’
SEP：5’TAMRA-TCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTAC-BHQ2 3’
ECP：5’ROX-TTCTCCGAATGTTGTTGTTTGGGGAAG-BHQ2 3’
CJP：5’HEX-TTCATGATGGAACATTAGGTTGGGTAGGAT-BHQ2 3’。
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Inventor after: Zhang Tengfei Inventor after: Wang Honglin Inventor after: Luo Ling Inventor after: Zhang Rongrong Inventor after: Luo Qingping Inventor after: Wen Guoyuan Inventor after: Shao Huabin Inventor after: Li Jinshuan Inventor after: Wang Hongcai Inventor before: Zhang Tengfei Inventor before: Wang Honglin Inventor before: Luo Ling Inventor before: Zhang Rongrong Inventor before: Luo Qingping Inventor before: Wen Guoyuan Inventor before: Shao Huabin |
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Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZHANG TENGFEI WANG HONGLIN LUO LING ZHANG RONGRONG LUO QINGPING WEN GUOYUAN SHAO HUABIN TO: ZHANG TENGFEI WANG HONGLIN LUO LING ZHANG RONGRONG LUO QINGPING WEN GUOYUAN SHAO HUABIN LI JINSHUAN WANG HONGCAI |
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Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZHANG TENGFEI WANG HONGLIN LUO LING ZHANG RONGRONG LUO QINGPING WEN GUOYUAN SHAO HUABIN LI JINSHUAN WANG HONGCAI TO: ZHANG TENGFEI WANG HONGLIN LUO LING ZHANG RONGRONG LUO QINGPING WEN GUOYUAN SHAO HUABIN LI JINQUAN WANG HONGCAI |
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Granted publication date: 20150916 Termination date: 20180913 |
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