CN112176081B

CN112176081B - 与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112176081B
Application number: CN202011017981.2A
Authority: CN
Inventors: 刘贤勇; 郝振凯; 索勋; 毕菲菲; 孙霈; 段春慧; 张思新; 胡丹丹; 王思; 汤新明; 于咏兰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2040-09-24
Also published as: CN112176081A

Abstract

本发明涉及球虫耐药性检测技术领域，具体涉及与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记及其应用。本发明提供的SNP分子标记含有如SEQ ID NO.1所示序列第379位多态性为G/C的核苷酸序列。该SNP分子标记可用于区分鉴别癸氧喹酯敏感和耐药的鸡球虫，具有较高的癸氧喹酯耐药性检测准确性，检测结果与笼饲实验一致。本发明还提供SEQ ID NO.16‑17所示的该SNP分子标记的检测引物以及利用该引物结合PCR技术检测鸡球虫癸氧喹酯耐药性的方法。该方法具有检测耗时短、操作简单，检测成本低的优势，可广泛应用于鸡球虫癸氧喹酯耐药性的临床检测。

Description

与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及球虫耐药性检测技术领域，具体涉及与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记及其应用，以及鸡球虫癸氧喹酯耐药性的检测方法。

背景技术

球虫为顶复门、艾美耳属的细胞内寄生虫，能够感染鸡的球虫有7种，包括堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、早熟艾美耳球虫(E.praecox)和柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)。它们在肠道的不同部位繁殖，破坏肠上皮细胞，引起消化吸收功能障碍，导致饲料转化率降低、鸡只生长迟缓等，严重时会造成雏鸡大规模死亡。

抗球虫药物自使用以来，有效降低了由球虫病造成的经济损失，在养鸡集约化和规模化发展过程中起到了十分重要的作用。但由于抗球虫药物的长期使用，导致针对不同抗球虫药物的耐药性球虫的出现，从而使得球虫耐药性成为鸡球虫病防控中不可忽视的重要问题。

癸氧喹酯(Decoquinate)作为一种喹啉衍生物，能够有效地阻止球虫子孢子入侵宿主细胞并且能够抑制第一代裂殖体发育，抗球虫效果显著。同时，该药物还具有低残留、代谢快等特点。然而，在该药物投入使用一段时间后，针对癸氧喹酯的耐药性球虫也不断地被发现。目前对癸氧喹酯耐药性的检测方法仍停留在笼饲实验，虽然这种方法的检测结果较为可靠，但实验耗时长，过程繁琐，影响因素较多，同时需要大量的实验动物和大量具有活力的卵囊。因此，急需开发一种能够快速检测癸氧喹酯耐药鸡球虫的方法，以便更好的指导球虫病用药，降低球虫感染对养殖业造成的经济损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记，本发明的另一目的是提供利用该SNP分子标记检测鸡球虫癸氧喹酯耐药性的方法。

本发明通过对癸氧喹酯耐药的鸡球虫和敏感的鸡球虫的基因组序列进行大量的比对分析，发现了位于细胞色素B基因第379位的SNP位点，该SNP位点为G对应于癸氧喹酯敏感，该SNP位点为C对应于癸氧喹酯耐药。经大量的鸡球虫不同临床耐药虫株的验证，该SNP位点可用于区分鉴别癸氧喹酯耐药的鸡球虫和敏感的鸡球虫，其鉴定结果与笼饲实验的鉴定结果一致。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记，其含有如SEQ ID NO.1所示序列第379位多态性为G/C的核苷酸序列。

以上所述的与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记可为如SEQ ID NO.1所示的DNA片段，SNP位点位于该DNA片段的第379位，多态性为G/C。

以上所述的与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记也可为由SEQ ID NO.2-3或SEQ ID NO.16-17所示引物扩增得到的DNA片段，SNP位点的位置对应于如SEQ ID NO.1所示的DNA片段的第379位，多态性为G/C。

具体地，所述SNP分子标记的多态性位点为G，对应于癸氧喹酯敏感，多态性位点为C，对应于癸氧喹酯耐药。

第二方面，本发明提供用于扩增所述SNP分子标记的引物对，其核苷酸序列如SEQID NO.2-3所示或如SEQ ID NO.16-17所示。

SEQ ID NO.2：Ea.Cob-5:AAACAGATGCCAGGCCAACTGAACTC；

SEQ ID NO.3：Ea.Cob-3:GCGGCAGTTAGAATACTAGAATTC；

SEQ ID NO.16：AAACAGRTGCCAGGCCAACTGAACTC；

SEQ ID NO.17：GCRGCAGTTARDAWAYTAKAATTH。

以上所述的SEQ ID NO.16-17所示的引物为兼并引物(其中，R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T)，可用于检测堆型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、缓艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的SNP分子标记的基因型。

本发明还提供序列如SEQ ID NO.4-15所示的用于扩增所述SNP分子标记的引物对。

以上引物中，SEQ ID NO.2-3可用于检测堆型艾美耳球虫的所述SNP分子标记的基因型，SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.6-7、SEQ ID NO.8-9、SEQ ID NO.10-11、SEQ ID NO.12-13、SEQ ID NO.14-15分别用于检测柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫的所述SNP分子标记的基因型。

本发明还提供含有SEQ ID NO.16-17所示引物对或SEQ ID NO.2-3所示引物对的试剂盒。该试剂盒可用于检测鸡球虫的癸氧喹酯耐药性。

本发明还提供包括SEQ ID NO.4-15所示引物的试剂盒。该试剂盒可用于检测鸡球虫的癸氧喹酯耐药性。

第三方面，本发明提供所述SNP分子标记或所述引物对或所述试剂盒的应用。

具体地，本发明提供所述SNP分子标记或所述引物对或所述试剂盒在检测鸡球虫癸氧喹酯耐药性中的应用。

本发明提供所述SNP分子标记或所述引物对或所述试剂盒在筛选鸡球虫癸氧喹酯耐药性虫株中的应用。

本发明提供所述SNP分子标记或所述引物对或所述试剂盒在指导鸡抗球虫药物使用中的应用。

第四方面，本发明提供一种检测鸡球虫癸氧喹酯耐药性的方法，以待测鸡球虫的DNA为模板，采用SEQ ID NO.2-3所示引物对或SEQ ID NO.16-17所示引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的序列判断鸡球虫是否具有癸氧喹酯耐药性。

以上方法中，PCR扩增的反应程序包括：98℃，30-60s；98℃，15-30s；65℃，20-30s；72℃，25-35s，30-40个循环；72℃，5-10min。

优选采用的PCR扩增的反应程序为：98℃，30s；98℃，15s；65℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，10min。

以上方法中，鸡球虫的DNA可采用常规DNA提取方法得到。

以上方法中，PCR扩增产物的序列可采用测序等本领域常规方法进行分析。

以上方法中，根据PCR扩增产物的序列判断鸡球虫是否具有癸氧喹酯耐药性的方法为：若PCR扩增产物中对应于SEQ ID NO.1所示序列第379位的核苷酸序列为G，则待测鸡球虫为癸氧喹酯敏感虫株，若PCR扩增产物中对应于SEQ ID NO.1所示序列第379位的核苷酸序列为C，则待测鸡球虫为癸氧喹酯耐药虫株。

本发明的有益效果在于：本发明提供的与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记位于鸡球虫细胞色素B基因，该SNP分子标记可用于区分鉴别癸氧喹酯敏感和耐药的鸡球虫，具有较高的癸氧喹酯耐药性检测准确性，检测结果与笼饲实验一致。

本发明提供的鸡球虫癸氧喹酯耐药性检测方法基于分子水平对鸡球虫细胞色素B基因进行特异性扩增，通过检测SNP位点的基因型即可判断鸡球虫是否具有癸氧喹酯耐药性。该方法不需要特殊设备，也不需要大量的实验动物和大量具有活力的卵囊，且不受场地因素的影响，与传统的笼饲实验相比，具有检测耗时短、操作简单，检测成本低的优势，可广泛应用于耐癸氧喹酯的鸡球虫的临床检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中PCR扩增产物的凝胶电泳结果，其中，泳道1为以SEQ IDNO.2-3为引物，以堆型艾美耳球虫基因组为模板的扩增产物；M为DNA marker，AL5000；泳道2为以SEQ ID NO.16-17为引物，以巨型艾美耳球虫基因组为模板的扩增产物；泳道3为以SEQ ID NO.16-17为引物，以堆型艾美耳球虫基因组为模板的扩增产物；泳道4为以SEQ IDNO.16-17为引物，以柔嫩艾美耳球虫基因组为模板的扩增产物。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例使用的pEASY-Blunt Simple Cloning Vector和感受态细胞Trans5α购自北京全式金生物有限公司；DNA分子标准量Marker购自北京艾德莱生物科技有限公司，Q5高保真DAN聚合酶购自NEB公司，TAE缓冲液为按照常规配方配置。以下实施例中使用的仪器设备包括PCR仪、37℃恒温摇床、37℃培养箱、凝胶成像仪、凝胶电泳仪。

实施例1与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记的获得及其检测引物的设计

采集来自山东、云南、四川、内蒙古、湖南等多个不同地区的鸡球虫虫株，经过笼饲试验得到7株癸氧喹酯耐药虫株。但这7株耐药虫株均为混合虫株，为保证后续重测序分析的准确性并降低二代测序的随机误差，采用肠道分离和单卵囊分离技术将癸氧喹酯耐药虫株中的堆型艾美耳球虫分离出来，从而获得癸氧喹酯耐药的堆型艾美耳球虫分离株7株。

在进行高通量测序时，采用100×测序深度，尽可能降低随机引物扩增所引起的随机误差。利用费舍尔精确检验、隐马尔可夫模型等不同的分析策略最大程度地降低测序过程中引入的随机误差对结果的影响。通过SNPs分析最终在测序结果的基础上，将耐药相关基因锁定在细胞色素B(序列如SEQ ID NO.1所示)。为了避免高通量测序的系统误差，采用高保真DNA聚合酶PCR扩增的方法进一步验证细胞色素B基因的突变位点。经过二代大样本量测序并结合高保真DNA聚合酶PCR扩增产物测序，发现癸氧喹酯耐药的堆型艾美耳球虫在细胞色素B基因的379位碱基为C，而敏感虫株为G。

针对上述发现的SNP位点设计扩增引物。本发明在引物设计和筛选过程中发现，由于堆型艾美耳球虫细胞色素B基因(1080bp，登录号：HQ702479.1，SEQ ID NO.1)的两端GC含量过低等原因，针对该位置设计的引物均不能实现高效特异的扩增，因此该区段不适合作为引物扩增的靶序列。本发明采用巢式PCR方法，在细胞色素B基因的上、下游设计引物，经筛选，获得了能够高效特异扩增含有上述SNP位点的DNA片段的引物，并委托北京瑞博兴科生物技术有限公司合成引物，引物序列具体如下表1。

通过对比7种常见鸡球虫线粒体基因组发现，它们的细胞色素B基因保守性很高，本发明在堆型艾美耳球虫的细胞色素B基因扩增引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的基础上，设计其它6种鸡球虫细胞色素B的扩增引物以及7种鸡球虫细胞色素B基因的兼并引物。委托北京瑞博兴科生物技术有限公司合成引物，引物序列具体见表1。

表1 7种鸡球虫细胞色素B基因PCR扩增引物及兼并引物

以堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫的基因组DNA为模板，利用表1中的扩增引物进行PCR扩增，得到表1所示长度的目标片段，其中，部分扩增片段的电泳检测结果如图1所示。

实施例2 SNP分子标记用于检测实验进化体系产生的癸氧喹酯耐药性虫株与其母源虫株差异

利用实施例1获得的SNP分子标记及其扩增引物对实验进化条件下产生的不同遗传背景的3株(豪顿株、新疆株、张家口株)堆型艾美耳球虫癸氧喹酯耐药虫株的癸氧喹酯耐药性进行检测，具体方法如下：

1、实验进化体系诱导产生癸氧喹酯耐药虫株

本实施例采用药物浓度递增的方法诱导产生癸氧喹酯耐药虫株，即先以低于推荐药物剂量开始诱导，然后逐代提高药物剂量，经过多次传代获得耐药虫株。

选取不同遗传背景且对癸氧喹酯敏感的3株堆型艾美耳球虫作为母源虫株，选用7-14日龄无球虫感染的AA肉鸡传代鸡球虫，堆型艾美耳球虫感染剂量为2-5×10⁴个孢子化卵囊/只，接种前48小时在饲料中添加癸氧喹酯，收取接种后4-7天排出粪便中的卵囊。根据相对卵囊产量逐渐提高药物浓度，直至诱导出癸氧喹酯耐药虫株。当药物浓度提高时，若收集不到足以传代的卵囊，则将这些卵囊在无药物选择压力的条件下传代一次。本实施例中，传代药物浓度依次为6mg/kg饲料、12mg/kg饲料、24mg/kg饲料、36mg/kg饲料、54mg/kg饲料和78mg/kg饲料，且仅在药物浓度为36mg/kg饲料时放松选育一代。

2、DNA模板的制备

球虫卵囊纯化后，取适量卵囊并用2mm玻璃珠震碎卵囊壁，用脱囊缓冲液于42℃消化1h，采用血液、细胞、组织DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组，具体方法如下：

取适量消化的子孢子(至少10⁶)加入200μL缓冲液GA，20μL蛋白酶K混匀。56℃放置30min后，加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，加入200μL无水乙醇，充分震荡15s。将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，并重复一次，将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，室温静置数分钟，将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温静置3min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管，放于-20℃冰箱备用。

3、PCR扩增

以步骤1提取得到的基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.2-3所示的引物进行PCR扩增，PCR反应体系及程序如下：

PCR反应体系：上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，dNTP溶液1μL，5×Reactionbuffer溶液10μL，Q5酶0.5μL，用去离子水补足50μL。

PCR反应程序：预变性98℃，时间30s；变性98℃，时间15s；退火温度65℃，时间30s；延伸温度72℃，时间30s；循环35次；最后72℃延伸10min。

4、PCR产物检测及连接转化后测序

PCR产物凝胶电泳检测：配置1.5％凝胶块，130V电压，电泳10min，凝胶成像。PCR产物大小为1181bp。

切取条带后，回收并连接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(购自北京全式金生物有限公司)，而后转化到感受态细胞Trans5α(购自北京全式金生物有限公司)中，涂布到含有20μg/ml的氨苄霉素的培养板中，于37℃培养箱中孵育过夜。挑取单克隆后，进行PCR鉴定，并选取阳性克隆委托北京瑞博兴科生物技术有限公司进行测序。

5、检测结果分析

将步骤3获得的敏感虫株对照与纯种耐药虫株的PCR产物进行序列比对，结果如表2所示。结果显示，敏感虫株的细胞色素B基因的第379位为G，而耐药虫株则为C。将测序后的碱基序列通过软件翻译为氨基酸序列，结果显示，细胞色素B基因的第379位的G突变为C导致第127位氨基酸发生突变，敏感虫株的第127位氨基酸为甘氨酸(G)，耐药虫株则为精氨酸(R)。

表2敏感虫株和耐药虫株的序列比对结果

虫株类型	第379位碱基	第127位氨基酸
			敏感虫株	G	甘氨酸
耐药虫株	C	精氨酸

实施例3 SNP分子标记用于检测田间采集的混合鸡球虫样本的癸氧喹酯耐药性

利用实施例1获得的SNP分子标记及其针对7种鸡球虫的扩增兼并引物(SEQ IDNO.16-17)对采集自不同地区的15株分离虫株的癸氧喹酯耐药性进行检测，具体方法如下：

1、DNA模板的制备

将孢子化后的15株田间混合鸡球虫样品接种于适龄(7-14日龄)的无球虫鸡，接种剂量5×10³-2×10⁴卵囊。收取接种后4-9天粪便中的卵囊。

卵囊孢子化48小时后，进行纯化。将含有卵囊的重铬酸钾倒入干净的离心管中，3600rpm，离心5min，倒出上层液体，用PBS重悬沉淀，重复2-3次；用饱和食盐水重悬沉淀，3600rpm离心5min，将上层含有卵囊的液体导入另一个干净的离心管中，加入5倍体积的PBS，3600rpm离心5min；倒出上清，然后用次氯酸钠溶液重悬沉淀，置于冰上，时间不超过5min为宜，3600rpm离心5min后，吸取上层含有卵囊的液体到另一干净的离心管中，加入5倍体积的PBS离心，重复3-5次，直至无次氯酸钠残留的气味，沉淀即是纯化后的卵囊。

将2mm的玻璃珠用(总体积约为3ml)PBS冲洗2-3遍，并倒入上述卵囊中，在旋涡振荡器上作用5-10min；吸取上层液体并转入干净的EP管中，4℃、12000rpm离心5-10min；弃去上清，加入500ml CTAB溶液和40μL蛋白酶K，55℃作用2小时；待温度降至37℃后，再加入20μL的RNA酶，并于37℃作用30min；待温度降至室温后，加入DNA提取液(酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1)，剧烈震荡30s，然后1000rpm离心5min；弃去上清，加入等体积的异丙醇，-20℃静止30min，然后4℃、12000rpm离心15min；弃去上清，加入1ml浓度为75％的乙醇溶液，离心30s，待乙醇挥发完全后，加入200μL ddH₂O溶解，放入-20℃备用。

2、PCR扩增反应条件及反应体系

PCR扩增引物为SEQ ID NO.16-17，反应体系及程序同实施例2。

3、PCR产物检测及连接转化后测序

PCR产物检测及连接转化后测序方法同实施例2。

4、检测结果分析

将步骤3获得混合虫株的PCR产物进行序列比对，结果如表3所示。结果显示，15株田间分离混合虫株中有3株的细胞色素B基因存在第379位的G到C的突变。

将以上鉴定得到的3株突变型混合虫株和3株野生型混合虫株进行笼饲实验，结果显示，突变型混合虫株具有癸氧喹酯耐药性而野生型混合虫株不具有耐药性，可见SNP分子标记的检测结果与笼饲实验结果一致。由此可见，基于SNP分子标记的PCR检测方法不仅可以用于纯种堆型艾美耳球虫的癸氧喹酯耐药性检测，也可以很好地应用于临床样品(混合虫株)的检测。

表3敏感虫株、耐药虫株和混合群体的序列比对结果

虫株类型	第379位碱基	第127位氨基酸
			敏感虫株	G	甘氨酸
耐药虫株	C	精氨酸
			混合群体	C	精氨酸

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记及其应用

<130> KHP201115141.6

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtctcaag tgagatctca tatacaatca tatccatgtc caacaaatgt gaacttcctt 60

tggaattttg ggttcttatt aggaatctct tttgtagtac aaattgttac aggattacta 120

ctagcatcta gatatactag tgaaatgtca catgcttttg ctagtgtaca acatattatc 180

agagaggtgt ctttcggttg ggaatttaga ttcctacacg ctactggagc atcatgtgtt 240

ttcttatgct tattccttca tattcttaga gctctagtta ttagtagtta tacatactta 300

agtctaacat ggattacagg attaattatt tattttattt ctattgctac aggattctta 360

ggttatgtat taccatgggg tcaaatgagc ttctggggtg ctactgtaat ttgcaatcta 420

ttatcaccaa tcccatacct tgtaacatgg ttactaggag gtttctatgt agacagtcct 480

acattaaaaa gattctttgt actacatttt atattacctt ttgtagctct tgtacttgta 540

gtattacata ttttctattt acacctaaat ggatctagta atccattagg tacagaaact 600

gcattaaaaa taccattcta tcctcatatg ttaagcaccg atggtaaagg atttaattat 660

ctaatcttat tcctattagc ccaatcattc tttggtctaa ttgaattatc tcatccagat 720

aatagtatac ctgtaaatag atttgtaaca ccattacaaa ttgtaccaga gtggtatttc 780

ttagcatatt atgctatctt aaaagttatt ccaagtaaaa ctggaggtct attacttttc 840

gtaggtagta ttctattatt actacttcta agtgaagttc gttcacttac tagtgtaata 900

atcttacgcc aacaattctc ttcaagaaat tgtgcaacat cttggagtat tatatatatt 960

tattcttata ttgctcttat tattgttgga gctcaattac ctcaagaagt atttatttcc 1020

tatggtagat tctttaccgc aatctatctt ttaagtacat ttagcttttt caaactttaa 1080

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaacagatgc caggccaact gaactc 26

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcagcagtta agatactata attc 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacagatgc caggccaact gaactc 26

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggcagtta gaatactaga attc 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacaggtgc caggccaact gaactc 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcagcagtta ggaaactaga attt 24

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaacagatgc caggccaact gaactc 26

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcagcagtta aaatactata attc 24

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacagatgc caggccaact gaactc 26

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcggcagtta gaatattaga attc 24

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacagatgc caggccaact gaactc 26

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcagcagtta gtaaactata atta 24

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaacagatgc caggccaact gaactc 26

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcagcagtta gaatactaga attc 24

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaacagrtgc caggccaact gaactc 26

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcrgcagtta rdawaytaka atth 24

Claims

1.与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记或引物对或含有所述引物对的试剂盒在非疾病诊断目的的检测鸡球虫癸氧喹酯耐药性中的应用；

所述SNP分子标记含有如SEQ ID NO.1所示序列第379位多态性为G/C的核苷酸序列，所述SNP分子标记的多态性位点为G，对应于癸氧喹酯敏感；多态性位点为C，对应于癸氧喹酯耐药；

所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，或者如SEQ ID NO.16-17所示。

2.与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的SNP分子标记或引物对或含有所述引物对的试剂盒在非疾病诊断目的的筛选鸡球虫癸氧喹酯耐药性虫株中的应用；

3.一种非疾病诊断目的的检测鸡球虫癸氧喹酯耐药性的方法，其特征在于，以待测鸡球虫的DNA为模板，采用SEQ ID NO.2-3所示引物对或SEQ ID NO.16-17所示引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的序列判断待测鸡球虫是否具有癸氧喹酯耐药性；

若PCR扩增产物中对应于SEQ ID NO.1所示序列第379位的核苷酸序列为G，则待测球虫为癸氧喹酯敏感虫株，若PCR扩增产物中对应于SEQ ID NO.1所示序列第379位的核苷酸序列为C，则待测球虫为癸氧喹酯耐药虫株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：98℃，30-60s；98℃，15-30s；65℃，20-30s；72℃， 25-35s，30-40个循环；72℃，5-10min。