CN111206110B

CN111206110B - 同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111206110B
Application number: CN202010218818.6A
Authority: CN
Inventors: 呼高伟; 付永前; 郑伟龙; 吴佳怡; 贾强
Original assignee: Taizhou University
Current assignee: Taizhou University
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2040-03-25
Also published as: CN111206110A

Abstract

本申请公开一种同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物组、试剂盒及方法，引物组包括：第一上游引物：5'‑ATGAAAAAGAGTACTCTGGC‑3'；第一下游引物：5'‑TCAGAACTGGTAGGTCATGCC‑3'；第二上游引物：5'‑CGCGGATCCATGCAAGATTCAATAGCGGTG‑3'；第二下游引物：5'‑CCGCTCGAGTTATTTAGCTTCGAAATAAAC‑3'。提取待测样品的DNA，以所提取的DNA为模板、采用所述的特异性引物组进行双重PCR，若扩增结果中同时在1053bp和1401bp处扩增出条带，则判定待测样品中含有肺炎克雷伯菌和金黄杆菌。本申请可同步PCR快速检测方法，该方法具有操作简单，快速，灵敏度高，操作简单，结果明辨，易推广。

Description

同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物、试剂盒及方法

技术领域

本申请属于微生物检测技术领域，具体涉及一种同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物、试剂盒及方法。

背景技术

肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌属(Klebsiella)，是分布广泛且危害严重的条件性致病菌之一，主要存在于人和动物的肠道、呼吸道、泌尿生殖道。当宿主免疫力低下或长期服用抗生素导致机体菌群失调的情况下，该菌可“趁虚而入”引发一系列疾病，如肺炎、脑膜炎、肝脓肿、泌尿系统炎症、伤口感染和全身败血症等。由于兽用抗生素的滥用导致该菌耐药率的显著上升，给该病的治疗带来了很大的挑战。国内研究人员先后从牛、梅花鹿、水貂、猪以及水生生物鲤鱼、对虾和水禽等动物体内分离到该菌，说明该菌的感染宿主之多，流行范围之广，其发病后可增加宿主对其他病原的易感性，严重时引起死亡。肺炎克雷伯杆菌为革兰氏阴性菌，呈单个或成双的短杆状，菌体两极染色，无鞭毛，无芽孢，但有较厚的荚膜。

金黄杆菌属(Chryseobacleriunz)是一个新近命名的菌属，无鞭毛，无芽孢，严格好氧生长的一类菌革兰氏阴性属，呈短小杆状。其广泛分布于水体、土壤和环境中，是一种常见的条件性致病菌。金黄杆菌属由原先的6个种和3个新种构成，包括脑膜炎败血性金黄杆菌(C.meningosepticum)、产吲哚金黄杆菌(C.indologenes),黏金黄杆菌(C.gleum)、大比目鱼金黄杆菌(C.balustinum)、大菱鲆金黄杆菌(C.scophthalmum)。金黄杆菌属既可导致外源性感染，又能因宿主免疫力低下和抗生素滥用等引起内源性感染。金黄杆菌虽为条件性致病菌但其感染宿主范围非常广泛包括人，畜禽和水动物，其可引起新生儿脑膜炎、败血症及呼吸道感染等疾病的发生，并且先后从发病的牛、鳜鱼、河蟹、鲟、乌鳢、中华鳖、鳗鲡体内分离到该致病菌。值得一提的是，金黄杆菌可引起棘胸蛙发生歪头病，致死率达到100％，说明金黄杆菌对棘胸蛙具有较强的致病性，可造成极大的经济损失。其可与多种条件性致病菌共存并造成混合感染，而且该菌对多种抗生素产生耐药，因此针对该菌的准确诊断、流行病学调查和防控工作显的十分重要。

作为“四大海产”之一的大黄鱼，因其肉质鲜嫩，营养丰富深受消费者喜爱，是我国近海重要的经济鱼类。近年来，随着集约化养殖程度的加快和人工养殖密度的增加，加上管理水平的参差不齐和渔药的不规范使用，引起大黄鱼抵抗力降低或者正常菌群的失调，导致易感染条件性致病菌肺炎克雷伯菌和金黄杆菌。病鱼表现出行动迟缓、不合群、进食障碍、腹部胀气、鳃丝溃烂，体表有出血性溃疡斑、患鱼抵抗力下降，从而增加对弧菌和刺激隐核虫等病原的易感性，当前临床多为混合感染病例，而且肺炎克雷伯菌和金黄杆菌为分布及其广泛的条件性致病菌。

传统的病原菌检测方法是病原菌的形态学观察和细菌的生理生化特征进行鉴定，存在耗时长和结果误判的可能。通过扩增16SrRNA，尚需要借助测序结果才能判定。针对水产动物细菌病原的血清学方法，首先需要对具备优良免疫原性的候选蛋白进行筛选，表达和纯化，免疫接种动物制备血清。该方法操作复杂，耗时长，成本高。荧光定量PCR需要对引物进行特殊的修饰，而且需要借助于昂贵的仪器来完成。

发明内容

本申请提供同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物、试剂盒及方法，实现大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的同步快速检测。

同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物组，包括：

第一上游引物：5'-ATGAAAAAGAGTACTCTGGC-3'；

第一下游引物：5'-TCAGAACTGGTAGGTCATGCC-3'；

第二上游引物：5'-CGCGGATCCATGCAAGATTCAATAGCGGTG-3'；

第二下游引物：5'-CCGCTCGAGTTATTTAGCTTCGAAATAAAC-3'。

本申请还提供一种同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的试剂盒，包括所述的特异性引物组。

关于试剂盒，以下还提供了若干可选方式，但并不作为对上述总体方案的额外限定，仅仅是进一步的增补或优选，在没有技术或逻辑矛盾的前提下，各可选方式可单独针对上述总体方案进行组合，还可以是多个可选方式之间进行组合。

可选的，第一上游引物和第一下游引物的浓度为10μM；第二上游引物和第二上游引物的浓度为10μM。

可选的，还包括：10×Buffer、MgCl₂、dNTP Mixture、Taq酶、灭菌的ddH₂O、阳性对照液和阴性对照液。

可选的，所述的10×Buffer为2μL；所述的MgCl₂为1μL 25mM的MgCl₂；所述的dNTPMixture为1μL，dNTP Mixture的浓度为10mM；所述Taq酶为1μL，Taq酶的酶活为5U/μL；所述的灭菌的ddH₂O为1mL。

可选的，10μM的第一上游引物、第一下游引物、第二上游引物和第二下游引物各0.5μL。

其中，10×Buffer为50mM Tris-Hcl和300mM KCl，pH＝8.0。

可选的，所述阳性对照液为提取的肺炎克雷伯菌基因组DNA提取的金黄杆菌基因组DNA；阴性对照液为灭菌水。

本申请还提供一种同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的方法，包括：提取待测样品的DNA，以所提取的DNA为模板、采用所述的特异性引物组进行双重PCR，若扩增结果中同时在1053bp和1401bp处扩增出条带，则判定待测样品中含有肺炎克雷伯菌和金黄杆菌。

可选的，所述双重PCR的体系为：

10×Buffer 2μL，25mM MgCl₂ 1μL，dNTP Mixture(10mM)1μL，10μM/L的两组上、下游引物各0.5μL；Taq酶(5U/μL)1μL，DNA模板1μL，灭菌水补齐至25μL。

“10μM的两组上、下游引物各0.5μL”是指“10μM的第一组上游引物0.5μL、10μM的第一下游引物0.5μL、10μM的第二组上游引物0.5μL、10μM的第二下游引物0.5μL”，即四个引物总加入量为2μL。

可选的，所述双重PCR的反应条件：95℃预变性3min，95℃变性15S，56℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环，72℃继续延伸5min，温度降至4℃，进行保存。

本申请目的在于提供针对编码肺炎克雷伯菌的外膜蛋白phoE基因和金黄杆菌外膜蛋白OmpA基因进行特异性检测引物的设计，可同步PCR快速检测方法，该方法具有操作简单，快速，灵敏度高，操作简单，结果明辨，易推广。

附图说明

图1为使用UniProt在线数据库中的Align软件对不同肺炎克雷伯菌参考株的phoE序列进行比对分析结果图。

图2为使用UniProt在线数据库中的Align软件对不同金黄杆菌参考株的OmpA序列进行比对分析结果图。

图3为测大黄鱼感染肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的引物特异性双重PCR结果图。

图4为金黄杆菌和肺炎克雷伯菌双重PCR方法灵敏度评价结果图。

图5为临床发病大黄鱼分离样品PCR检测结果图。

图6为图5中1053bp处条带的回收产物测序序列与NCBI中序列的比对分析结果图。

图7为图5中1401bp处条带的回收产物测序序列与NCBI中序列的比对分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

实施例1

(1)检测肺炎克雷伯菌特异性引物设计

肺炎克雷伯杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，而外膜蛋白是革兰氏阴性细菌细胞壁特有的结构，外膜蛋白约占细菌外膜全部成分的1/2。phoE(pore-forming outer membrane)基因是编码肺炎克雷伯杆菌外膜蛋白的核心基因，其具有较高的保守性，可用于不同宿主肺炎克雷伯杆菌的基因分型和检测。因肺炎克雷伯的感染宿主较广泛，而且其外膜基因在与不同宿主的免疫系统博弈过程中易发生突变。

因此，本申请根据NCBI已公布的phoE的氨基酸序列和借助UniProt线数据库中在线Align软件对不同参考株序列进行比对分析，设计检测感染大黄鱼的肺炎克雷伯菌的特异性引物。

序列比对结果如图1所示，阴影部分颜色深浅表示该区域的氨基酸保守性：颜色越深表示该区域氨基酸保守性越强，颜色越浅表示该区域氨基酸保守性越弱。星号表示比对结果中该位置氨基酸保守性极强，黑色实心圆表示该位置氨基酸保守性较强。经对不同参考株序列比对发现，phoE保守性较强，尤其是其N-端和C-端，因此根据phoE的两端序列使用primer 5进行设计引物，以扩增大黄鱼源肺炎克雷伯菌的phoE全长基因序列。

检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌的特异性引物具体为：

上游引物：5'-ATGAAAAAGAGTACTCTGGC-3'(SEQ ID NO：1)；

下游引物：5'-TCAGAACTGGTAGGTCATGCC-3'(SEQ ID NO：2)。

(2)检测金黄杆菌特异性引物设计

外膜蛋白(Outer membrane proteins,Omp)是革兰氏阴性菌外膜的主要结构，而外膜蛋白A(OmpA)是外膜蛋白的重要组成部分，也是金黄杆菌的毒力因子，该蛋白包含嵌入外膜的N端和暴露的C端的功能结构域。该蛋白具有维持细菌外膜结构稳定，参与黏附致病与免疫逃逸作用。外膜蛋白在细菌致病过程中最先

与宿主细胞受体接触，此过程发生博弈过程中易发生突变，而针对感染不同宿主的金黄杆菌的特异性引物对其精确的分子诊断工作至关重要。因此，本申请通过UniProt在线数据库已经公布的OmpA序列并使用在线Align软件对不同参考株序列进行比对分析。

比对分析结果如图2所示，阴影部分颜色深浅表示该区域的氨基酸保守性：颜色越深表示该区域氨基酸保守性越强，颜色越浅表示该区域氨基酸保守性越弱。星号表示比对结果中该位置氨基酸保守性极强，黑色实心圆表示该位置氨基酸保守性较强。比对结果发现OmpA蛋白序列比较保守，尤其N端保守性极强，其1-21位氨基酸为信号肽，删除其信号肽，根据NCBI中金黄杆菌参考株基因组(NZ_LMAI01000003.1)OmpA核酸序列进行设计引物，检测感染大黄鱼金黄杆菌的特异性引物。

检测大黄鱼源金黄杆菌的特异性引物具体为：

上游引物：5'-CGCGGATCCATGCAAGATTCAATAGCGGTG-3'(SEQ ID NO：3)；

下游引物：5'-CCGCTCGAGTTATTTAGCTTCGAAATAAAC-3'(SEQ ID NO：4)。

(3)细菌基因组DNA制备

提取肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、金黄杆菌、假单胞菌、柱状屈桡杆菌不同细菌的基因组DNA用于检测引物的特异性。方法采用上海生工生物工程有限公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒进行。

具体为：

1)取1mL培养14h后的菌液，室温下7,000rpm/min离心2min，弃培养基，收集菌体。加入400μL Buffer Digestion，移液器吹吸混匀。金属浴中，65℃作用1h，中间隔15min进行混匀1次。

2)加入200μL Buffer PB，立即上下颠倒混匀，-20℃冰箱中静置4min。

3)室温条件下，10,000rpm/min离心5min，小心地将上清转移到经灭菌的1.5mL离心管中。

4)加入550μL的异丙醇，颠倒7次使之充分混匀，室温静置3min。10,000rpm/min离心4min，弃上清。

5)加入1mL 75％乙醇，颠倒数次，静置1min，10,000rpm/min离心1min，弃上清。

6)重复75％乙醇漂洗一次；

7)打开离心管盖子，倒置7min。

8)得到的DNA用65μL TE Buffer溶解，-20℃保存备用。进行下一步PCR实验。

(4)双重PCR引物特异性的检测

1)双重PCR体系如下：10×Buffer 2μL，25mM MgCl₂ 1μL，dNTP Mixture(10mM)1μL,10μM的两组上、下游引物各0.5μL；Taq酶(5U/μL)1μL，步骤(3)中提取的DNA模板各1μL，灭菌水补齐至25μL。

2)PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性15S，56℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环，72℃继续延伸5min，温度降至4℃，进行保存。

3)PCR扩增产物的检测：取5μL PCR产物与1μL 6×Loading buffer进行混匀，加入置于1×TAE电泳缓冲液的1％琼脂糖凝胶上样孔中，进行电泳95V,时间50min。

4)结果判定

将电泳后的凝胶置于紫外凝胶成像分析仪中进行判定结果，对照核酸的标准分子量标记，如果在1053bp处扩增出条带说明该样品中有肺炎克雷伯菌，在1401bp处扩增出条带说明该样品中有金黄杆菌，同时在1053bp和1401bp处扩增出条带说明该样品中有肺炎克雷伯菌和金黄杆菌，反之，如果没有扩增出条带，说明该样品中没有肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的感染。

图3为检测大黄鱼感染肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的引物特异性双重PCR结果，其中，M:1kb DNA MarkerI(购自鼎国生物技术有限公司)；1:大黄鱼源肺炎克雷伯菌DNA；2：金黄杆菌DNA；3：大肠杆菌DNA；4：弧菌DNA；5：柱状屈桡杆菌DNA；6：金黄杆菌和肺炎克雷伯菌混合DNA；7：大肠杆菌和弧菌混合DNA；8：弧菌和柱状屈桡杆菌混合DNA；9：阴性对照；bp:碱基对；6000、4000、2500、2000、1500、1000、750、500为对应片段的碱基对数量。结果显示泳道1在1053bp处扩增出一条阳性条带，表示该样品中含有肺炎克雷伯菌；泳道2在1401bp处扩增出一条阳性条带，表示该样品中含有金黄杆菌；泳道6在1053bp和1401bp处同时扩增出两条条带，表示该样品中同时含有金黄杆菌和肺炎克雷伯菌；泳道3、4、5、7、8、9没有扩增出条带，表示该样品为阴性，不含有金黄杆菌和肺炎克雷伯菌。图3的结果说明本申请的引物组具有很好的特异性。

(5)双重PCR方法灵敏性评估

收集1mL经培养12h后的肺炎克雷伯菌和金黄杆菌菌体，按照步骤(2)中进行提取基因组DNA，取1μL DNA点样到超微量紫外分光光度计测定其浓度稀释为100ng/μL，使用去离子水按照10^-1-10^-7进行梯度稀释DNA，以经稀释后的DNA和原液分别作为模板进行PCR扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳和全自动凝胶成像分析仪进行结果判定。

对分离到的肺炎克雷伯菌和金黄杆菌基因组DNA进行浓度调整为60ng/μL，进行3倍梯度稀释分别作为模板，进行双重PCR检测，金黄杆菌和肺炎克雷伯菌双重PCR方法灵敏度评价结果如图4：

其中，M:1kb DNA Marker I(购自鼎国生物技术有限公司)；肺炎克雷伯菌基因组DNA浓度为：1：6×10⁴pg/μL；2:2×10⁴pg/μL；3：6.7×10³pg/μL；4：2.2×10³pg/μL；5：7.3×10²pg/μL；6：2.2×10²pg/μL；7：7.3×10pg/μL；8：3.7×10pg/μLL；9：1.85×10pg/μL；

金黄杆菌基因组DNA浓度为，1：6×104pg/μL；2：2×104pg/μL；3：6.7×103pg/μL；4：2.2×103pg/μL；5：7.3×102pg/μL；6：2.2×102pg/μL；7：7.3×10pg/μL；8：3.7×10pg/μLL；9：1.85×10pg/μL；bp：碱基对；6000、4000、2500、2000、1500、1000、750、500为对应片段的碱基对数量。

结果显示，在泳道5仍然可见两条所述条带，相对应检测最低浓度金黄杆菌为7.3×10²pg/μL、肺炎克雷伯菌为2.2×10²pg/μL。具有较好的灵敏度。

(6)临床病例检测

1)取刚死的病鱼，无菌条件下取一小块鳃丝和肝脏组织，进行彻底剪碎，加入1mL无菌生理盐水，转移到1.5mL离心管中，10，000rpm/min,离心10min，收集上清到另一个新的1.5mL离心管中。

2)将获得的上清进行划线涂LB平板，恒温培养箱中进行过夜培养。

3)将长出的优势单菌落挑取到1mL LB液体培养基中，37℃，220rpm/min，震荡培养8h。

4)提取分离到的菌株基因组DNA，方法参考上述步骤(3)进行。

5)进行PCR检测：

PCR体系如下：10×Buffer 2μL，25mM MgCl₂ 1μL，dNTP Mixture 1μL(10mM),10μM的两组上、下游引物各0.5μL；Taq酶1μL(5U/μL)，提取的细菌基因组DNA各1μL，灭菌水补齐至25μL。

PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性15S，56℃退火30S，72℃延伸1min,30个循环，72℃继续延伸5min，温度降至4℃，进行保存。

PCR扩增产物的电泳：以疑似菌提取基因组DNA作为模板，进行双重PCR，具体的，取5μL PCR产物与1μL 6×Loading buffer进行混匀，加入置于1×TAE电泳缓冲液的1％琼脂糖凝胶上样孔中，进行电泳，95V,时间50min。

4)结果判定

将电泳后的凝胶置于紫外凝胶成像分析仪中进行判定结果，对照核酸的标准分子量标记，如果1053bp处扩增出条带说明该样品中有肺炎克雷伯菌，在1401bp处扩增出条带说明该样品中有金黄杆菌，同时在1053bp和1401bp处扩增出条带说明该样品中有肺炎克雷伯菌和金黄杆菌，反之，如果没有扩增出条带，说明该样品中没有肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的感染。

前述步骤中的PCR检测结果如图5示，对分离到的其中，M：1kb DNA Marker I(购自鼎国生物技术有限公司)；1：阳性对照；2：阴性对照；3-10：为临床分离的8条发病大黄鱼的菌落样品；bp:碱基对；6000、4000、2500、2000、1500、1000、750、500为对应片段的碱基对数量。

结果显示，泳道3代表检测出肺炎克雷伯菌，泳道5代表检测出金黄杆菌，泳道6代表检测出金黄杆菌和肺炎克雷伯菌，泳道8代表检测出肺炎克雷伯菌，其余样品未检测出肺炎克雷伯菌和金黄杆菌。

(7)对临床样品扩增的PCR产物进行测序以验证

将经PCR检测为阳性的临床样本扩增的阳性条带进行凝胶回收，方法参考生工生物有限公司凝胶回收试剂盒说明书进行，将获得的回收产物，送去生工生物公司进行测序，并将测序结果提交至NCBI数据库BLAST在线软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对分析。

图6的结果显示：从样品扩增到的phoE序列与肺炎克雷伯菌株KPN1343chromosome同源性在99％，其中，Klebsiellapneumoniae strain KPN1343 chromosome：NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中肺炎克雷伯菌的参考株KPN1343染色体基因序列；Sequence ID CP033900.1：序列识别号；Length 5276587:序列长度5276587bp；Range 1：1573898 to 1574950：比对的序列长度范围从1573898到1574950；Identities 1052/1053(99％)：共比对了1053bp，其中相同的碱基数为1052bp，所提交的序列与数据库中参考株序列同源性达到99％；Gaps 0/1053(0％)：提交的序列与参考株序列没有碱基缺失。Features:phosphoporinPhoE：该基因特征为外膜磷酸化蛋白基因phoE。Query：需比对的提交序列；Sbjct:经比对后的目标序列。

图7的结果显示：从样品扩增到的OmpA序列与金黄杆菌菌株3008163chromosome同源性在88％，其中，Chryseobacterium sp.3008163 chromosome,complete genome：为NCBI数据库中金黄杆菌参考株3008163染色体基因序列；Sequence ID CP033070.1：序列识别号；Length 4558636:序列长度4558636bp；Range 1：1587878to 1589275：比对的序列长度范围从1587878到1589275；Identities 1229/1403(88％)：共比对了1403bp，其中相同的碱基数为1229bp，所提交的序列与数据库中参考株序列同源性达到88％；Gaps 7/1403(0％)：提交的序列与参考株序列出现7个碱基缺失。Query：需比对的提交序列；Sbjct：经比对后的目标序列。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 台州学院

<120> 同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物、试剂盒及方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

atgaaaaaga gtactctggc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

tcagaactgg taggtcatgc c 21

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

cgcggatcca tgcaagattc aatagcggtg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

ccgctcgagt tatttagctt cgaaataaac 30

Claims

1.同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的特异性引物组，其特征在于，包括：

第一上游引物：5'-ATGAAAAAGAGTACTCTGGC-3'；

第一下游引物：5'-TCAGAACTGGTAGGTCATGCC-3'；

第二上游引物：5'-CGCGGATCCATGCAAGATTCAATAGCGGTG-3'；

第二下游引物：5'-CCGCTCGAGTTATTTAGCTTCGAAATAAAC-3'。

2.同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的特异性引物组、10×Buffer、MgCl₂、dNTP Mixture、Taq酶、灭菌的ddH₂O、阳性对照液和阴性对照液；

第一上游引物和第一下游引物的浓度均为10μM；第二上游引物和第二上游引物的浓度均为10μM。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的10×Buffer为2μL；所述的MgCl₂为1μL 25mM的MgCl₂；所述的dNTP Mixture为1μL，dNTP Mixture的浓度为10mM；所述Taq酶为1μL，Taq酶的酶活为5U/μL；所述的灭菌的ddH₂O为1mL。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液为分别提取的肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的基因组DNA；阴性对照液为灭菌水。

5.非诊断目的的同步检测大黄鱼源肺炎克雷伯菌和金黄杆菌的方法，其特征在于，包括：提取待测样品的DNA，以所提取的DNA为模板、采用如权利要求1所述的特异性引物组进行双重PCR，若扩增结果中同时在1053bp和1401bp处扩增出条带，则判定待测样品中含有肺炎克雷伯菌和金黄杆菌；

所述双重PCR的体系为：

10×Buffer 2μL，25mM MgCl₂1μL，10mM dNTP Mixture1μL，10μM的两组上、下游引物各0.5μL；Taq酶；1μL，Taq酶酶活为5U/μL；DNA模板1μL；灭菌水补齐至25μL；

所述双重PCR的反应条件：95℃预变性3min，95℃变性15S，56℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环，72℃继续延伸5min，温度降至4℃，进行保存。