CN113897442B - 克氏原螯虾中一个抗病基因及其抗病优异单倍型标记的应用 - Google Patents

克氏原螯虾中一个抗病基因及其抗病优异单倍型标记的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物分子标记筛选领域，具体涉及克氏原螯虾中一个抗病基因及其抗病优异单倍型标记的应用。从克氏原螯虾Cluster‑48199(R))基因组中获得一个基因片段，该基因片段全长为559bp；该基因片段即是本发明克隆的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在该基因片段的第335位(C/T)，450位(C/T)和469位(G/A)存在一个等位基因的突变位点。本发明还涉及扩增Cluster‑48199(R)基因的引物组合，和用于检测该分子标记应用的引物组合。本发明利用转录组技术挖掘出克氏原螯虾新的抗病基因，并筛选出其抗病SNP单倍型标记。

Description

克氏原螯虾中一个抗病基因及其抗病优异单倍型标记的应用
技术领域
本发明属于动物分子标记筛选领域，具体涉及克氏原螯虾中一个抗病基因及其抗病优异单倍型标记的应用。
技术背景
克氏原螯虾俗称小龙虾又名红色沼泽螯虾。原产于墨西哥北部和美国南部，隶属于节肢动物门，甲壳纲，软甲亚纲，十足目，螯虾科，原螯虾属。在1918年被引入日本本州地区，20世纪30年代末期引入我国南京。近年来，由于小龙虾极强的环境适应和繁殖能力，数量增长极快，已经在部分湿地中形成了优势种群，并在长江流域广泛存在。
克氏原螯虾肉质鲜美，营养丰富，其肌肉中蛋白质含量极高，而卵黄腺中含有丰富的不饱和脂肪酸、多种游离氨基酸、维生素等，近年来深受年轻人的喜爱。在这种背景下，小龙虾人工养殖的规模不断扩大，带来的经济效益也逐年增加。然而，不断增加的养殖密度，集约化养殖模式的推广使得小龙虾病害频发，带来了巨大的经济损失。由于小龙虾属于低等动物，其体内的免疫调控机制尚不明确，除此之外，对于小龙虾病害种类划分、发病原因、治疗方法的研究也尚处于起步阶段，使得病害防治一直是小龙虾养殖中的关键问题。因此，挖掘新的抗病基因，培育优良的小龙虾抗病品种是现在研究的重点内容。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，是可遗传变异中最常见的一种，它广泛存在于各种生物之中，并且具有很高的遗传稳定性。近年来，利用SNP标记进行品种选育也成为主流的选育手段之一。这一选育方法，在农作物及大型家畜中均已取得了良好的研究成果。然而在水产领域，SNP标记的应用尚处于空白阶段。因此，SNP育种在水产中的应用是现在的研究重点之一。不仅如此，近年来不断发展的测序技术也为SNP育种提供了良好的基础。利用测序技术建立基因库，并以基因库为基础筛选优异抗病等位基因，这种测序技术和SNP标记相互结合的方法为小龙虾抗病品种选育提供了新的思路。
本发明利用克氏原螯虾抗病转录组信息，根据转录组中的差异表达基因信息，筛选出抗病基因，并进一步开发其SNP位点，筛选出一种优异的抗病性状SNP单倍型标记。
发明内容
本发明的目的在于克服克氏原螯虾育种的困难，利用转录组挖掘克氏原螯虾新的抗病基因，并筛选出其抗病SNP单倍型。利用本发明可以提高克氏原螯虾抗病能力，为克氏原螯虾抗病育种提供新的技术方案，对选育克氏原螯虾抗病品种具有着重要意义。
本发明的技术方案如下所述：
一种分子标记在非诊断目的的筛选在克氏原螯虾R基因抗病能力中的应用，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，具体如下所示：
ATGCAGGGGCGGGACTGCCAGGACCCACACTGCACCTGTCGCCGCCACTCCCACACTGCTTACACCTATGCCGATGGCGACAACTCCTCCCTACACACATACACTTCGCTCGAGCCATTTACCCCCCATCATGCACCCTCCCACTTCTCACGCCCCGCGTCCCCTAACAACAATCACTACACCGTTATAGATGCCCCAATCAGGGGAACTGTGCGTACTAGTAAACGTAAAAAAAAGCGGCCTCTCAAACATGTCCACCAACCACAAGAGAAGAGGTTTTCGATAATTCAGGGATCCTACAAGACCTGGCAACCTGCCTCAAACTGACACATTCR(C/T)GACGCACCAAGAGCTTGCGGGTGACACAGCCGGCGGGAGAAAGGCATAGTGACTATTCTACAGACCATTCCAGTGATCGTTCCAGTGGCAGGTCTTTTGACCACTCCGTGAATTR(C/T)TACAGGTAGAGTCACTGGR(G/A)GAAGAGCAGGAACCCAAGAGTACATTGTATACAGGCCTGGTAGACTCTCCGCCAGACCCAGCGCTCACAGCCCAGGAATGTTTCGTCTAG
在该序列的第335位，450位和469位存在一个等位基因的突变。
其中：上述基因片段序列的第335位为R(C/T)，450位为R(C/T),和469位为R(G/A)是突变位点(见图2中的B图)。
一种扩增克氏原螯虾R基因全长序列的引物在筛选克氏原螯虾R基因抗病能力中的应用，所述引物的DNA序列如下所示：
正向引物5‘-TCCCCTCCTCTTCCTCCGTCCT-’3，
反向引物5‘-CCTTTCAGAAGTTGCTGTGGAACCT-’3；
PCR反应体系：10μl 2×PCR Mix，R基因的正、反向引物各1μl，200ng/μl的克氏原螯虾cDNA1μl，加超纯水7μl；
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；4℃保存；将PCR产物进行测序，经过比对后确定克氏原螯虾R基因全长序列，通过NCBI的ORF分析工具确定起始密码子与终止密码子的位置。
一种克氏原螯虾R基因SNP位点的引物在克氏原螯虾R基因抗病能力SNP基因型筛选中的应用，所述引物的DNA序列如下所示：
正向引物R-F：5‘-CTCACCACGCCCTCGGAGAT-’3，
反向引物R-R：5‘-GGCGACTTACAACCAACGGGA-’3；
PCR反应体系：10μl 2×PCR Mix，R基因正、反向引物各1μl，200ng/μl的克氏原螯虾cDNA1μl，加超纯水7μl；
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；4℃保存；将PCR产物进行测序，经过比对后确定克氏原螯虾R基因存在3个SNP位点，所述突变位点分别位于以起始密码子ATG为初始编号序列的第335位，450位和469位的碱基。
申请人提供了克氏原螯虾中一个新的抗病基因及其抗病SNP单倍型的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
(1)对克氏原螯虾接种副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)，具体接种方法如下：使用LB培养基培养副溶血弧菌，使其数量达到108个/毫升，取两毫升菌液，使用离心机在5000×g下离心5min，弃上清，使用1ml ddH2O重悬沉淀。每只克氏原螯虾于第五步足关节处，使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液。
(2)提取每个克氏原螯虾个体的血淋巴RNA，具体步骤如下：
使用1ml注射器从克氏原螯虾虾体内抽取390～400μl(大约400μl)血液样品，按体积比为1：1与抗凝剂(0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖，溶于100ml双蒸水)混合至800μl，置于EP管中，并置于冰上。在800×g，4℃离心20min，分离血细胞；弃上清，保留白色沉淀，加入预冷的Trizol试剂(购自宝生物工程大连有限公司)200μl，使用研磨器研磨至白色沉淀消失，使Trizol溶液(试剂)呈粉色，每个样品再次加入800μl Trizol试剂；在室温下静置5min，然后在4℃，12000×g离心10min；取上清900μl置于新的EP管中，加入200μl氯仿，在振荡条件下充分混匀，不要涡旋震荡，前后晃动15s左右，室温下静置5min；在4℃，12000×g离心10min；离心后溶液呈现三层，用枪头置于液面以下小心吸取上层清液400μl；加入等量异丙醇至400μl，轻柔混匀，在室温下静置5min；在4℃，12000×g，离心15min，直到观察到白色沉淀；去上清，不要吸走沉淀，若无沉淀留少量溶液，加入DEPC水配置的1ml的75％浓度的乙醇，重悬；在4℃，8000×g，离心5min，去上清；吸干溶液，将EP管置于通风橱内晾干2-5min。
(3)将克氏原螯虾RNA送商业测序公司进行转录组数据库建立，并根据VP刺激前后基因的差异表达情况对转录组信息进行分析，筛选出克氏原螯虾差异表达基因(DEGs)。
(4)根据商业测序公司的差异表达基因分析结果，选取表达模式与已知抗病基因相似的DEGs，利用Primer5软件设计qRT-PCR引物对DEGs进行表达量验证。
(5)对克氏原螯虾目的基因进行全长克隆，具体步骤如下：
根据转录组拼接结果，利用Primer5软件设计全长引物，使用PCR方法，扩增克氏原螯虾目的基因全长序列。并将PCR产物送于商业测序公司进行测序，确定序列信息。之后利用NCBI的ORF Finder分析工具进行ORF预测。
(6)对不同克氏原螯虾个体的cDNA样本进行PCR检测，具体步骤为：
利用正向引物(序列见后)和反向引物(序列见后)扩增目的片段，利用琼脂糖凝胶电泳检测片段完整性。PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；于4℃保存。
(7)将PCR产物送商业测序公司(例如上海生工生物科技有限公司)测序，测序公司反馈具体序列信息后，利用软件Sequencher比对各个个体间抗病基因的序列差异，筛选SNP位点。
(8)对每只克氏原螯虾接种抽取500μl血淋巴，然后提取RNA，具体步骤与前面相同。之后对每只克氏原螯虾接种副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)，具体接种步骤如下：
使用LB培养基培养副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)，使其数量达到108个/毫升，取两毫升菌液，使用离心机5000×g离心5min，弃上清，使用1ml ddH2O重悬沉淀。每只克氏原螯虾于第五步足关节处，使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液。
(9)对接种副溶血弧菌后的每只克氏原螯虾进行标记，并记录其死亡时间。
(10)利用上述方法检测每只接种副溶血弧菌后的克氏原螯虾的目的基因基因型，并与存活时间形成对应。根据存活时间筛选不同基因型抗病能力差异。通过归纳和总结，得出抗病能力最强的基因型组合(标记)。
本发明具有以下优点：
(1)本发明筛选出克氏原螯虾新的抗病基因。
(2)本发明筛选出的克氏原螯虾单倍型抗病能力优良，效果稳定。
(3)本发明重复性高，适用范围广。
(4)本发明不依赖基因组信息，可以在转录组层面完成。
附图说明
图1：本发明的转录组差异表达基因分析。附图标记说明，图1中的A图为差异表达基因筛选火山图。分别为：红色表示上调表达基因，绿色表示下调表达基因。图1中的B图为差异表达基因筛选热图。其中红色表示上调表达，蓝色表示下调表达，右侧为具体的基因名称。图1中的C图显示qRT-PCR验证结果。
图2：Cluster-48199(R)基因全长序列和作为分子标记的(R)基因片段。该片段即是本发明的分子标记。附图标记说明：图2中的A图是R基因全长序列。其中：下划线的序列为开放阅读框部分(即CDS)。加粗斜体序列为起始密码子和终止子，黑色方框内为SNP位点；下划线序列字母V后面的*号表示终止。
图2中的B图是突变后R基因片段的核苷酸序列(序列长度为1-559bp),该片段即为本发明克隆所得的的分子标记。该基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示(突变位点显示的是突变后的碱基序列)，在该序列的第335位，450位和469位存在一个等位基因的突变。突变位点以R表示。即：上述基因片段序列的第335位为R(C/T)，450位为R(C/T),和469位为R(G/A)是突变位点。
图3：R基因在克氏原螯虾中的组织特异性表达结果。
图4：R基因的SNP单倍型及其抗病能力分析。附图标记说明，图4中的A图是第一次抗病能力验证结果；图4中的B图是第二次抗病能力验证结果。
具体实施方式
对序列表的说明：
SEQ ID NO:1是本发明克隆的R(即Cluster-48199(R))基因片段，基因片段全长为1-559bp；
其中第335位为(C/T)，450位为(C/T),和469位为R(G/A)是突变位点。
SEQ ID NO:2是扩增Cluster-48199(R)基因全长序列的正向引物。
SEQ ID NO:3是扩增Cluster-48199(R)基因全长序列的反向引物。
SEQ ID NO:4是检测克氏原螯虾R基因SNP位点的正向引物。
SEQ ID NO:5是检测克氏原螯虾R基因SNP位点的反向引物。
实施例1：
根据转录组信息筛选出新的抗病基因，即R基因，并对其SNP单倍型进行抗病能力分析。(1)野生健康小龙虾和VP刺激48h后的小龙虾的血淋巴RNA提取，具体方法如下：
利用LB培养基培养副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)，使其数量达到108个/毫升，取两毫升菌液，使用离心机5000×g离心5min，弃上清，使用1ml ddH2O重悬沉淀。每只克氏原螯虾于第五步足关节处，使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液。野生健康小龙虾注射等体积的ddH2O。于实验室条件下培养48h后提取血淋巴RNA。使用1ml注射器从虾体内抽取390-400μl(大约400μl)血液样品，按体积比为1：1与ACD抗凝剂(配方：0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖，溶于100ml双蒸水)混合至800μl，置于EP管中，并置于冰上。在800×g，4℃，离心20min，分离血细胞；弃上清，保留白色沉淀，加入预冷的Trizol试剂(购自宝生物工程大连有限公司)200μl，使用研磨器研磨至白色沉淀消失，使Trizol试剂溶液呈粉色，每个样品再次加入800μl Trizol试剂；在室温下静置5min，然后在4℃，12000×g离心10min；取上清900μl置于新的EP管中，加入200μl氯仿，在振荡条件下充分混匀，不要涡旋震荡，前后晃动15s左右，室温下静置5；在4℃，12000×g，离心10min；离心后溶液呈现三层，用枪头置于液面以下小心吸取上层清液400μl；加入等量异丙醇至400μl，轻柔混匀，在室温下静置5min；在4℃，12000×g，离心15min，直到观察到白色沉淀；去上清，不要吸走沉淀，若无沉淀留少量溶液，加入DEPC水配置的1ml 75％浓度的乙醇，重悬；在4℃，8000×g，离心5min，去上清；吸干溶液，将EP管置于通风橱内晾干2-5min。
(2)将所得RNA送相关商业测序公司(例如北京诺禾致源生物信息科技有限公司)进行转录组建库，序列拼接及差异表达基因分析。
(3)根据差异表达基因分析结果，筛选出目的基因，筛选结果见图1。
(4)根据转录组拼接结果利用Primer5软件设计表达量验证正向引物RF5‘-CGAGCCATTTACCAGTCCCCAT-’3:,反向引物RR：5‘-ACGTTTACTAGTACGCACAGTTCCCCT-‘3，并进行qRT-PCR表达量验证，验证结果见图1。
(5)根据转录组拼接结果设计全长序列扩增引物OR：5‘-TCCCCTCCTCTTCCTCCGTCCT-’3，反向引物OF：5‘-CCTTTCAGAAGTTGCTGTGGAACCT-‘3来扩增全长片段，利用琼脂糖凝胶电泳检测片段完整性。PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；4℃保存。并根据NCBI数据库中的ORF预测工具预测起始密码子及终止密码子，核苷酸序列信息见图2。
(6)利用之前的qRT-PCR引物对克氏原螯虾各个组织进行组织特异性检测，RNA提取方法与前面相同，cDNA使用天根生化(北京)科技有限公司生产的反转录试剂盒通过反转录方法得到cDNA，具体步骤为：将8μl RNA溶液，2μ5×FastKing-RT SuperMix，10μl ddH2O混合于PCR管中，放入PCR仪。再42℃，15min，随后95℃，3min。组织特异性检测结果见图3。
(7)对不同克氏原螯虾个体的cDNA样本进行PCR检测，具体步骤为：
利用正向引物：5‘-CTCACCACGCCCTCGGAGAT-’3，反向引物：5‘-GGCGACTTACAACCAACGGGA-‘3来扩增目的片段，利用琼脂糖凝胶电泳检测片段的完整性。PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；4℃保存。
(8)将PCR产物送相关商业测序公司(例如上海生工生物科技有限公司)进行测序，测序公司反馈具体序列信息后，利用软件Sequencher比对各个个体间抗病基因的序列差异，筛选SNP位点。筛选结果见表1。
表1R基因SNP分型结果汇总
Figure BDA0003337238410000071
(9)对每只克氏原螯虾接种抽取500μl血淋巴，处理样本共90尾，提取RNA，具体步骤与前面相同。之后对每只克氏原螯虾接种病菌(副溶血弧菌)，具体接种步骤如下：
使用LB培养基培养副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)，本发明简称病菌，使其数量达到108个/毫升，取两毫升副溶血弧菌菌液，使用离心机在5000×g离心5min，弃上清，使用1ml ddH2O重悬沉淀。每只克氏原螯虾于第五步足关节处，使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液。
记录每一只小龙虾存活时间
(10)利用上述步骤检测每只接种病菌(副溶血弧菌)后的克氏原螯螯虾R基因的基因型，并与存活时间形成对应。根据存活时间筛选不同基因型抗病能力差异。抗病试验重复两次，通过归纳和总结，得到抗病能力最强的基因型组合(见图4)。
(11)结果分析：第一次抗病试验中，克氏原螯螯虾的平均存活时间为96-120小时，因此，本发明将克氏原螯螯虾的存活时间小于96小时判定为抗病能力差；将存活时间大于120小时判定为抗病能力强。在第二次抗病试验中平均存活时间为120-240小时，因此，本发明将克氏原螯螯虾的存活时间小于120小时判定为抗病能力差；将存活时间大于240小时判定为抗病能力强。本发明的实施结果显示，拥有单倍型R1基因，即CCA的克氏原螯虾存活时间在两次试验中处于抗病能力强的比例最多，抗病能力最强。因此本发明筛选CCA的R1为单倍型，可以作为克氏原螯螯虾抗副溶血弧菌单倍型有利的标记。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 克氏原螯虾中一个抗病基因的分子标记及在抗病单倍型筛选中的应用
<141> 2021-11-04
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 559
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(559)
<220>
<221> mutation
<222> (469)..(469)
<220>
<221> mutation
<222> (450)..(450)
<220>
<221> mutation
<222> (335)..(335)
<400> 1
atgcaggggc gggactgcca ggacccacac tgcacctgtc gccgccactc ccacactgct 60
tacacctatg ccgatggcga caactcctcc ctacacacat acacttcgct cgagccattt 120
accccccatc atgcaccctc ccacttctca cgccccgcgt cccctaacaa caatcactac 180
accgttatag atgccccaat caggggaact gtgcgtacta gtaaacgtaa aaaaaagcgg 240
cctctcaaac atgtccacca accacaagag aagaggtttt cgataattca gggatcctac 300
aagacctggc aacctgcctc aaactgacac attccgacgc accaagagct tgcgggtgac 360
acagccggcg ggagaaaggc atagtgacta ttctacagac cattccagtg atcgttccag 420
tggcaggtct tttgaccact ccgtgaattc tacaggtaga gtcactgggg aagagcagga 480
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<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 2
tcccctcctc ttcctccgtc ct 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(25)
<400> 3
cctttcagaa gttgctgtgg aacct 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 4
ctcaccacgc cctcggagat 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<400> 5
ggcgacttac aaccaacggg a 21

Claims (1)

1.一种克氏原螯虾R基因SNP分子标记的引物在非治疗和非诊断目的的克氏原螯虾R基因抗病能力SNP基因型筛选中的应用，其特征在于所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所示，在该序列的第335位，450位和469位存在等位基因的突变，其中，第335位为C/T突变，450位为C/T突变和469位为G/A突变；所述引物的核苷酸序列如下所示：
正向引物 R-F：5’-CTCACCACGCCCTCGGAGAT-3’，
反向引物 R-R：5’- GGCGACTTACAACCAACGG GA-3’；
以克氏原螯虾DNA为模板，使用引物在如下PCR反应体系及条件下进行扩增：
PCR反应体系：10μl 2×PCR Mix，R基因正、反向引物各1μl，200ng/μl的克氏原螯虾cDNA 1μl，加超纯水7μl；
PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10 min；4℃保存；
将产物进行测序分析，通过序列比对，确定克氏原螯虾R基因存在三个SNP位点：即第335位存在C/T多态位点，450位存在C/T多态位点和469位存在G/A多态位点；当克氏原螯虾R基因SNP突变位点组合为CCA时，克氏原螯虾对副溶血弧菌具有较强的抗病能力。
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