CN113502337B - 一种提高克氏原螯虾抗病能力的snp分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水产养殖分子标记筛选技术领域。具体涉及一种提高克氏原螯虾抗病能力的SNP分子标记及应用。发明的特征为：分别提取随机收集的克氏原螯虾RNA，通过反转录获得其cDNA。根据克氏原螯虾抗病基因Crustin基因和ALF基因序列设计引物组合，利用引物组合对克氏原螯虾cDNA样本进行PCR扩增并得到目的片段，利用琼脂糖胶电泳检测并确认目的片段被扩增出。进一步通过一代测序手段获得其cDNA序列并进行序列比对，鉴定克氏原螯虾群体中Crustin和AFL基因编码区中的SNP位点，对两基因及其组合进行分型；比较各基因型之间抗病能力的差异，筛选得到抗病能力最强的基因型及其组合标记引物。可用于辅助选择。

Description

一种提高克氏原螯虾抗病能力的SNP分子标记及应用
技术领域
本发明属于水产养殖分子标记筛选的技术领域，具体涉及一种提高克氏原螯虾抗病能力 的SNP分子标记及应用。本发明为克氏原螯虾抗病分子标记的筛选提供了新的资源，应用本 发明可以提高克氏原螯虾种苗抗病的辅助选择，对克氏原螯虾抗病品种或品系的选育具有重 要意义。
背景技术
克氏原螯虾(Procambarus clarkii)又名红色沼泽螯虾(red swamp crayfish)，俗称“小龙 虾”。隶属于节肢动物门，甲壳纲，软甲亚纲，十足目，螯虾科，原螯虾属。原产地位于墨西 哥北部和美国南部，1918年首次被引种于日本本州地区。在20世纪30年代末期引入我国南京， 由于其极强的环境适应能力和繁殖能力，数量增长极快，在几十年内已遍布长江流域，在部 分湿地中已经形成优势种群，成为重要的水产资源。
克氏原螯虾肉质鲜美，营养丰富，其卵黄腺中含有丰富的不饱和脂肪酸，蛋白质，多种 游离氨基酸，维生素等，深受广大人民群众喜爱。近年来，克氏原螯虾养殖量不断增加，尤 其在湖北地区已成为出口创汇的主打产品，带来巨大经济效益。但是，随着养殖量的不断增 加，各种病害也愈加频繁。由于克氏原螯虾的体内免疫调控机制研究尚未完全明确，又缺乏 对克氏原螯虾病原生物潜伏状况，疾病发生和流行条件的研究。使得病害问题一直阻碍着克 氏原螯虾养殖的发展。自19世纪中期欧洲爆发小龙虾瘟疫之后，克氏原螯虾和其病原的相关 研究就已经开始。除此之外，在20世纪90年代初发现了小龙虾病毒的存在，并引起了研究者 的研究兴趣。虽然克氏原螯虾的病原体研究已经有一些历史，但是有关大多数疾病的病原体， 发病条件，传播途径等信息还是相当缺乏。除此之外，传统正向选育方法，在克氏原螯虾抗 病育种中存在着诸多问题，比如，抗病性状难以界定，种质资源难以保存，抗病能力无法稳 定遗传等。因此克氏原螯虾抗病育种推进缓慢。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷 酸变异所引起的DNA序列多态性，是可遗传变异中最常见的一种，它广泛存在于各种生物之 中，并且具有很高的遗传稳定性。近年来，利用SNP进行品种选育也成为主流的选育手段之 一。SNP育种在动植物中均已取得了各类成果(Vignal,Milan,Sancristobal,&Eggen,2002)。而SNP育种的前提条件是已经寻找到功能基因。目前，针对克氏原螯虾抗病基因的研究正在不 断地深入，例如Dai等人发现组织蛋白酶L在克氏原螯虾先天免疫中发挥着重要作用(Dai,Chu, Yu,&Li,2017)。除此之外，各种组学及生物信息学也越来越多地应用于克氏原螯虾抗病的研 究。例如，Zhou等利用转录组测序，测定了副溶血弧菌刺激下克氏原螯虾肝胰腺中的基因表 达变化，得到了克氏原螯虾在病原刺激前后的转录组差异表达基因库(Zhou,Zhao,Huang,Ye, &Du,2020)。因此，不断丰富的抗病功能基因为SNP育种筛选提供了有力的支持。
本发明利用克氏原螯虾中已经验证的抗病基因，进一步开发其SNP位点，筛选出具有优 良抗病性状SNP基因型。本发明涉及的抗病基因属于已经公开基因信息，与他人无关，本发 明涉及的抗病能力较强的SNP基因型为自主开发，与他人无关。
发明内容
本发明的目的在于克服现有克氏原螯虾抗病育种的困难，利用已知抗病基因及SNP相关 实验技术，建立一种抗病基因SNP筛选的方法，利用本发明筛选的SNP位点和基因型组合可 以提高克氏原螯虾抗病能力，为克氏原螯虾抗病育种提供了新的技术方案。
本发明的技术方案如下所述：
一种用于筛选克氏原螯虾Crustin基因SNP位点的引物，所述引物的DNA序列如下所示：
正向引物Cru-F：5‘-GGGGACACACATCCTGAGGACC-3’，和
反向引物Cru-R：5‘-TGAACA AGCGAGCCAACAACC-3’；
PCR反应体系：10μl 2×PCR Mix，Crustin正向引物和反向引物各1μl，克氏原螯虾cDNA (200ng/μl)1μl，超纯水7μl；
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后， 在72℃再延伸10min；4℃保存；将PCR产物进行测序，经过比对后确定克氏原螯虾Crustin基 因存在5个SNP位点，所述位点分别位于以起始密码子ATG为初始编号的第46，67，146，151 和271位碱基。
一种用于筛选克氏原螯虾ALF基因SNP位点的引物，所述引物的DNA序列如下所示：
正向引物ALF-F：5‘-ATGCAGCCGTGCCAGGCTCAGGT-3’，和
反向引物ALF-R：5‘-CTATTGCTTGAGCCAAGCT-3’；
PCR反应体系：10μl 2×PCR Mix，ALF的正向引物和反向引物各1μl，克氏原螯虾cDNA (200ng/μl)1μl，超纯水7μl；
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后， 在72℃再延伸10min；4℃保存；
将PCR产物进行测序，经过比对后确定克氏原螯虾ALF基因存在4个SNP位点，所述位点分别 位于以起始密码子ATG为初始编号的第106，110，149和179位碱基。
本发明提供了一种筛选克氏原螯虾优良抗病能力SNP基因型的方法，所述的方法包括以 下步骤：
(1)分别提取每个个体克氏原螯虾的血淋巴RNA，具体步骤如下所述：
使用1ml注射器从克氏原螯虾虾体内抽取390-400μl血液样品，按体积比为1：1与ACD抗 凝剂，其配方为0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖，溶于100ml双蒸水；混合至400μl， 置于EP管中，并置于冰上；在800×g，4℃，离心20min离心，分离血细胞；弃上清，保留 白色沉淀，加入预冷的Trizol试剂200μl，使用研磨器研磨至白色沉淀消失，使Trizol溶液呈 粉色，每个样品再次加入800μl Trizol试剂；在室温下静置5min，然后在4℃，12000×g离心 10min；取上清900μl置于新的EP管中，加入200μl氯仿，在振荡条件下充分混匀，不要涡旋震 荡，前后晃动15s左右，室温下静置5min；在4℃，12000×g，离心10min；离心后溶液呈现 三层，用枪头置于液面以下小心吸取上层清液400μl；加入等量异丙醇至400μl，轻柔混匀，在 室温下静置5min；在4℃，12000×g，离心15min，直到观察到白色沉淀；去上清，不要吸 走沉淀，若无沉淀留少量溶液，加入DEPC水配置的1ml 75％浓度的乙醇，重悬；在4℃，8000 ×g，离心5min，去上清；吸干溶液，将EP管置于通风橱内晾干2-5min；
(2)使用反转录试剂盒反转录得到cDNA，具体步骤为：
将8μl RNA溶液，2μl 5×FastKing-RT SuperMix，加10μl ddH2O混合于PCR管中，放入PCR 仪，于42℃15min，随后95℃，3min；
(3)设计引物：根据NCBI核酸数据库数据，利用Primer5软件设计下列引物：
Cru-F：5‘-GGGGACACACATCCTGAGGACC-3’，和
Cru-R：5‘-TGAACA AGCGAGCCAACAACC-3’；以及
ALF-F：5‘-ATGCAGCCGTGCCAGGCTCAGGT-3’，和
ALF-R：5‘-CTATTGCTTGAGCCAAGCT-3’；
(4)对不同克氏原螯虾个体的cDNA样本进行PCR检测，具体步骤如下：
利用正向引物Cru-F，反向引物Cru-R，正向引物ALF-F和反向引物ALF-R扩增目的片段， 利用琼脂糖凝胶电泳检测片段完整性；PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退 火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；于4℃保存；
(5)将PCR产物送商业测序公司进行测序，根据商业测序公司反馈的具体序列信息后，利用 软件Sequencher比对克氏原螯虾各个个体间抗病基因的序列差异，筛选得到SNP位点；
(6)参与检测的克氏原螯虾个体数量为176尾，其中雌性克氏原螯虾75尾，雄性克氏原螯虾101尾，经检测确定抗病基因ALF共有4个SNP位点，共2种基因型；经检测确定抗病基因Crustin 共有5个SNP位点，10种基因型，其中四种基因型基因频率极低，故舍弃。
(7)以90只克氏原螯虾为样本，接种抽取500μl血淋巴，提取RNA，之后对每只克氏原螯虾 接种病菌(副溶血弧菌)，具体接种步骤如下：
使用LB培养基培养副溶血弧菌，使其数量达到108个/毫升，取两毫升菌液，使用离心机 以5000×g离心5min，弃上清，使用1ml ddH2O重悬沉淀，在每只克氏原螯虾于第5步足关节处， 使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液；
(8)对接种副溶血弧菌后的每只克氏原螯虾进行标记，并记录其死亡时间；
(9)检测每只接种副溶血弧菌后的克氏原螯螯虾ALF基因和Crustin的基因型，并与存活时间 形成对应；根据存活时间筛选不同基因型抗病能力差异；通过归纳和总结，筛选抗病能力最 强的基因型组合；经过分析得出在两种基因Crustin和ALF的共同作用下拥有基因型 Cru-4-ALF-1的抗病效果为最优。
作为优选方案，本发明筛选目的基因SNP时克氏原螯虾采样量最少为120尾，雌性与雄性 各60尾；验证SNP基因型抗病能力时，克氏原螯虾个体数最少为90尾，雌雄各45尾。
本发明的Crustin基因SNP位点的引物和/或ALF基因SNP位点的引物可在Crustin基因和 ALF基因的抗病基因型分型中的应用。
本发明的筛选方法可在Crustin基因和ALF基因的抗病基因型分型中的应用。
本发明主要解决了以下技术问题：
近年来，我国克氏原螯虾养殖业面临种质退化，个体变小，病害频发等一系列问题。抗 病品系的培育是解决病害问题的关键。为此，筛选出具有优良抗病能力的克氏原螯虾品系是 首要任务。然而，传统育种方法在克氏原螯虾抗病品系筛选中难以实现。本方法能够利用抗 病基因的SNP差异，筛选抗病能力优良的SNP标记组合，进而用于抗病育种。
本发明具有以下优点：
(1)本发明筛选出的克氏原螯虾特定基因SNP基因型抗病能力优良，效果稳定，可用于克氏 原螯虾抗病标记辅助选择上应用。。
(2)本发明的标记重复性高，适用范围广。
(3)本发明不依赖基因组信息，可以在转录组层面完成筛选。
附图说明
图1：本发明克隆的Crustin基因和ALF基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。附图标记说明，图1 中的A图是Crustin基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳胶图；图1中的B图是ALF基因PCR扩增琼脂糖 凝胶电泳胶图；
图2：Crustin基因不同SNP基因型的抗病能力分析；
图3：ALF基因不同SNP基因型的抗病能力分析；
图4：Crustin基因和ALF基因SNP基因型联合分析后的抗病能力分析。
具体实施方式
对序列表的说明
SEQ ID NO：1是筛选克氏原螯虾Crustin基因SNP位点的正向引物Cru-F的DNA序列。
SEQ ID NO：2是筛选克氏原螯虾Crustin基因SNP位点的反向引物Cru-R的DNA序列。
SEQ ID NO：3是筛选克氏原螯虾ALF基因SNP位点的正向引物ALF-F的DNA序列。
SEQ ID NO：4是筛选克氏原螯虾ALF基因SNP位点的反向引物ALF-R的DNA序列。
实施例1：
针对Crustin基因(GQ301202.1)进行SNP位点挖掘及抗病能力分析。SNP位点挖掘共选 取176尾克氏原螯虾。抗病能力分析共选取90尾克氏原螯虾。
(1)分别提取176个个体的血淋巴RNA，具体方法如下：
使用1ml注射器从虾体内抽取390-400μl(大约400μl)血液样品，按体积比为1：1与ACD 抗凝剂(配方为：0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖，溶于100ml双蒸水)混合至400μl， 置于EP管中，并置于冰上。在800×g，4℃，离心20min离心，分离血细胞；弃上清，保留 白色沉淀，加入预冷的Trizol试剂200μl，使用研磨器研磨至白色沉淀消失，使Trizol试剂溶 液呈粉色，每个样品再次加入800μl Trizol试剂；在室温下静置5min，然后在4℃，12000×g 离心10min；取上清900μl置于新的EP管中，加入200μl氯仿，在振荡条件下充分混匀，不要涡 旋震荡，前后晃动15s左右，室温下静置5；在4℃，12000×g，离心10min；离心后溶液呈现 三层，用枪头置于液面以下小心吸取上层清液400μl；加入等量异丙醇至400μl，轻柔混匀，在 室温下静置5min；在4℃，12000×g，离心15min，直到观察到白色沉淀；去上清，不要吸 走沉淀，若无沉淀留少量溶液，加入DEPC水配置的1ml 75％浓度的乙醇，重悬；在4℃，8000 ×g，离心5min，去上清；吸干溶液，将EP管置于通风橱内晾干2-5min。
(2)使用天根生化(北京)科技有限公司生产的反转录试剂盒反转录得到cDNA，具体步骤 为：
将8μl RNA溶液，2μ5×FastKing-RT SuperMix，10μl ddH2O混合于PCR管中，放入PCR 仪。42℃15min随后95℃3min。
(3)设计引物：根据NCBI核酸数据库数据，利用Primer5软件设计正向引物Cru-F：5‘-GGGGACACACATCCTGAGGACC-3’，反向引物Cru-R：5‘-TGAACA AGCGAGCCAACAACC-3’。
(4)对不同克氏原螯虾个体的cDNA样本进行PCR检测，具体步骤为：
利用正向引物Cru-F：5‘-GGGGACACACATCCTGAGGACC-3’，反向引物Cru-R：5‘-TGAACA AGCGAGCCAACAACC-3’来扩增目的片段，利用琼脂糖凝胶电泳检测片段完整性。 PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在 72℃再延伸10min；4℃保存。
(5)将PCR产物送商业测序公司(上海生工生物科技有限公司)进行测序，测序公司反馈具 体序列信息后，利用软件Sequencher比对各个个体间抗病基因的序列差异，筛选SNP位点。
(6)参与检测的克氏原螯虾个体数量为176尾，其中雌性克氏原螯虾75尾，雄性克氏原螯虾 101尾。经检测确定抗病基因Crustin共有5个SNP位点，共十种基因型，其中四种基因型基因 频率极低，故舍弃，详细分型见表1。
表1 Crustin基因SNP分型结果汇总表
Figure BDA0003161455170000061
(7)对每只克氏原螯虾接种抽取500μl血淋巴，共90尾，提取RNA，具体方法与之前相同。
之后对每只克氏原螯虾接种病菌，具体接种方法如下：
使用LB培养基培养副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)，简称病菌，使其数量达 到108个/毫升，取两毫升菌液，使用离心机5000×g离心5min，弃上清，使用1mlddH2O重悬 沉淀。每只克氏原螯虾于第五步足关节处，使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液。
(8)对接种病菌后的每只克氏原螯虾进行标记，并记录其死亡时间(表2)。
表2克氏原螯虾接种副溶血弧菌后单个个体存活时间记录表
Figure BDA0003161455170000062
(9)利用上述方法检测每只接种病菌后的克氏原螯螯虾Crustin基因的基因型，并与存活时间 形成对应。根据存活时间筛选不同基因型抗病能力差异。通过归纳和总结，得到抗病能力最 强的基因型组合(见图2)。
(10)结果分析：在克氏原螯虾中接种病菌后平均存活时间在72小时到108小时之间，因此， 以72小时到108小时为界限，存活时间在72小时之下为抗病能力差；存活时间在108小时以上 为抗病能力强。结果显示在Crustin基因中，拥有基因型Cru-7，CACCA的克氏原螯虾存活时 间为108小时之上的比例最多，抗病能力最强。
实施例2
针对ALF基因(KU680792.1)进行SNP位点挖掘(筛选)及抗病能力分析。SNP位点挖掘共选取176尾克氏原螯虾。抗病能力分析共选取90尾克氏原螯虾。
(1)分别提取176个克氏原螯虾个体的血淋巴RNA，具体步骤如下：
使用1ml注射器从克氏原螯虾虾体内抽取390-400μl(大约400μl)血液样品，按体积比为1： 1与ACD抗凝剂(0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖，溶于100ml双蒸水)混合至400μl， 置于EP管中，并置于冰上。在800×g，4℃，离心20min离心，分离血细胞；弃上清，保留 白色沉淀，加入预冷的Trizol试剂200μl，使用研磨器研磨至白色沉淀消失，使Trizol试剂呈 粉色，每个样品再次加入800μl Trizol试剂；在室温下静置5min，然后在4℃，12000×g离心 10min；取上清900μl置于新的EP管中，加入200μl氯仿，在振荡条件下充分混匀，不要涡旋震 荡，前后晃动15s左右，室温下静置5；在4℃，12000×g，离心10min；离心后溶液呈现三层， 用枪头置于液面以下小心吸取上层清液400μl；加入等量异丙醇至400μl，轻柔混匀，在室温下 静置5min；在4℃，12000×g，离心15min，直到观察到白色沉淀；去上清，不要吸走沉淀， 若无沉淀留少量溶液，加入DEPC水配置的1ml 75％浓度的乙醇，重悬；在4℃，8000×g， 离心5min，去上清；吸干溶液，将EP管置于通风橱内晾干2-5min。
(2)使用天根生化(北京)有限公司的反转录试剂盒通过反转录得到cDNA，具体步骤为：
将8μl RNA溶液，2μ5×FastKing-RT SuperMix，10μl ddH2O混合于PCR管中，放入PCR 仪。42℃15min随后95℃3min。
(3)设计引物：根据NCBI核酸数据库数据，利用Primer5软件设计引物ALF-F,ALF-R。
(4)对不同克氏原螯虾个体的cDNA样本进行PCR检测，具体步骤为：
利用正向引物ALF-F：5‘-ATGCAGCCGTGCCAGGCTCAGGT-3’,反向引物ALF-R：5‘-CTATTGCTTGAGCCAAGCT-3’，扩增目的片段。利用琼脂糖凝胶电泳检测片段完整性。PCR 条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72 ℃再延伸10min；4℃保存。
(5)将PCR产物送到测序公司(上海生工生物科技有限公司)进行测序，公司反馈具体序列 信息后，利用软件Sequencher比对各个个体间抗病基因的序列差异，同时筛选SNP位点。
(6)参与检测的克氏原螯虾个体数量为176尾，其中雌性克氏原螯虾75尾，雄性克氏原螯虾 101尾。经检测确定抗病基因ALF共有4个SNP位点，共2种基因型，详细情况见表3。
表3 ALF基因SNP分型结果汇总表
Figure BDA0003161455170000081
(7)对每只克氏原螯虾接种抽取500μl血淋巴，共90尾，提取RNA，具体方法与之前相同。
之后对每只克氏原螯虾接种副溶血弧菌，具体接种方法如下：
使用LB培养基培养副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)，使其数量达到108个/毫 升，取两毫升菌液，使用离心机5000×g离心5min，弃上清，使用1mlddH2O重悬沉淀。每只 克氏原螯虾于第五步足关节处，使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液。
(8)对接种病菌后的每只克氏原螯虾进行标记，并记录其死亡时间(见表2)。
(9)利用上述方法检测每只接种病菌(副溶血弧菌)后的克氏原螯虾ALF基因的基因型，并 与存活时间形成对应。根据存活时间筛选不同基因型抗病能力差异。通过归纳和总结，得到 抗病能力最强的基因型组合(见图3)。
(10)结果分析：在克氏原螯虾中接种病菌后平均存活时间在72小时到108小时之间，因此， 以72小时到108小时为界限，存活时间在72小时之下为抗病能力差，存活时间在108小时以上 为抗病能力强。结果显示在ALF基因中，拥有基因型ALF-1，ATC-A的克氏原螯虾存活时间108 小时之上的比例最多，抗病能力最强。
实施例3：
针对Crustin基因及ALF基因联合进行SNP位点挖掘及抗病能力分析。SNP位点挖掘共选取 176尾克氏原螯虾。抗病能力分析共选取90尾克氏原螯虾。
将Crustin基因及ALF基因进行联合，进一步分析不同基因型组合的抗病能力差异。
具体步骤如下：
(1)分别提取176个克氏原螯虾个体的血淋巴RNA，具体方法如下：
使用1ml注射器从克氏原螯虾体内抽取390-400μl(大约400μl)血液样品，按体积比为1： 1与ACD抗凝剂(0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖，溶于100ml双蒸水)混合至400μl， 置于EP管中，并置于冰上。在800×g，4℃，离心20min离心，分离血细胞；弃上清，保留 白色沉淀，加入预冷的Trizol试剂200μl，使用研磨器研磨至白色沉淀消失，使Trizol溶液呈 粉色，每个样品再次加入800μl Trizol试剂；在室温下静置5min，然后在4℃，12000×g离心 10min；取上清900μl置于新的EP管中，加入200μl氯仿，在振荡条件下充分混匀，不要涡旋震 荡，前后晃动15s左右，室温下静置5；在4℃，12000×g，离心10min；离心后溶液呈现三层， 用枪头置于液面以下小心吸取上层清液400μl；加入等量异丙醇至400μl，轻柔混匀，在室温下 静置5min；在4℃，12000×g，离心15min，直到观察到白色沉淀；去上清，不要吸走沉淀， 若无沉淀留少量溶液，加入DEPC水配置的1ml 75％浓度的乙醇，重悬；在4℃，8000×g， 离心5min，去上清；吸干溶液，将EP管置于通风橱内晾干2-5min。
(2)使用天根生化(北京)生物科技有限公司审查的反转录试剂盒通过反转录得到cDNA， 具体步骤为：
将8μl RNA溶液，2μ5×FastKing-RT SuperMix，10μl ddH2O混合于PCR管中，放入PCR 仪。42℃15min随后95℃3min。
(3)设计引物：根据NCBI核酸数据库数据，利用Primer5软件设计正向引物Cru-F：5‘-GGGGACACACATCCTGAGGACC-3’，反向引物Cru-R：5‘-TGAACA AGCGAGCCAACAACC-3’。及ALF-F：5‘-ATGCAGCCGTGCCAGGCTCAGGT-3’,ALF-R：5‘- CTATTGCTTGAGCCAAGCT-3’。
(4)对不同克氏原螯虾个体的cDNA样本进行PCR检测，具体步骤为：
利用正向引物ALF-F，和反向引物ALF-R扩增目的片段，利用琼脂糖凝胶电泳检测片段 完整性。PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循 环后，在72℃再延伸10min；4℃保存。
(5)将PCR产物送商业测序公司(上海生工生物科技有限公司)进行测序，公司反馈具体序 列信息后，利用软件Sequencher比对各个个体间抗病基因的序列差异，筛选SNP位点。
(6)参与检测的克氏原螯虾个体数量为176尾，其中雌性克氏原螯虾75尾，雄性克氏原螯虾 101尾。经检测确定抗病基因ALF共有4个SNP位点，共2种基因型。经检测确定抗病基因Crustin 共有5个SNP位点，共十种基因型，其中四种基因型基因频率极低，故舍弃。
(7)对每只克氏原螯虾共90只，接种抽取500μl血淋巴，提取RNA，具体方法与之前相同。
之后对每只克氏原螯虾接种病菌，具体接种方法如下：
使用LB培养基培养副溶血弧菌(VP)，使其数量达到108个/毫升，取两毫升菌液，使用 离心机5000×g离心5min，弃上清，使用1mlddH2O重悬沉淀。每只克氏原螯虾于第五步足关 节处，使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液。
(8)对接种病菌(副溶血弧菌，下同)后的每只克氏原螯虾进行标记，并记录其死亡时间(见 表2)。
(9)利用上述方法检测每只接种病菌后的克氏原螯螯虾ALF基因和Crustin的基因型，并与存 活时间形成对应。根据存活时间筛选不同基因型抗病能力差异。通过归纳和总结，得到抗病 能力最强的基因型组合(见图4)。
(10)结果分析：在克氏原螯虾中接种病菌(副溶血弧菌)后平均存活时间在72小时到108 小时之间，因此，以72小时到108小时为界限，存活时间在72小时之下为抗病能力差，存活时 间在108小时以上为抗病能力强。结果显示在两种基因的共同作用下拥有基因型Cru-4-ALF-1 的抗病效果最优。
主要参考文献：
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序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种提高克氏原螯虾抗病能力的SNP分子标记及应用
<141> 2021-07-13
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 1
ggggacacac atcctgagga cc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<400> 2
tgaacaagcg agccaacaac c 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<400> 3
atgcagccgt gccaggctca ggt 23
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 4
ctattgcttg agccaagct 19

Claims (3)

1.一种筛选克氏原螯虾优良抗病能力SNP基因型的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)分别提取每个个体克氏原螯虾的血淋巴RNA，具体步骤如下所述：
使用1ml注射器从克氏原螯虾虾体内抽取390-400μl血液样品，按体积比为1：1与ACD抗凝剂，其配方为0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖，溶于100ml双蒸水；混合至400μl，置于EP管中，并置于冰上；在800×g，4℃，离心20min离心，分离血细胞；弃上清，保留白色沉淀，加入预冷的Trizol试剂200μl，使用研磨器研磨至白色沉淀消失，使Trizol溶液呈粉色，每个样品再次加入800μl Trizol试剂；在室温下静置5min，然后在4℃，12000×g离心10min；取上清900μl置于新的EP管中，加入200μl氯仿，在振荡条件下充分混匀，不要涡旋震荡，前后晃动15s左右，室温下静置5min；在4℃，12000×g，离心10min；离心后溶液呈现三层，用枪头置于液面以下小心吸取上层清液400μl；加入等量异丙醇至400μl，轻柔混匀，在室温下静置5min；在4℃，12000×g，离心15min，直到观察到白色沉淀；去上清，不要吸走沉淀，若无沉淀留少量溶液，加入DEPC水配置的1ml 75％浓度的乙醇，重悬；在4℃，8000×g，离心5min，去上清；吸干溶液，将EP管置于通风橱内晾干2-5min；
(2)使用反转录试剂盒反转录得到cDNA，具体步骤为：
将8μl RNA溶液，2μl 5×FastKing-RT SuperMix，加10μl ddH2O混合于PCR管中，放入PCR仪，于42℃15min，随后95℃，3min；
(3)设计引物：根据NCBI核酸数据库数据，利用Primer5软件设计引物：
Cru-F：5‘-GGGGACACACATCCTGAGGACC-3’，
Cru-R：5‘-TGAACA AGCGAGCCAACAACC-3’；以及
ALF-F：5‘-ATGCAGCCGTGCCAGGCTCAGGT-3’，
ALF-R：5‘-CTATTGCTTGAGCCAAGCT-3’；
(4)对不同克氏原螯虾个体的cDNA样本进行PCR检测，具体步骤如下：
利用正向引物Cru-F，反向引物Cru-R，正向引物ALF-F和反向引物ALF-R扩增目的片段，利用琼脂糖凝胶电泳检测片段完整性；PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；于4℃保存；
(5)将PCR产物送测序公司进行测序，根据测序公司返回的具体序列信息后，利用软件Sequencher比对各个个体间抗病基因的序列差异，筛选得到SNP位点；
(6)参与检测的克氏原螯虾个体数量为176尾，其中雌性克氏原螯虾75尾，雄性克氏原螯虾101尾，经检测确定抗病基因ALF共有4个SNP位点，共2种基因型；经检测确定抗病基因Crustin共有5个SNP位点，10种基因型，其中四种基因型基因频率极低，故舍弃；
(7)从90只克氏原螯虾为样本，接种抽取500μl血淋巴，提取RNA，之后对每只克氏原螯虾接种病菌副溶血弧菌，具体接种步骤如下：
使用LB培养基培养副溶血弧菌，使其数量达到108个/毫升，取两毫升菌液，使用离心机以5000×g离心5min，弃上清，使用1ml ddH2O重悬沉淀，在每只克氏原螯虾于第5步足关节处，使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液；
(8)对接种副溶血弧菌后的每只克氏原螯虾进行标记，并记录其死亡时间；
(9)检测每只接种副溶血弧菌后的克氏原螯虾ALF基因和Crustin的基因型，并与存活时间形成对应；根据存活时间筛选不同基因型抗病能力差异；通过归纳和总结，筛选抗病能力最强的基因型组合；经过分析得出在两种基因Crustin和ALF的共同作用下拥有基因型Cru-4-ALF-1的抗病效果为最优，所述Cru-4-ALF-1基因为cru基因第46、67、146、151和271位置的碱基依次为T、A、G、T和A，ALT基因第106、110、149、179位置的碱基依次为A、T、C和A。
2.如权利要求1所述的筛选克氏原螯虾优良抗病能力SNP基因型的方法，其特征在于，筛选目的基因SNP时克氏原螯虾采样量最少为120尾，雌性与雄性各60尾；验证SNP基因型抗病能力时，克氏原螯虾个体数最少为90尾，雌雄各45尾。
3.权利要求1所述的方法在Crustin基因和ALF基因的抗病基因型分型中的应用。
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