CN101928773A - 采用荧光定量pcr技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物及其检测常见致病菌的方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物及其检测常见致病菌的方法和用途，提供了10对用于该方法中退火温度(50~60℃)不相差5℃的特异寡核苷酸引物序列，可同时对多种致病菌同时、快速、准确、高效地鉴定和定量检测。检测范围包括蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌O157、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌等。本发明还可用于疾病诊断、环境监测、水质与食品的监督与检测、食物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查、生物战剂检测等领域。方便快捷，准确，高效和应用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及一种致病菌检测技术领域，特别是涉及一种方便快捷、准确、高效和应用范围广的采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物及其检测常见致病菌的方法和用途。
背景技术
众所周知，致病菌检测在疾病诊断、环境监测、食品中毒检测、进出口食品检疫、科学研究等领域中有着重要的应用。传统的致病菌检验方法仍停留在分离培养、形态观察、生化鉴定和血清学分型水平，不仅花费的时间长，而且无法对难以培养的病原菌进行有效检测，且只能对有限的种类进行逐个的检测。随着科学技术的发展，一些新的技术可以实现对致病菌的快速检测或定量检测或同时高通量检测，如常规PCR技术、定量PCR技术、多重PCR、生物芯片技术等，它们均存在一定的不足。
常规PCR可以实现对微生物尤其是致病菌的快速检测，但不能对待检的致病菌进行定量，而且一次实验只能检测一种致病菌，效率低；定量PCR可以对待检致病菌进行定量检测，但一次实验只能检测一种待检致病菌，不能实现对致病菌的高通量（同时）检测；多重PCR和基因芯片虽然具备一次同时检测几种致病菌的能力，但这两种方法的最大不足就是不能对待检致病菌进行定量，此外，多重PCR对引物的要求较高，且有电泳阶段，容易发生交叉感染，引起假阳性的发生；基因芯片需要设计探针。
发明内容
本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种方便快捷、准确、高效和应用范围广的采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物及其检测常见致病菌的方法和用途。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题，所采取的技术方案是：一种采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物，包含以下各对引物的全部或部分引物的组合：
蜡样芽胞杆菌 Bc-gyrB-1 5’-GCTTCACCATCTTGTTTGG-3’
Bc-gyrB-2 5’-CGCCCATTATCCGTTACA-3’
阪崎肠杆菌 Es-ompA-1 5’- GCTGAGCGTAGGTGTTTCCT-3’
Es-ompA-2 5’-CAGGGTGAAGTGCTTGGTCT-3’
副溶血性弧菌 Vp-tdh-1 5’- AATGGTTGACATCCTACATGACTG-3’
Vp-tdh-2 5’- ACTTGACCTGATTTTACGAACACA -3’
肠出血性大肠杆菌O157 0157-eae-1 5’- TTACCAGCGATACCAAGAGC -3’
0157-eae-2 5’- CAACATGACCGATGACAAGG -3’
沙门氏菌 Sal-fim-1 5’- TACCAACCGGCAAGGCATAA -3’
Sal-fim-2 5’- GACACCGCCGTTTAAGAAATG -3’
单核细胞增生李斯特氏菌Lm-hly-1 5’- GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT -3’
Lm-hly-2 5’-CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3’
志贺氏菌 Sf-ipa-1 5’- CCGGGATAAAGTCAGAACTC -3’
Sf-ipa-2 5’- CTCCCGACACGCCATAGAAA -3’
空肠弯曲菌 Cj-htp-1 5’- CTGAATTTGATACCTTAAGTGCAGC -3’
Cj-htp-2 5’- AGGCACGCCTAAACCTATAGCT -3’
铜绿假单胞杆菌 Pa-gyr-1 5’- CAAGCCCTACAAGAAATCCG -3’
Pa-gyr-2 5’- TCCACCGAACCGAAGTTG -3’
肺炎克雷伯氏杆菌 Kp-pho-1 5’- TGCCCAGACCGATAACTTTA -3’
Kp-pho-2 5’- CTGTTTCTTCGCTTCACGG -3’
所述引物长度为15-30bp，碱基成分中G+C含量40%-60%，避免形成稳定的寡核苷酸引物二聚体和发夹结构，产物长度在100～200bp，所有寡核苷酸引物具有相似的Tm值。
所述引物长度优选为18-25bp。
所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，包括以下步骤：查询目标致病菌的特异保守基因，以此为靶基因设计寡核苷酸引物，使其退火温度在50～60℃之间；对检测样品进行处理，提取核酸模板；将模板分别加入装有不同特异寡核苷酸引物对的小管中，再加入相应的荧光定量PCR试剂；在同一轮荧光定量PCR循环下，使各寡核苷酸引物在各自的反应管中对样品进行同时、快速和定量检测。
所述各菌的引物的退火温度差在0-5℃之间。
所述荧光定量PCR条件为：预变性94℃ 、20秒，变性94℃、 5秒，退火60℃、31秒，40个循环。
所述的常见致病菌包括蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌O157、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、霍乱弧菌、小肠结肠耶尔森氏菌、创伤弧菌、肠球菌、变形杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、血溶性链球菌或产气荚膜梭菌的一种或几种的组合。
所述的检测样品源于血液、痰液的临床标本，水、食品、大气、土壤环境中的致病菌组分。
所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，在提供临床疾病数据、环境监测与评价、水质与食品的监督与检测、食物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查、生物战剂检测中的应用。
本发明具有的优点和积极效果是：采用特异寡核苷酸引物和荧光定量PCR技术在同一PCR循环中同时对多种致病菌进行鉴别和快速、定量检测，方便快捷，准确，高效和应用范围广，可广泛用于临床疾病诊断、环境监测与评价、水质与食品的监督与检测、食物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查、生物战剂检测。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，详细说明如下：
本发明采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物，包含以下各对引物的全部或部分引物的组合：
蜡样芽胞杆菌 Bc-gyrB-1 5’-GCTTCACCATCTTGTTTGG-3’
Bc-gyrB-2 5’-CGCCCATTATCCGTTACA-3’
阪崎肠杆菌 Es-ompA-1 5’- GCTGAGCGTAGGTGTTTCCT-3’
Es-ompA-2 5’-CAGGGTGAAGTGCTTGGTCT-3’
副溶血性弧菌 Vp-tdh-1 5’- AATGGTTGACATCCTACATGACTG-3’
Vp-tdh-2 5’- ACTTGACCTGATTTTACGAACACA -3’
肠出血性大肠杆菌O157 0157-eae-1 5’- TTACCAGCGATACCAAGAGC -3’
0157-eae-2 5’- CAACATGACCGATGACAAGG -3’
沙门氏菌 Sal-fim-1 5’- TACCAACCGGCAAGGCATAA -3’
Sal-fim-2 5’- GACACCGCCGTTTAAGAAATG -3’
单核细胞增生李斯特氏菌Lm-hly-1 5’- GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT -3’
Lm-hly-2 5’-CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3’
志贺氏菌 Sf-ipa-1 5’- CCGGGATAAAGTCAGAACTC -3’
Sf-ipa-2 5’- CTCCCGACACGCCATAGAAA -3’
空肠弯曲菌 Cj-htp-1 5’- CTGAATTTGATACCTTAAGTGCAGC -3’
Cj-htp-2 5’- AGGCACGCCTAAACCTATAGCT -3’
铜绿假单胞杆菌 Pa-gyr-1 5’- CAAGCCCTACAAGAAATCCG -3’
Pa-gyr-2 5’- TCCACCGAACCGAAGTTG -3’
肺炎克雷伯氏杆菌 Kp-pho-1 5’- TGCCCAGACCGATAACTTTA -3’
Kp-pho-2 5’- CTGTTTCTTCGCTTCACGG -3’
所述引物长度为15-30bp，碱基成分中G+C含量40%-60%，且上下游寡核苷酸引物序列GC含量的差异不要太大，避免形成稳定的寡核苷酸引物二聚体和发夹结构，产物长度在100～200bp，所有寡核苷酸引物具有相似的Tm值。
所述引物长度优选为18-25bp。
所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，包括以下步骤：查询目标致病菌的特异保守基因，以此为靶基因设计寡核苷酸引物，使其退火温度在50～60℃之间；对检测样品进行处理，提取核酸模板；将模板分别加入装有不同特异寡核苷酸引物对的小管中，再加入相应的荧光定量PCR试剂；在同一轮荧光定量PCR循环下，使各寡核苷酸引物在各自的反应管中对样品进行同时、快速和定量检测。
所述各菌的引物的退火温度差在0-5℃之间。
所述荧光定量PCR条件为：预变性94℃ 、20秒，变性94℃、 5秒，退火60℃、31秒，40个循环。
所述的常见致病菌包括蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌O157、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、霍乱弧菌、小肠结肠耶尔森氏菌、创伤弧菌、肠球菌、变形杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、血溶性链球菌或产气荚膜梭菌的一种或几种的组合。
所述的检测样品源于血液、痰液的临床标本，水、食品、大气、土壤环境中的致病菌组分。
所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，在提供临床疾病数据、环境监测与评价、水质与食品的监督与检测、食物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查、生物战剂检测中的应用。
下面对本发明进行具体说明：
本发明可以选用所设计的针对蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌O157、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌等的特异寡核苷酸引物全部或部分组合，然后，在同一轮PCR循环下，使各寡核苷酸引物在各自的反应管中对样品进行检测，以达到同时快速检测的目的，反应采用荧光定量PCR，即可同时实现快速、定量的效果。
为了达到上述发明目的，本发明需要以下步骤：首先根据检测的对象或背景资料确定目标致病菌，搜寻相应致病菌的能应用于检测目的的特异性、保守基因，然后，在基因数据库中寻找、比对序列，设计特异寡核苷酸引物之间的退火温度为（50~60℃）不相差5℃，之后，对样品进行处理，提取核酸模板，然后，将模板分别加入装有不同特异寡核苷酸引物对的小管中，再加入相应的荧光定量PCR试剂，在同一轮反应中对所确定的所有目标致病菌进行定量检测。可实现对样品中的多种不同致病菌进行同时定量检测。因为荧光定量PCR仪有96个反应孔，所以，可以对多个样品进行检测。如果样品中含有上述的致病菌，那么相应的引物管中就会给出荧光定量PCR扩增曲线，通过与标准曲线比较，即可实现准确定量。这样在较短的时间内，便可通过一次反应完成多种致病菌的定量检测，方便快捷。
所检测的致病菌包括常见的致病菌蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌O157、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌等，也可以采用该方法，根据需要添加相应的检测对象后，应用于检测血液、痰液等临床标本，水、食品、大气、土壤等环境中的致病菌组分以及致病菌生态评估。
特异寡核苷酸引物的设计：在本发明多种致病菌同时、快速、定量检测方法及其应用的体系中，特异寡核苷酸引物设计是整个体系中最为重要的因素；特异寡核苷酸引物设计的步骤如下：
(1)登录GenBank（http://ncbi.nlm.nih.gov/entrez），在核酸数据库中检索相关致病菌的目的基因序列，逐个核对后筛选出测序质量较好的几组序列；
(2)应用Primer Premier 5.0软件对目的基因序列进行引物设计，寡核苷酸引物设计原则包括：
a.长度一般为15-30bp，常用的是18-25bp。
b.碱基成分中G+C含量40%-60%，且上下游寡核苷酸引物序列GC含量的差异不要太大。
c.避免形成稳定的寡核苷酸引物二聚体和发夹结构。
d.产物长度在100～200bp比较理想。
e.所有寡核苷酸引物应具有相似的Tm值。
(3)根据以上的寡核苷酸引物设计原则，找出适于作为寡核苷酸引物的所有序列，将候选序列递交到GenBanK进行BLAST比较，筛选出特异性最好的进行合成。
以下结合实施例对本发明采用荧光定量PCR技术和特异寡核苷酸引物
检测常见致病菌的方法及应用做进一步描述。
实施例1 以同时检测水中沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌为例
Ⅰ.进行沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌特异性寡核苷酸引物的设计：引物设计是PCR技术中至关重要的一环，尤其是在本发明多种致病菌检测方法及应用的体系中，它更是整个体系中最为重要的因素；特异寡核苷酸引物设计的步骤如下：
⑴登录GenBank（http://ncbi.nlm.nih.gov/entrez），在核酸数据库中检索沙门氏菌的目的基因fimA序列和单核细胞增生李斯特氏菌的目的基因hly序列，逐个核对后筛选出测序质量较好的序列；
⑵应用Primer Premier 5.0软件对目的基因序列进行特异寡核苷酸引物设计；
⑶将设计的候选序列递交到GenBanK进行BLAST比较，筛选出特异性最好的进行合成，其中，沙门氏菌的引物为Sal-fim-1（5’- TACCAACCGGCAAGGCATAA -3’)和Sal-fim-2（5’- GACACCGCCGTTTAAGAAATG -3’),该对引物的PCR 产物长度为120bp；单核细胞增生李斯特氏菌的引物为Lm-hly-1（5’-GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT-3’)和Lm-hly-2（5’-CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3’),该对引物的PCR 产物长度为106bp。
Ⅱ. 沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌同时、快速和定量鉴定
⑴模板制备:采用煮沸法。取1mL水样（人为接种5×108CFU沙门氏菌和3×108CFU单核细胞增生李斯特氏菌）加入1.5mL Eppendorf管，室温12000r/min离心2min，弃上清，加100uL灭菌蒸馏水重悬沉淀，隔水煮沸10min，10000r/min离心2min，取上清作为模板。
⑵选择上述的全部或部分引物的组合，分别添加在各自的小管中，按下表添加个组份：
| 试剂 | 使用量 |
| 样品DNA模板 | 2uL |
| 引物（10 umol/L） | 各0.4uL |
| ROX Reference Dye | 0.4uL |
| SYBR Premix Ex Taq | 10uL |
| ddH2O | 6.8uL |
| 总体积 | 20uL |
⑶在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应并选择下述反应条件：
94℃ 预变性 20秒
94℃ 变性 5秒
60℃ 退火 31秒 40循环
⑷反应结束后，通过分析可知，1mL水样中含有沙门氏菌2×108CFU和108CFU单核细胞增生李斯特氏菌。
其优点是：采用特异寡核苷酸引物和荧光定量PCR技术在同一PCR循环中同时对多种致病菌进行鉴别和快速、定量检测，方便快捷，准确，高效和应用范围广，可广泛用于临床疾病诊断、环境监测与评价、水质与食品的监督与检测、食物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查、生物战剂检测。
实施例2 以同时检测食品中志贺氏菌和空肠弯曲菌为例
Ⅰ.进行志贺氏菌和空肠弯曲菌特异性寡核苷酸引物的设计：寡核苷酸引物设计的步骤如下：
⑴登录GenBank（http://ncbi.nlm.nih.gov/entrez），在核酸数据库中检索志贺氏菌的目的基因ipaH序列和空肠弯曲菌的目的基因htp序列，逐个核对后筛选出测序质量较好的序列；
⑵应用Primer Premier 5.0软件对目的基因序列进行特异引物设计；
⑶将设计的候选序列递交到GenBanK进行BLAST比较，筛选出特异性最好的进行合成，其中，志贺氏菌的引物为Sf-ipa-1(5’- CCGGGATAAAGTCAGAACTC-3’)和Sf-ipa-2(5’-CTCCCGACACGCCATAGAAA -3’),该对引物的PCR 产物长度为131bp；空肠弯曲菌的引物为Cj-htp-1(5’-CTGAATTTGATACCTTAAGTGCAGC-3’)和Cj-htp-2(5’- AGGCACGCCTAAACCTATAGCT-3’),该对引物的PCR 产物长度为86bp。
Ⅱ. 志贺氏菌和空肠弯曲菌同时、快速和定量鉴定
⑴模板制备:采用煮沸法。取25g待检熟制烤鸡肉（人为接种8×108CFU志贺氏菌和6×108CFU空肠弯曲菌）加入225mL无菌生理盐水中，均质后，室温2000r/min离心5min，取上清室温12000r/min离心2min，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤3次后，加100uL灭菌蒸馏水重悬，隔水煮沸10min，10000r/min离心2min，取上清作为模板。
⑵选择权利要求1所述的全部或部分引物的组合，分别添加在各自的小管中，按下表添加个组份：
| 试剂 | 使用量 |
| 样品DNA模板 | 2uL |
| 引物（10 umol/L） | 各0.4uL |
| ROX Reference Dye | 0.4uL |
| SYBR Premix Ex Taq | 10uL |
| ddH2O | 6.8uL |
| 总体积 | 20uL |
⑶在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应并选择下述反应条件：
94℃ 预变性 20秒
94℃ 变性 5秒
60℃ 退火 31秒 40循环
⑷反应结束后，通过分析可知，每g待检熟制烤鸡肉中含有沙门氏菌2×107CFU和107CFU单核细胞增生李斯特氏菌。
其优点与实施例1相同。
实施例3 以同时检测粪便中阪崎肠杆菌、肠出血性大肠杆菌O157为例
Ⅰ.进行阪崎肠杆菌、肠出血性大肠杆菌O157特异性引物的设计：引物设计的步骤如下：
⑴登录GenBank（http://ncbi.nlm.nih.gov/entrez），在核酸数据库中检索阪崎肠杆菌的目的基因ompA序列和肠出血性大肠杆菌O157的目的基因eae序列，逐个核对后筛选出测序质量较好的序列；
⑵应用Primer Premier 5.0软件对目的基因序列进行特异引物设计；
⑶将设计的候选序列递交到GenBank进行BLAST比较，筛选出特异性最好的进行合成,其中，阪崎肠杆菌的引物为Es-ompA-1（5’- GCTGAGCGTAGGTGTTTCCT-3’）和Es-ompA-2(5’-CAGGGTGAAGTGCTTGGTCT-3’ ),该对引物的PCR 产物长度为109bp；肠出血性大肠杆菌O157的引物为0157-eae-1 （5’- TTACCAGCGATACCAAGAGC -3’）和0157-eae-2 （5’- CAACATGACCGATGACAAGG -3’）,该对引物的PCR 产物长度为126bp。
Ⅱ. 阪崎肠杆菌、肠出血性大肠杆菌O157同时、快速和定量鉴定
⑴模板制备:采用煮沸法。取1g待检粪便（人为接种6×106CFU阪崎肠杆菌和5×106CFU肠出血性大肠杆菌O157）加入20mL无菌生理盐水中，均质后，室温2000r/min离心5min，取上清室温12000r/min离心2min，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤3次后，加100uL灭菌蒸馏水重悬，隔水煮沸10min，10000r/min离心2min，取上清作为模板。
⑵选择权利要求1所述的全部或部分引物的组合，分别添加在各自的小管中，按下表添加个组份：
| 试剂 | 使用量 |
| 样品DNA模板 | 2uL |
| 引物（10 umol/L） | 各0.4uL |
| ROX Reference Dye | 0.4uL |
| SYBR Premix Ex Taq | 10uL |
| ddH2O | 6.8uL |
| 总体积 | 20uL |
⑶在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应并选择下述反应条件：
94℃ 预变性 20秒
94℃ 变性 5秒
60℃ 退火 31秒 40循环
⑷反应结束后，通过分析可知，每g待检粪便中含有5×106CFU阪崎肠杆菌和5×108CFU 肠出血性大肠杆菌O157。
其优点与实施例1相同。
实施例4 以同时检测水中铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、蜡样芽胞杆菌和副溶血性弧菌为例
Ⅰ.进行铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、蜡样芽胞杆菌和副溶血性弧菌特异性引物的设计：引物设计的步骤如下：
⑴登录GenBank（http://ncbi.nlm.nih.gov/entrez），在核酸数据库中检索铜绿假单胞杆菌目的基因gyrA序列、蜡样芽胞杆菌目的基因gyrB序列和副溶血性弧菌、肺炎克雷伯氏杆菌的目的基因tdh序列和phoE序列，逐个核对后筛选出测序质量较好的序列；
⑵应用Primer Premier 5.0软件对目的基因序列进行特异引物设计；
⑶将设计的候选序列递交到GenBank进行BLAST比较，筛选出特异性最好的进行合成,其中，蜡样芽胞杆菌的引物为Bc-gyrB-1(5’-GCTTCACCATCTTGTTTGG-3’)和Bc-gyrB-2（5’-CGCCCATTATC CGTTACA-3’）,该对引物的PCR 产物长度为123bp；铜绿假单胞杆菌的引物为Pa-gyrA-1（5’-CAAGCCCTACAAGAAATCCG-3’）和Pa-gyrA-2（5’-TCCACCGAACCGAAGTTG-3’）,该对引物的PCR 产物长度为159bp；副溶血性弧菌的引物为Vp-tdh-1（5’- AATGGTTGACATCCTACATGACTG-3’）和Vp-tdh-2（5’- ACTTGACCTGATTTTACGAACACA-3’）， 该对引物的PCR 产物长度为112bp；肺炎克雷伯氏杆菌的引物为Kp-phoE-1（5’-TGCCCAGACCGATAACTTTA’)和Kp-phoE-2（5’-CTGTTTCTTCGCTTCACGG-3’）， 该对引物的PCR 产物长度为142bp。
Ⅱ. 铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、蜡样芽胞杆菌和副溶血性弧菌同时、快速和定量鉴定
⑴模板制备:采用煮沸法。取1mL水样（分别人为接种8×106CFU铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、蜡样芽胞杆菌和副溶血性弧菌）加入1.5mL Eppendorf管，室温12000r/min离心2min，弃上清，加100uL灭菌蒸馏水重悬沉淀，隔水煮沸10min，10000r/min离心2min，取上清作为模板。
⑵选择权利要求1所述的全部或部分引物的组合，分别添加在各自的小管中，按下表添加个组份：
| 试剂 | 使用量 |
| 样品DNA模板 | 2uL |
| 引物（10 umol/L） | 各0.4uL |
| ROX Reference Dye | 0.4uL |
| SYBR Premix Ex Taq | 10uL |
| ddH2O | 6.8uL |
| 总体积 | 20uL |
⑶在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应并选择下述反应条件：
94℃ 预变性 20秒
94℃ 变性 5秒
60℃ 退火 31秒 40循环
⑷反应结束后，通过分析可知，1mL水样中含有6×106CFU铜绿假单胞杆菌、6×106CFU肺炎克雷伯氏杆菌、7×106CFU蜡样芽胞杆菌和8×106CFU副溶血性弧菌。
其优点与实施例1相同。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
序列表（SEQUENCE LISTING）
<110> 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所
<120> 采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物及其检测常见致病菌的方法和用途
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
gcttcaccat cttgtttgg 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)
<400> 2
cgcccattat ccgttaca 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)
<400> 3
gctgagcgta ggtgtttcct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)
<400> 4
cagggtgaag tgcttggtct 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibro parahaemolyticus)
<400> 5
aatggttgac atcctacatg actg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 副溶血性弧菌(Vibro parahaemolyticus)
<400> 6
acttgacctg attttacgaa caca 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 肠出血性大肠杆菌O157 (EHEC 0157)
<400> 7
ttaccagcga taccaagagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 肠出血性大肠杆菌O157 (EHEC 0157)
<400> 8
caacatgacc gatgacaagg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella sp.)
<400> 9
taccaaccgg caaggcataa 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella sp.)
<400> 10
gacaccgccg tttaagaaat g 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)
<400> 11
gggaaatctg tctcaggtga tgt 23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)
<400> 12
cgatgatttg aacttcatct tttgc 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 志贺氏菌(Shigella flexneri)
<400> 13
ccgggataaa gtcagaactc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 志贺氏菌(Shigella flexneri)
<400> 14
ctcccgacac gccatagaaa 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)
<400> 15
ctgaatttga taccttaagt gcagc 25
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)
<400> 16
aggcacgcct aaacctatag ct 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 17
caagccctac aagaaatccg 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 18
tccaccgaac cgaagttg 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)
<400> 19
tgcccagacc gataacttta 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)
<400> 20
ctgtttcttc gcttcacgg 19
Claims (9)
1.一种采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物，其特征在于，包含以下各对引物的全部或部分引物的组合：
蜡样芽胞杆菌 Bc-gyrB-1 5’-GCTTCACCATCTTGTTTGG-3’
Bc-gyrB-2 5’-CGCCCATTATCCGTTACA-3’
阪崎肠杆菌 Es-ompA-1 5’- GCTGAGCGTAGGTGTTTCCT-3’
Es-ompA-2 5’-CAGGGTGAAGTGCTTGGTCT-3’
副溶血性弧菌 Vp-tdh-1 5’- AATGGTTGACATCCTACATGACTG-3’
Vp-tdh-2 5’- ACTTGACCTGATTTTACGAACACA -3’
肠出血性大肠杆菌O157 0157-eae-1 5’- TTACCAGCGATACCAAGAGC -3’
0157-eae-2 5’- CAACATGACCGATGACAAGG -3’
沙门氏菌 Sal-fim-1 5’- TACCAACCGGCAAGGCATAA -3’
Sal-fim-2 5’- GACACCGCCGTTTAAGAAATG -3’
单核细胞增生李斯特氏菌Lm-hly-1 5’- GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT -3’
Lm-hly-2 5’-CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3’
志贺氏菌 Sf-ipa-1 5’- CCGGGATAAAGTCAGAACTC -3’
Sf-ipa-2 5’- CTCCCGACACGCCATAGAAA -3’
空肠弯曲菌 Cj-htp-1 5’- CTGAATTTGATACCTTAAGTGCAGC -3’
Cj-htp-2 5’- AGGCACGCCTAAACCTATAGCT -3’
铜绿假单胞杆菌 Pa-gyr-1 5’- CAAGCCCTACAAGAAATCCG -3’
Pa-gyr-2 5’- TCCACCGAACCGAAGTTG -3’
肺炎克雷伯氏杆菌 Kp-pho-1 5’- TGCCCAGACCGATAACTTTA -3’
Kp-pho-2 5’- CTGTTTCTTCGCTTCACGG -3’。
2.根据权利要求1所述的采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物，其特征在于，所述引物长度为15-30bp，碱基成分中G+C含量40%-60%，避免形成稳定的寡核苷酸引物二聚体和发夹结构，产物长度在100～200bp，所有寡核苷酸引物具有相似的Tm值。
3.根据权利要求2所述的采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物，其特征在于，所述引物长度优选为18-25bp。
4.含有权利要求1所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：查询目标致病菌的特异保守基因，以此为靶基因设计寡核苷酸引物，,使其退火温度在50～60℃之间，对检测样品进行处理，提取核酸模板；将模板分别加入装有不同特异寡核苷酸引物对的小管中，再加入相应的荧光定量PCR试剂；在同一轮荧光定量PCR循环下，使各寡核苷酸引物在各自的反应管中对样品进行同时、快速和定量检测。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，其特征在于，所述各菌的引物的退火温度差在0-5℃之间。
6.根据权利要求4所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR条件为：预变性94℃ 、20秒，变性94℃、 5秒，退火60℃、31秒，40个循环。
7.根据权利要求4所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，其特征在于，所述的常见致病菌包括蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌O157、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、霍乱弧菌、小肠结肠耶尔森氏菌、创伤弧菌、肠球菌、变形杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、血溶性链球菌或产气荚膜梭菌的一种或几种的组合。
8.根据权利要求4所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，其特征在于，所述的检测样品源于血液、痰液的临床标本，水、食品、大气、土壤环境中的致病菌组分。
9.权利要求4所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，在提供临床疾病数据、环境监测与评价、水质与食品的监督与检测、食物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查、生物战剂检测中的应用。
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