CN114540509A - 一种凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关snp标记及其应用 - Google Patents

一种凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关snp标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关SNP标记及其应用，属于水产养殖生物技术领域。本发明提供了一种与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关的SNP分子标记，其特征在于，其位于凡纳滨对虾C型凝集素基因序列编码区(SEQIDNO.2)的416bp位点处，突变类型为T/T纯合型、T/A杂合型和A/A纯合型；当变异位点为A/A时，凡纳滨对虾对副溶血弧菌的抗性能力更强。同时提供SNP位点扩增引物，建立凡纳滨对虾抗弧菌性状优良品种分子标记辅助选育体系，能够加快选育抗菌性状优良品种的选育进程。

Description

一种凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关SNP标记及其 应用
技术领域
本发明属于水产养殖生物技术领域，具体涉及一种凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关SNP标记及其应用。
背景技术
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，是世界第一养殖对虾品种。在我国，2020年我国凡纳滨对虾养殖产量186万多吨，占全国对虾年产量的86％，虾苗生产量 15000多亿尾，市场对良种的需求巨大。除北京、吉林、西藏以及青海等地区没有养殖以外，其他省市均有养殖。从种质层面入手，深入发掘和利用凡纳滨对虾的抗菌种质，对于凡纳滨对虾养殖业的健康发展具有重要意义。
近年来，凡纳滨对虾病害的暴发较为频繁，其中弧菌病是对虾养殖过程中最为常见、危害最大的病害。由副溶血弧菌感染引起的“急性肝胰腺坏死综合症(AHPND)”对凡纳滨对虾的养殖造成巨大的损失。AHPND致病质粒具备垂直传播和水平传播的能力，使得凡纳滨对虾AHPND高流行和高暴发。凡纳滨对虾 AHPND从感染到病害暴发迅速，1～3天内病死率达到100％，给养殖生产造成了极大的损失。
C-型凝集素在无脊椎动物先天免疫系统中能够识别入侵病原微生物，激起免疫应答。凝集素可以对病原微生物进行结合、凝集并抑制其生长；同时凝集素也可以与吞噬细胞上的受体结合，增强其吞噬作用。有研究表明，C-型凝集素在凡纳滨对虾中是重要的免疫相关功能基因。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关的SNP标记、扩增引物及其应用，用于凡纳滨对虾抗菌性状优良品种的辅助选育，从而加快凡纳滨对虾抗菌性状优良品种的选育进程。
本发明以副溶血弧菌抗性和易感对虾的基因组为模板，通过PCR扩增和测序来检测凡纳滨对虾C型凝集素基因上的SNP位点的基因型。通过关联分析确定与凡纳滨对虾抗弧菌性状相关的SNP标记，并提供SNP位点扩增引物，建立凡纳滨对虾抗弧菌性状优良品种分子标记辅助选育体系。
本发明第一个目的是提供一种与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关的SNP分子标记，其位于凡纳滨对虾C型凝集素基因序列编码区的416bp位点处，该碱基为T或A，突变类型为T/T纯合型、T/A杂合型和A/A纯合型，所述凡纳滨对虾C型凝集素基因序列编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明第二个目的是提供一种凡纳滨对虾抗副溶血弧菌性状相关的SNP标记的检测引物，包括以下引物：
LvCTL-SNP-F：5’-GTGAGGTCTTGCGCAAATATC-3’，
LvCTL-SNP-R：5’-CCTCGTGTATCTGAATAAGGGC-3’。
本发明第三个目的是提供一种含有上述检测引物的试剂盒。
本发明第四个目的是提供上述的SNP分子标记、检测引物或试剂盒在鉴定或选育抗副溶血弧菌凡纳滨对虾中的应用。
优选地，所述的选育抗副溶血弧菌凡纳滨对虾，包括以下步骤：
a.从凡纳滨对虾亲虾游泳足提取基因组DNA；
b.利用LvCTL-SNP-F和LvCTL-SNP-R引物对分别PCR扩增凡纳滨对虾个体的DNA；
c.对步骤b获得的扩增产物进行测序，确定权利要求1所述的SNP标记的基因型，选择 A/A纯合型的雌虾和雄虾作为亲本，以进行抗副溶血弧菌性状凡纳滨对虾的选育。
更优选地，所述的PCR扩增，其PCR体系及其终浓度组成如下：PCR Buffer 1×、高保真PCR酶0.02U/μL、dNTP Mixture各200μM、MgCl2 2mM、LvCTL-SNP-F 0.2μM、 LvCTL-SNP-R 0.2μM、虾基因组DNA 0.25ng/μL，其余由无菌双蒸水补足至25μL。
更优选地，所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
优选地，使用LvCTL-SNP-F或LvCTL-SNP-R引物对步骤b获得的扩增产物进行测序。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果在于：本发明公开了一种可信的SNP分子标记，当变异位点为A/A时，凡纳滨对虾对副溶血弧菌的抗性能力更强；本发明还提供了用于检测该SNP位点的引物组合及育种方法，在凡纳滨对虾抗弧菌性状品种选育过程中，可以通过该方法对亲本进行筛选，可显著加快选育进程，对提高凡纳滨对虾抗病优良品种的选育有重要指导意义，该方法效率高，操作简单，选育个体基因型稳定且不发生遗传分化。
附图说明
图1为凡纳滨对虾C型凝集素基因SNP位点的T/T纯合型、A/A纯合型和T/A杂合型峰图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
实施例1 SNP分子标记的确定
在湛江某对虾养殖场采集凡纳滨对虾36尾，提取基因组DNA，利用LvCTL-SNP-F和LvCTL-SNP-R引物对进行扩增，具体方法如下：
扩增引物：
LvCTL-SNP-F：5’-GTGAGGTCTTGCGCAAATATC-3’，
LvCTL-SNP-R：5’-CCTCGTGTATCTGAATAAGGGC-3’；
扩增体系：
Figure BDA0003560979940000041
PCR扩增反应程序优选为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸10分钟。使用LvCTL-SNP-F或LvCTL-SNP-R引物对PCR扩增产物进行测序。扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
发现该场所养殖的凡纳滨对虾在凝集素基因编码区416bp位置包含3种突变类型，分别为T/T纯合型、A/A纯合型和T/A杂合型，其测序峰图如图1所示。当该位点为T时，编码蛋白序列第139氨基酸为苯丙氨酸(F)；当该位点为A时，编码蛋白序列第139氨基酸为酪氨酸(Y)。
所述凡纳滨对虾C型凝集素基因的cDNA序列(SEQ ID NO.1)如下所示，其中下划线为编码区序列(SEQ ID NO.2)，加粗大写字母T即为突变位点：
Figure BDA0003560979940000051
实施例2 SNP分子标记的检测与分型
湛江某对虾养殖场取体长5～6cm凡纳滨对虾200尾，用于副溶血弧菌攻毒试验。攻毒试验所用的副溶血弧菌由中国科学院南海海洋研究所从急性肝胰腺坏死综合症凡纳滨对虾肝胰腺分离，于25％甘油-80℃中保存。将副溶血弧菌划线接种于2％TSB固体培养基(1L蒸馏水添加：胰酪蛋白胨17g；大豆蛋白胨3g；D-葡萄糖2.5g；NaCl 5.0g；K2HPO4 2.5g；pH7.3 ±0.2)，30℃培养过夜；挑选单克隆接种于2％TSB液体培养基于30℃振荡培养过夜；将菌液3000rpm离心5分钟，收集扩增的弧菌；将菌液沉淀用预冷的PBS缓冲液重悬，并离心，重复3次；通过分光光度计600nm(OD600)测定重悬液浓度。
将凡纳滨对虾置于1m3黑色大塑料桶中，在30‰盐度30℃条件下暂养2周。将副溶血弧菌菌液倒入暂养凡纳滨对虾的黑色大塑料桶中，将其浓度调整为2.86×105cfu/mL。攻毒过程中每2h观察凡纳滨对虾的死亡情况，及时将死亡的个体收集起来，并浸泡于95％酒精中，共观察1周。将攻毒前2天(48h)内死亡的个体定义为副溶血弧菌易感群体，攻毒7天后仍然存活的个体定义为抗性群体。分别从抗性和易感凡纳滨对虾群体中随机选取36尾，提取基因组DNA，利用实施例1所述的引物LvCTL-SNP-F、LvCTL-SNP-R对副溶血弧菌抗性群体和易感群体进行PCR检测，对C型凝集素SNP标记进行分型，结果如下表所示：
Figure BDA0003560979940000061
从上表可知，大多数抗性组凡纳滨对虾C型凝集素的基因型为A/A，说明A/A基因型的个体抗副溶血弧菌感染的能力更强；易感组C型凝集素的基因型多为T/T，说明T/T基因型的个体更容易感染副溶血弧菌。
实施例3 SNP分子标记在凡纳滨对虾抗副溶血弧菌性状选育中的应用
在湛江某对虾种苗场分别取同批催熟的凡纳滨对虾亲虾游泳足，提取基因组DNA，按照实施例1的方法对亲虾C型凝集素SNP标记的基因型进行分型。挑取T/T纯合基因型和A/A 纯合基因型亲虾各一对分别进行繁育。待子一代全同胞家系稚虾生长至体长3cm，每个家系各取100尾进行副溶血弧菌攻毒实验(方法及步骤同实施例2)。其中，亲本A/A纯合基因型亲虾所产生稚虾存活68尾(68％)；亲本T/T纯合基因型亲虾所产生稚虾存活29尾(29％)。由此可见，该SNP位点为A/A基因型的凡纳滨对虾个体具有较好的抗副溶血弧菌感染能力，而且该性状在后代中能稳定遗传。因此，本发明公开的SNP标记可以用于凡纳滨对虾抗副溶血弧菌性状选育的标记，在选择育种的时候选择A/A纯合基因型的凡纳滨对虾个体作为备选亲本。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关SNP标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 618
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 1
ggtagcgcat aacaactcgc tggccaatat aaagcacagc attgctcttg aaggcaacac 60
aaacgcgcaa aatgatgttc ttcgtgctcc tgctgtcctt cctgccactg ctgacaggct 120
ctctactccc atctcaatca gccaccacac agataacttg tgatgaaggt tttcacaaca 180
tttacgaccg ctgcgtccag ttccgcacgc aggaagtctc gtggcacgag gggaagaacg 240
agtgctttaa catgggggcc gaactagcca aggtcgatga cgcaaacttc atgtactacc 300
tcgtcaagtt catcagaaat aatgggctcg acggtcacaa ttactggatc ggcgcctcag 360
acgaaggcca cgaaggcgac ttcaggtgga cggacgggac ggaggtcaag atggggacgc 420
cgttctgggg cgacagcgaa gaccaggttc aggagcccga cggtggtacc aaccagaact 480
gcgtgttcat ggccagaggc gatcacttct tcttttttga ttatgattgt agccctccac 540
aagccattat ctgtgagaaa tttatgtagt tttagtagag gaataaaaaa ataaattctt 600
aatacaagaa caccgata 618
<210> 2
<211> 498
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 2
atgatgttct tcgtgctcct gctgtccttc ctgccactgc tgacaggctc tctactccca 60
tctcaatcag ccaccacaca gataacttgt gatgaaggtt ttcacaacat ttacgaccgc 120
tgcgtccagt tccgcacgca ggaagtctcg tggcacgagg ggaagaacga gtgctttaac 180
atgggggccg aactagccaa ggtcgatgac gcaaacttca tgtactacct cgtcaagttc 240
atcagaaata atgggctcga cggtcacaat tactggatcg gcgcctcaga cgaaggccac 300
gaaggcgact tcaggtggac ggacgggacg gaggtcaaga tggggacgcc gttctggggc 360
gacagcgaag accaggttca ggagcccgac ggtggtacca accagaactg cgtgttcatg 420
gccagaggcg atcacttctt cttttttgat tatgattgta gccctccaca agccattatc 480
tgtgagaaat ttatgtag 498
<210> 3
<211> 330
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)
<400> 3
gtgaggtctt gcgcaaatat cggtgttctt gtattaagaa tttatttttt tattcctcta 60
ctaaaactac ataaatttct cacagataat ggcttgtgga gggctacaat cataatcaaa 120
aaagaagaag tgatcgcctc tggccatgaa cacgcagttc tggttggtac caccgtcggg 180
ctcctgaacc tggtcttcgc tgtcgcccca gaacggcgtc cccatcttga cctccgtccc 240
gtccgtccac ctgaagtcgc cttcgtggcc ttcgtctgag gcgccgatcc agtaattgtg 300
accgtcgagc ccttattcag atacacgagg 330

Claims (7)

1.一种与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关的SNP分子标记，其特征在于，其位于凡纳滨对虾C型凝集素基因序列编码区的416bp位点处，突变类型为T/T纯合型、T/A杂合型和A/A纯合型；
所述凡纳滨对虾C型凝集素基因序列编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种凡纳滨对虾抗副溶血弧菌性状相关的SNP标记的检测引物，其特征在于，包括以下引物：
LvCTL-SNP-F：5’-GTGAGGTCTTGCGCAAATATC-3’，
LvCTL-SNP-R：5’-CCTCGTGTATCTGAATAAGGGC-3’。
3.一种含有权利要求2所述检测引物的试剂盒。
4.权利要求1所述的SNP分子标记、权利要求2所述的检测引物或权利要求3所述的试剂盒在鉴定或选育抗副溶血弧菌凡纳滨对虾中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的选育抗副溶血弧菌凡纳滨对虾，包括以下步骤：
a.从凡纳滨对虾亲虾游泳足提取基因组DNA；
b.利用LvCTL-SNP-F和LvCTL-SNP-R引物对分别PCR扩增凡纳滨对虾个体的DNA；
c.对步骤b获得的扩增产物进行测序，确定权利要求1所述的SNP标记的基因型，选择A/A纯合型的雌虾和雄虾作为亲本，以进行抗副溶血弧菌性状凡纳滨对虾的选育。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR体系及其终浓度组成如下：PCR Buffer 1×、高保真PCR酶0.02U/μL、dNTP Mixture各200μM、MgCl22 mM、LvCTL-SNP-F 0.2μM、LvCTL-SNP-R 0.2μM、虾基因组DNA 0.25ng/μL，其余由无菌双蒸水补足至25μL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。
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