CN110172521B - 一种鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家禽育种领域，涉及一种鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记及应用。该鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记是鸡白介素8基因5'调控区‑360bp处的SNP突变形成的基因型TT。本发明提供了一种实现在非攻毒条件下对抗性指标的间接选择、提高选择群鸡球虫抗性以及可培育新品种或新品系的鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记及应用。

Description

一种鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记及应用

技术领域

本发明属于家禽育种领域，涉及一种分子标记及应用，尤其涉及一种鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记及应用。

背景技术

鸡球虫病是一种严重危害养殖企业的流行性急性寄生虫病，以10～60日龄的鸡发病率最高，主要特征是患鸡消瘦、食欲下降、贫血和血痢，病愈后鸡生长受阻，增重和产蛋均会受到影响。全世界每年因鸡球虫病造成的经济损失高达30亿美元，而我国每年用于防治鸡球虫病的药物费用也达到了数亿元人民币，占鸡病全部防治费用的近三分之一。

长期以来，鸡的球虫病以药物防制为主，但是如果长期使用一种药物不但会产生鸡机体耐药性的问题，降低药物的防治效果，增加养殖成本。大量研究表明鸡球虫病抗性在同一品种内或不同品种间存在变异性，这给鸡球虫病抗性选择提供了依据。通过大剂量鸡球虫孢子化软囊攻毒可以测定相应的抗性指标，从而实现鸡球虫病常规选育，但攻毒风险大，要有专门的设施条件。所以通过与免疫有关基因分子遗传标记与球虫病抗性间的关系，在非球虫软囊攻毒或感染的情况下通过分子标记辅助选择鸡球虫病抗性个体，方法安全，意义重大。

发明内容

发明目的：为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种实现在非攻毒条件下对抗性指标的间接选择、提高选择群鸡球虫抗性以及可培育新品种或新品系的鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记及应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记，所述鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记是鸡白介素8基因5′调控区-360bp处的SNP突变形成的基因型TT。

如前所记载的鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记在培育鸡柔嫩艾美尔球虫抗病新品种或新品系时的应用。

如前所记载的鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记在提高群体鸡柔嫩艾美尔球虫的抗性时的应用。

一种基于如前所记载的鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记的培育鸡柔嫩艾美尔球虫抗病新品种或新品系的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取试验鸡基因组DNA；

2)设计并合成鸡白介素8基因5′调控区包含-360bp处SNP突变区域的引物对，对步骤1)得到的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

3)将步骤2)得到的扩增产物进行DNA碱基序列测定；

4)根据步骤3)的测序结果，寻找鸡白介素8基因5′调控区-360bp处T→C的突变，确定目标突变位点待测个体的基因型，选择基因型为TT的个体留种繁殖。

作为优选，本发明所采用的步骤2)中的引物对是：

F：AAACCAGCAACACAAAGTC；

R：CATCTCAGCAAGTGCCAAG。

作为优选，本发明所采用的步骤2)中引物对的设计方法是：根据Gen Bank中已公布的鸡白介素8基因序列GeneID396495，使用Primer Premier 5.0对鸡白介素8基因5′调控区包含-360bp处T→C突变在内的长度为576bp区域进行引物设计。

作为优选，本发明所采用的步骤2)中PCR扩增的条件是：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火温度60℃，退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

本发明的原理是：大量研究表明，白介素8(IL-8)是一种趋化性细胞因子，能激活嗜中性粒细胞，诱导中性粒细胞释放溶酶体酶，清除病原菌，IL-8同时也参与免疫反应，实现免疫细胞的抵抗功能，促进伤口愈合。IL-8还能够有效地招募Th1 CD4+、巨噬细胞和单核细胞，进而诱导IFN-γ的产生，从而实现抵抗鸡球虫病的发生。所以白介素8的表达水平与球虫病抗性有关，而白介素8的表达水平又受到其5′调控区的SNP突变的影响，突变能导致与其相结合的转录因子发生改变，从而影响白介素8的表达水平，影响球虫病的抗病性。

有益效果：本发明的优点是：本发明提供了一种鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记及应用，该鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记是鸡白介素8基因5′调控区-360bp处的SNP突变形成的基因型TT或基因型TC，本发明所提供的分子标记选择效果显著，检测方法不需球虫感染或攻毒，且不受外界环境的影响，可以用于京海黄鸡和海扬黄鸡等鸡柔嫩艾美尔球虫抗性分子遗传标记。TT基因型个体超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和一氧化氮(NO)均显著或极显著大于CC基因型。白介素2、白介素6、白介素8和干扰素-γ也是TT基因型显著或极显著大于CC基因型。盲肠病变程度(鸡柔嫩艾美尔球虫主要寄生于小鸡盲肠)和前两类指标反应的抗性一致，TT基因型显著或极显著小于CC基因型。由此可见，T为该位点突变抗性有利基因，TT基因型为抗性有利基因型。本发明针对常规(非球虫攻毒或感染)情况下无法通过测定抗性指标评价个体的抗病性实现抗病育种的现实，通过探明鸡白介素8基因5′调控区-360bp处的SNP突变(T-360C)形成的基因型TT与柔嫩艾美尔球虫攻毒后所选抗性指标的关系，从而实现在非攻毒条件下对抗性指标的间接选择，提高选择群鸡球虫抗性，培育新品种或新品系。

附图说明

图1是PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2是产物DNA测序结果图(左：纯合突变TT基因型，中：杂合突变TC基因型，右：纯合突变CC基因型)；

图3是不同基因型盲肠病变图(左：纯合突变TT基因型，中：杂合突变TC基因型，右：纯合突变CC基因型)。

具体实施方式

本发明所说的方法是：首先提取待测样品基因组DNA；其次是合成1对扩增鸡白介素8基因5′调控区包含-360bp处SNP突变区域的引物，然后采用PCR法扩增待测样品基因组该目的片段；将扩增产物进行DNA碱基序列测定；根据测序结果，寻找IL8基因5′调控区-360bp处T→C的突变，最后确定目标突变位点(-360bp)待测个体的基因型，选择基因型为TT的个体留种繁殖，提高群体鸡柔嫩艾美尔球虫的抗性，培育鸡柔嫩艾美尔球虫抗病新品种或新品系。

实施例一

1、试验鸡处理及DNA抽提

100只15日龄在无球虫的环境下饲养的京海黄鸡经口用灌胃针灌饲经活化的孢子化柔嫩艾美尔球虫，剂量为每只鸡2万个孢子化卵囊，饲养至第5天，翅静脉采集血样1.5mL，肝素钠抗凝，离心(4000rmp)5min，上清液用于抗性指标的测定，-20℃保存。离心后的血细胞用酚氯仿抽提法提取各个体基因组DNA，溶于TE，对基因组DNA进行浓度测定后备用。鸡柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊攻毒后第5天宰杀，观察并记录鸡盲肠病变出血情况，用于后续分析。

2、引物设计及PCR扩增

根据Gen Bank中已公布的鸡IL-8基因序列(GeneID：396495)，使用PrimerPremier5.0对IL-8基因5′调控区包含-360bp处T→C突变在内的长度为576bp区域进行引物设计，引物序列如下：

F：AAACCAGCAACACAAAGTC

R：CATCTCAGCAAGTGCCAAG

然后采用PCR法扩增待测样品基因组该目的片段，PCR反应条件和体系如下：

10μL的2×Taq MasterMix，上下游引物各1μL，个体基因组DNA模板1μL，最后加入水补足至20μL体系。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，引物最佳退火温度60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

3、扩增产物测序

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确认长度正确(见图1)后，送上海生物工程技术服务有限公司进行测序。确定试验鸡个体-360bp处(转录起始点前第360个碱基)SNP突变位点基因型(如图2)，分别为TT、TC和CC三种。

4、SNP突变基因型与血浆抗性指标和盲肠病变计分的关联分析结果

IL-8基因T-360C突变形成3种基因型，分别是TT、TC和CC，用单因子方差分析法统计分析攻毒后第5天各基因型抗性指标间的差异显著性，邓肯氏法进行多重比较，各基因型多重比较结果见表1，由表1可见，在所选的5种与抗应激有关的氧化酶中，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和一氧化氮(NO)三种均是TT基因型显著或极显著大于CC基因型。同时，除了白介素1-β外，其余4种白细胞介素或细胞因子也是TT基因型显著或极显著大于CC基因型。同样，盲肠(鸡柔嫩艾美尔球虫主要寄生于小鸡盲肠)病变计分(分0-5计6个等级，最高得分为5分的个体鸡球虫抗性最差，盲肠布满出血点，反之0分盲肠几乎没有出血点，抗性强)和前两类指标反应的抗性一致，TT基因型显著或极显著小于CC基因型。由此可见，T为该位点突变抗性有利基因，TT基因型为抗性有利基因型。特别是根据盲肠病变计分反应的抗性，是各个体鸡球虫抗性真实水平的反应。三种基因型典型盲肠病变见图3。

表1 IL-8基因T-360C突变位点各基因型与鸡球虫抗性指标关联分析

注：同行比较不同小写字母表示差异显著(P＜0.01)，不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)；相同大写字母表示差异没有达到极显著(P＞0.01)。下同。

实施例二

1、选育基础群-360bp处T→C突变基因型检测

200只海扬黄鸡配套系父本在无球虫的环境中饲养至15日龄，翅静脉采集血样1.0mL，肝素钠抗凝，用酚氯仿抽提法提取各个体基因组DNA，溶于TE，分光光度计进行质量和浓度检测合格的基因组DNA备用。用序列如下：

F：AAACCAGCAACACAAAGTC

R：CATCTCAGCAAGTGCCAAG

的引物进行PCR扩增，PCR反应条件和体系为：10μL的2×Taq Master Mix，上下游引物各1μL，个体基因组DNA模板1μL，最后加入水补足至20μL体系。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，引物最佳退火温度60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

2、鸡球虫抗性群选择

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确认长度正确的扩增产物送测序公司测序，选留-360bp处T→C突变形成的基因型为TT的个体组成鸡柔嫩艾美尔球虫病抗性选择群，计69只，其余个体为淘汰群，计131只。

3、选择群和淘汰群鸡球虫抗性比较

选择群和淘汰群海扬黄鸡父本200只，用柔嫩艾美尔孢子化卵囊攻毒，每只鸡灌胃针嗉囊灌服2万个孢子化软囊，5天后解剖观察TT基因型选择群和CC基因型淘汰群盲肠病变，并记录各个体的盲肠病变计分(具体结果参见表2)，选择群平均盲肠病变计分为2.01±0.19，淘汰群为3.98±0.42，淘汰群盲肠上皮的损伤几乎是选择群的2倍。

表2 IL-8基因T-360C突变位点TT基因型选择效果

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaccagcaa cacaaagtc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catctcagca agtgccaag 19

Claims (3)

1.一种基于鸡柔嫩艾美尔球虫抗性间接选择的分子标记培育鸡柔嫩艾美尔球虫抗病新品种或新品系的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1）提取试验鸡基因组DNA；

2）设计并合成鸡白介素8基因5'调控区包含-360bp处SNP突变区域的引物对，对步骤1）得到的基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

3）将步骤2）得到的扩增产物进行DNA碱基序列测定；

4）根据步骤3）的测序结果，寻找鸡白介素8基因5'调控区-360 bp处T→C的突变，确定目标突变位点待测个体的基因型，选择基因型为TT的个体留种繁殖；

所述步骤2）中的引物对是： F：AAACCAGCAACACAAAGTC； R：CATCTCAGCAAGTGCCAAG。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中引物对的设计方法是：根据Gen Bank中已公布的鸡白介素8基因序列GeneID396495，使用Primer Premier 5.0对鸡白介素8基因5'调控区包含-360bp处T→C突变在内的长度为576 bp区域进行引物设计。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中PCR扩增的条件是：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，退火温度60℃，退火30s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

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